腎康注射液對高血壓腎損害大鼠血壓及相關指標的影響

周 楠，呂延英，王紅英，王俊平，王光建，趙 興，楊 健，賀建宇

(1.西安交通大學藥學院，陜西西安 710061；2. 西安世紀盛康藥業(yè)有限公司，陜西西安 710300； 3. 武警總部機關門診部防疫科，北京 100089)

◇中醫(yī)藥研究◇

腎康注射液對高血壓腎損害大鼠血壓及相關指標的影響

周 楠1，呂延英2，王紅英1，王俊平2，王光建2，趙 興2，楊 健3，賀建宇1

(1.西安交通大學藥學院，陜西西安 710061；2. 西安世紀盛康藥業(yè)有限公司，陜西西安 710300； 3. 武警總部機關門診部防疫科，北京 100089)

目的 探討腎康注射液對高血壓腎損傷大鼠血壓及相關指標的影響。方法 將32只高血壓腎損傷模型大鼠隨機分為4組：模型對照組(即SHR組)、陽性對照組、腎康注射液大劑量組、腎康注射液小劑量組；WKY大鼠作為陰性對照組。陽性對照組腹腔注射給予福辛普利鈉1.6 mg/kg，腎康注射液大小劑量組分別腹腔注射腎康注射液，相當于生藥劑量為4.8、2.4 g/kg，陰性對照組和模型組腹腔分別注射等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)給藥30 d。末次給藥后檢測高血壓腎損傷大鼠的血壓、心臟病變以及NO、Ang-Ⅱ、C反應蛋白、TGF-β1等指標。結果 給藥前后各組間大鼠體質(zhì)量無明顯差異(P>0.05)；給藥后腎康注射液組的血壓值明顯低于模型對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)；與模型對照組比較，腎康注射液組的NO活性明顯增高，腎臟皮質(zhì)中的Ang-Ⅱ明顯降低，C反應蛋白明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；但血清中的Ang-Ⅱ、血清轉化因子TGF-β1無顯著性差異(P>0.05)。結論 腎康注射液能降低高血壓腎損傷大鼠血壓、提高腎組織的NO活性、降低Ang-Ⅱ及C反應蛋白的含量。

腎康注射液；高血壓腎損害；血壓；NO；Ang-Ⅱ；C反應蛋白；TGF-β1

高血壓病的發(fā)病與腎臟的關系是十分密切的。腎臟既是血壓調(diào)節(jié)的重要器官，同時又是高血壓損害的主要靶器官之一。一方面，腎臟通過改變對水鈉代謝的調(diào)節(jié)以及分泌加壓和降壓物質(zhì)，從多方面影響血壓，另一方面，高血壓又可造成腎臟功能受損，若高血壓一旦對腎臟造成損害，又可以因腎臟對體液平衡調(diào)節(jié)以及血管活性物質(zhì)等代謝障礙，加劇了高血壓的嚴重程度，并最終導致腎功能不全[1]。

腎康注射液是具有降逆泄?jié)?、益氣活血作用的中藥復方制劑，目前的藥理實驗研究表明，腎康注射液具有顯著降低5/6腎切除大鼠的血壓、尿蛋白的排泄、改善高血脂及腎功能的作用[2]，腎康注射液可通過抑制糖尿病腎病大鼠腎組織炎癥因子NF-κB表達，從而減輕腎臟損傷的程度[3]。臨床研究表明，腎康注射液可以化瘀祛濁，使腎單位、腎小管更新，慢性腎功能衰竭進程得以逆轉，達到改善臨床癥狀的療效[4]?；谝陨涎芯勘尘昂团R床應用情況，本研究旨在探明腎康注射液治療高血壓腎病的作用機制。探討其對高血壓腎病大鼠血壓及其相關指標的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器 腎康注射液(西安世紀盛康藥業(yè)有限公司，批號：201107043、201108022)；福辛普利鈉片(中美上海施貴寶制藥有限公司，規(guī)格：10 mg/片，批號：1007090)；一氧化氮試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20120115)；BCA試劑盒(北京普利萊基因技術有限公司)；血管緊張素-Ⅱ酶聯(lián)免疫試劑盒、C反應蛋白酶聯(lián)免疫試劑盒、血清轉化因子TGF-β1酶聯(lián)免疫試劑盒(北京科盈美科技有限公司)；美國肯特CODA多動物多通道尾袖套法無創(chuàng)血壓系統(tǒng)；低速離心機(GENIUS 5K-R，長沙鑫奧儀器儀表有限公司)；高速勻漿器(IKA-T10，德國IKA集團)；電子天平(AY120，日本島津SHIMADZU)。

1.2 實驗動物 30周齡，體質(zhì)量340～400 g，清潔級雄性SHR大鼠32只，同齡WKY大鼠10只，均購于上海斯萊克實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2007～0005。動物常規(guī)飼養(yǎng)，保持室溫20～25 ℃，12 h光照與黑暗交替(光照8∶00～20∶00)，自由飲水和攝食。飼養(yǎng)1周后，測定SHR大鼠尿微量白蛋白的含量，達到腎損傷標準20～200 mg/L[5]即為高血壓腎病模型大鼠，用于本實驗。

1.3 分組與給藥 將32只高血壓腎病模型大鼠隨機分為4組：模型對照組(即SHR組)、陽性對照組、腎康注射液大劑量組、腎康注射液小劑量組；WKY大鼠作為陰性對照組。陽性對照組腹腔注射給予福辛普利鈉1.6 mg/kg，腎康注射液大小劑量組腹腔分別注射給予腎康注射液，相當于生藥劑量為4.8、2.4 g/kg(分別相當于人用量的8倍、4倍)，陰性對照組和模型組腹腔分別注射等體積生理鹽水10 mL/kg，每天1次，連續(xù)給藥30 d后，10 g/L水合氯醛麻醉大鼠，腹主動脈取血，取心臟、腎臟。

1.4 尾動脈血壓的測量 給藥第0、1、2、3、4周測定大鼠的血壓值，采用尾動脈測壓法用肯特無創(chuàng)測壓系統(tǒng)測定大鼠的收縮壓及舒張壓，預熱溫度37 ℃，預熱15 min，每周測定1～2次，并根據(jù)結果調(diào)整測量次數(shù)[6]。

1.5 心臟臟器系數(shù)及左心室指數(shù)的計算 稱量體質(zhì)量后打開胸腔取出心臟，以預冷的Hanks液充分灌洗，濾紙吸干，稱量心臟及左心室質(zhì)量。

1.6 一氧化氮(NO)的檢測 取0.5 g腎臟皮質(zhì)組織，用冰冷的生理鹽水沖洗，除去血液，擦干，稱取0.2 g放入燒杯中，剪碎，制成10%勻漿后，在3 000～4 000 r/min離心10～15 min，上清液即為組織勻漿液，取組織勻漿液用NO含量測定試劑盒測定腎組織中NO活性。

1.7 血管緊張素-Ⅱ(Ang-Ⅱ)的檢測 實驗結束后，取靜脈血1 mL及腎臟皮質(zhì)勻漿，離心后取上清，用Ang-Ⅱ試劑盒(免疫酶聯(lián)法)測定血漿及腎臟Ang-Ⅱ含量。

1.8 C反應蛋白的檢測 實驗結束后，取靜脈血1 mL，離心后取上清用C反應蛋白檢測試劑盒(免疫酶聯(lián)法)測定C反應蛋白活力。

1.9 血清轉化因子TGF-β1的檢測 實驗結束后，取靜脈血1 mL，離心后取上清，用TGF-β1試劑盒(免疫酶聯(lián)法)測定血漿TGF-β1含量。

1.10 腎臟的Masson染色 實驗結束后，取大鼠腎臟，進行Masson三色染色，觀察腎臟的纖維化水平。

2 結 果

2.1 給藥期間大鼠體質(zhì)量的變化 給藥前各組大鼠體質(zhì)量無明顯差異，給藥后各組大鼠體質(zhì)量呈現(xiàn)先增加后又略微下降的趨勢，各組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表1)。

表1 腎康注射液對大鼠體質(zhì)量的影響

組別例數(shù)給藥前給藥1周給藥2周給藥3周給藥4周陰性對照組10386.10±32.74401.60±30.94392.60±35.82395.40±27.23398.50±30.20模型對照組8402.25±11.07420.38±12.81426.25±12.35415.25±14.29414.75±13.31福辛普利對照組8379.88±21.44400.75±28.11398.25±25.08397.75±24.18392.25±34.70腎康注射液小劑量組8382.75±29.85398.88±34.29397.88±34.39399.12±35.75399.38±32.20腎康注射液大劑量組8384.88±13.06406.88±14.34397.75±16.07399.00±22.49400.75±12.52

各組間比較，顯示無統(tǒng)計學意義。

2.2 給藥期間大鼠收縮壓的變化 給藥前測定各組大鼠的基礎血壓，模型對照組及其他各組的血壓值明顯高于陰性對照組，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；隨著給藥的進行，陽性藥對照組、腎康注射液小及大劑量組的血壓值開始明顯低于模型對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)，而陰性對照組的血壓值恒定，且顯著低于其他各實驗組(表2、3)。

2.3 對心臟及左心室指數(shù)的影響 給藥后，各組的心臟質(zhì)量、心臟臟器系數(shù)、左心室質(zhì)量、左心室指數(shù)等指標均無顯著性差異(P>0.05，表4)。

表2 腎康注射液對大鼠收縮壓的影響

組別例數(shù)0周1周2周3周4周陰性對照組10145.85±12.98**147.12±8.46**142.5±19.40**134.4±16.11**136.22±16.91**模型對照組8215.75±20.33220.12±19.20219.88±14.60224.5±17.19221.62±23.12福辛普利對照組8210.52±24.44206.62±17.70*192.57±12.08*195.33±17.75*198.38±22.95*腎康注射液小劑量組8216.55±20.33182.5±25.58*210.62±16.20*198.62±15.68*209.28±19.39*腎康注射液大劑量組8213.34±12.15156.22±25.10**194.62±25.11*207.12±10.66*195.33±13.17*

與模型對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

表3 腎康注射液對大鼠舒張壓的影響

組別例數(shù)0周1周2周3周4周陰性對照組1091.10±13.13**107.00±14.21**87.00±17.02**79.80±14.33**83.55±20.50**模型對照組8173.12±19.59164.00±14.57163.00±12.60170.37±20.61165.34±19.80福辛普利對照組8162.75±20.20151.75±17.89*159.00±19.83164.12±16.71158.38±20.35*腎康注射液小劑量組8162.89±21.89145.34±17.84*142.01±16.64*134.57±27.73*158.57±17.83*腎康注射液大劑量組8165.12±15.49130.12±21.94**140.25±19.28*147.75±12.76*147.16±11.54*

與模型對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

表4 腎康注射液對心臟及左心室指數(shù)的影響

組別例數(shù)心臟質(zhì)量(g)心臟臟器系數(shù)(g/kg)左心室質(zhì)量(g)左心室指數(shù)(g/g)陰性對照組101.26±0.343.7±0.0420.85±0.180.68±0.03模型對照組81.55±0.173.8±0.0281.08±0.080.70±0.04福辛普利對照組81.46±0.083.6±0.0281.06±0.070.72±0.04腎康注射液小劑量組81.40±0.143.6±0.0201.01±0.100.72±0.02腎康注射液大劑量組81.38±0.083.2±0.0751.00±0.070.72±0.04

各組間比較，顯示無統(tǒng)計學意義。

2.4 對腎臟組織中NO活性的影響 與陰性對照組比較，模型對照組NO活性明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與模型對照組比較，腎康注射液小、大劑量組的NO活性明顯增高，并差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而陽性對照組的NO活性有增高的趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表5)。

2.5 對各組Ang-Ⅱ的影響 腎臟皮質(zhì)中Ang-Ⅱ含量，與模型對照組比較，陰性對照組、腎康注射液小、大劑量組及陽性對照組的Ang-Ⅱ明顯降低，并差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。血清中的Ang-Ⅱ，與模型對照組比較，也只有陽性對照組的Ang-Ⅱ明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表6)。

表5 腎康注射液對NO活性的影響

組別例數(shù)NO(μmol/gprot)陰性對照組107.14±1.18**模型對照組85.58±1.84福辛普利對照組86.42±2.12腎康注射液小劑量組87.74±2.50**腎康注射液大劑量組87.51±1.75**

與模型對照組比較，**P<0.01。

表6 腎康注射液對腎臟及血清Ang-Ⅱ的影響

組別例數(shù)腎臟血清陰性對照組10118.80±11.08*71.64±11.29模型對照組8124.73±19.2867.50±12.38福辛普利對照組8116.03±9.27*84.63±30.67*腎康注射液小劑量組8119.04±13.48*62.80±7.21腎康注射液大劑量組8104.53±19.76*77.05±8.40

與模型對照組比較，*P<0.05。

2.6 對各組C反應蛋白及血清轉化因子TGF-β1的影響 與陰性對照組比較，模型對照組的C反應蛋白明顯增高，并有統(tǒng)計差異(P<0.05)；與模型對照組比較，腎康注射液小、大劑量組及陽性對照組的C反應蛋白明顯降低，并且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。各組的血清轉化因子TGF-β1的值比較差異無統(tǒng)計學意義(表7)。

2.7 對各組腎臟的纖維化的影響 對各組的腎臟進行Masson染色的結果可以看出，模型組的腎間質(zhì)存在嚴重纖維化，福辛普利及腎康小劑量組的纖維化程度較為緩解，腎康注射液大劑量組能夠很好地抑制腎臟的纖維化，與陰性對照組沒有明顯差別(圖1)。

表7 腎康注射液對血漿炎癥因子C反應蛋白及血清轉化因子TGF-β1的影響

組別例數(shù)C反應蛋白(μg/L)TGF-β1(ng/L)陰性對照組10402.25±36.12*97.75±9.27模型對照組8449.29±27.6994.91±16.15福辛普利對照組8385.65±27.04*97.45±19.43腎康注射液小劑量組8394.25±35.46*96.59±16.17腎康注射液大劑量組8412.81±24.76*92.05±9.82

與模型對照組比較，*P<0.05。

圖1 各組腎臟內(nèi)纖維化程度的比較

Fig.1 Comparison of renal fibrosis in the five groups

A：陰性對照組；B：模型對照組；C：福辛普利組；D：腎康注射液小劑量組；E：腎康注射液大劑量組。

3 討 論

腎康注射液是一種中藥注射液，主要藥材為大黃、丹參、紅花和黃芪，文獻表明大黃具有促進尿素及肌酐排泄的作用，并具有抑制系膜細胞增殖的作用[7-8]，紅花為菊科植物，具有活血化瘀、抗血凝、調(diào)經(jīng)等功效[9]。近代中藥藥理學研究表明：紅花具有使緊張度增高的動物離體血管擴張的作用，對于延緩腎臟病損傷具有明顯的作用[10]。丹參是心血管疾病的常用中藥，可以緩解大鼠的腎衰竭，具有防止腎小球的硬化和保護腎功能的作用[11]。本研究對腎康注射液的降壓作用做了進一步地探討。給予受試藥物后，高血壓大鼠的血壓雖然仍存在繼續(xù)上升的趨勢，但陽性對照藥及腎康注射液組的大鼠血壓上升值遠小于模型對照組，說明腎康注射液可降低高血壓腎病大鼠的血壓，對腎臟起到了一定的保護作用。研究表明，內(nèi)源性NO合成不足可以導致腎小球灌注壓下降，介導腎小管壞死，提高NO濃度可降低腎血管阻力，抑制腎小球內(nèi)血小板聚集和粘附，因而任何導致NO合成減少的因素均可誘發(fā)或加劇急性腎功能不全的發(fā)生和發(fā)展[12]。在本實驗中，給藥結束后，測定各組大鼠腎臟皮質(zhì)中NO活性，陽性對照藥及腎康注射液組的NO活性遠高于模型對照組，說明腎康注射液可以一定程度上阻止腎損傷，降壓作用也可能通過了NO途徑[13]。

RAS是機體內(nèi)調(diào)節(jié)血壓和體液容積的重要因素之一。Ang-Ⅱ是RAS最主要的生物活性物質(zhì)。腎臟是Ang-Ⅱ重要的分泌器官和靶器官[14]，并且Ang-Ⅱ參與調(diào)控高血壓引起的左心室肥大及慢性腎臟疾病[15-17]。TGF-β1是一種多功能生長因子，參與了原發(fā)性高血壓的血管肥厚、腎臟纖維化等過程。WILLIAMS等[18]認為，Ang-Ⅱ誘發(fā)高血壓腎臟纖維化加重高血壓腎病的作用可能是通過TGF-β1實現(xiàn)的。本研究用ELISA法測定腎臟及血清中的Ang-Ⅱ的水平，結果表明給予腎康注射液后，腎臟的Ang-Ⅱ水平明顯低于模型對照組，而對血清中的Ang-Ⅱ作用不明顯。此外，本研究結果還顯示，給予腎康注射液后，C反應蛋白明顯下降，說明腎康注射液起到了一定的作用，降低了相關的炎癥因子，而各組的血清轉化因子TGF-β1的值有一定的差異，但不能完全說明給藥起到了明顯的作用。另外，腎臟的MASSON病理切片結果說明了腎康注射液對高血壓大鼠腎臟纖維化有抑制作用。

本實驗還對高血壓的另一個重要靶器官——心臟的質(zhì)量及心臟指數(shù)進行了研究，結果各給藥組間無顯著性差異，各組大鼠的心臟臟器系數(shù)及左心室指數(shù)也無明顯差異，可能由于初期高血壓腎病大鼠心臟尚未出現(xiàn)顯著病變。

腎損害是原發(fā)性高血壓的嚴重并發(fā)癥之一，兩者關系密切，互為因果，常形成惡性循環(huán)。本課題進一步研究了腎康注射液對高血壓腎病的降壓作用，以期用現(xiàn)代分析技術及藥理學方法闡釋其作用功效及可能的機制，為高血壓腎病的治療探尋新的治療藥物。

[1] 林善錟. 腎臟與高血壓[J]. 中華內(nèi)科雜志, 1996, 35(2):139-141.

[2] 趙宗江，張新雪，師鎖柱，等. 腎康注射液延緩5/6腎切除大鼠慢性腎功能衰竭進展的機理探討[J]. 中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志, 2000, 6(10):16-19.

[3] 吳應龍，應素萍. 腎康注射液對糖尿病腎病大鼠腎組織NF-κB的實驗研究[J]. 中國中西醫(yī)結合腎病雜志, 2008, 9(9):827-829.

[4] 范文延. 腎康注射液治療慢性腎功能衰竭臨床對照研究[J]. 醫(yī)藥論壇雜志, 2008, 29(7):33-35.

[5] 徐叔云，卞如濂，陳修. 藥理實驗方法學[M]. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2002:1134-1136.

[6] 李春梅，錢艷芳. 間接法與直接法測定大鼠動脈血壓的比較研究[J]. 山西醫(yī)科大學學報, 2002, 33(3):278-279.

[7] 肖煒，鄧虹珠，馬云. 大黃治療慢性腎功能衰竭的臨床與實驗研究概述[J]. 中國中藥雜志, 2002, 27(4):241-244.

[8] 肖煒，馬云，魏連波，等. 黃芪、大黃復方制劑對培養(yǎng)大鼠系膜細胞增殖和細胞外基質(zhì)分泌的影響[J]. 中國臨床康復, 2006, 10(11):173-176.

[9] 許慶友，丁英鈞，韓琳，等. 梗阻性腎病大鼠腎臟腎上腺髓質(zhì)素的表達及纈沙坦、紅花對其的影響[J]. 中國藥理學通報, 2007, 23(2):158-161.

[10] 陳蓁，王銳平，賀浪沖. 細胞膜色譜法篩選紅花中的有效成分[J]. 陜西中醫(yī), 2004, 25(7):643-644.

[11] 劉久波，呂軍，張珍，等. 銀杏葉制劑和丹參對急性腎衰兔腎皮質(zhì)局部血流量的影響[J]. 中國微循環(huán), 2004, 8(3):149-151.

[12] 唐錦輝，徐欽儒. 一氧化氮與腎臟疾病研究進展[J]. 國外醫(yī)學, 1996, 16(5):216-219.

[13] 吳延慶，鄒斌，程曉曙，等. 腎內(nèi)血管緊張素系統(tǒng)在NO缺乏性高血壓腎損害的作用[J]. 嶺南心血管病雜志, 2003, 9(6):434-436.

[14] 劉勝，鄭秋甫，張曉英，等. 苯那普利與科素亞聯(lián)合應用對高血壓腎病的保護作用[J] 中國中西醫(yī)結合腎病雜志, 2005, 6(2):83-85.

[15] FUKUDA A, WICKMAN LT, VENKATAREDDY MP, et al. Angiotensin II-dependent persistent podocyte loss from destabilized glomeruli causes progression of end stage kidney disease[J]. Kidney Int, 2012, 81(1):40-55.

[16] RAIZADA V, HILLERSON D, AMARAM JS, et al. Angiotensin Ⅱ-mediated left ventricular abnormalities in chronic kidney disease[J]. J Investig Med, 2012, 60(5):785-791.

[17] FERRARIO CM. Role of angiotensin Ⅱ in cardiovascular disease therapeutic implications of more than a century of research[J]. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst, 2006, 7(1):3-14.

[18] WILLIAMS B. Angiotensin-Ⅱ and the pathophysiology of cardiovascular remodeling[J]. Am J Cardiol, 2001, 87(8A):10-17.

(編輯 韓維棟)

Effects of Shen-kang injection on blood pressure and related factors of hypertensive renal disease rats

ZHOU Nan1, Lü Yan-ying2, WANG Hong-ying1, WANG Jun-ping2, WANG Guang-jian2, ZHAO Xing2, YANG Jian3, HE Jian-yu1

(1. School of Pharmacy, Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061; 2. Xi’an Shiji Shengkang Pharmaceutical Industry Co. Ltd., Xi’an, 710300; 3. Department of Clinical Epidemic Prevention, Police Headquarters of Armed Forces, Beijing 100089, China)

Objective To observe the effects of Shen-kang injection on blood pressure and related factors in hypertension nephropathy rats. Methods Thirty-two male rats with hypertension nephropathy were randomly divided into 4 groups: model group, positive control group, and Shen-kang low- and high-dose injection groups. WKY rats served as the negative control group. The positive control group was treated with fosinopril sodium (1.6 mg/kg) by intraperitoneal injection. Shen-kang injection groups were treated with intraperitoneal Shen-kang injection containing 4.8 and 2.4 g/kg of crude drug respectively. Negative control group and model group were injected with normal saline of the same volume. Drugs were administered once a day for 30 consecutive days. The blood pressure, cardiac abnormalities and related inflammatory factors such as NO, Ang-Ⅱ, C-reactive protein and TGF-β1were determined after the last administration. Results Rat body weight of each group did not significantly differ during the administration (P>0.05). Compared with that in model control group, blood pressure was significantly lowered in Shen-kang injection groups after administration (P<0.05 orP<0.01). NO activity was increased while renal cortex Ang-Ⅱ was reduced and C-reactive protein was decreased obviously (P<0.05). However, serum Ang-Ⅱ and TGF-β1levels were not significantly different in Shen-kang injection groups (P>0.05). Conclusion Shen-kang injection can lower blood pressure, improve NO activity, and decrease Ang-Ⅱ and C-reactive protein levels in rats with hypertension nephropathy.

Shen-kang injection; hypertension nephropathy; blood pressure; NO; Ang-Ⅱ;C-reactive protein;TGF-β1

2014-02-26

2014-06-05

賀建宇. E-mail: hejianyu@xjtu.edu.cn

R285.5

A

10.7652/jdyxb201501023

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20141119.0902.008.html(2014-11-19)