楊曉煜 任冬冬

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·基礎(chǔ)研究·

新型光纖二氧化碳激光豚鼠鼓膜造孔術(shù)實(shí)驗(yàn)學(xué)研究△

楊曉煜 任冬冬

目的 研究新型光纖二氧化碳(CO2)激光行鼓膜造孔術(shù)的可行性及對(duì)內(nèi)耳結(jié)構(gòu)和功能的影響。方法 40只豚鼠隨機(jī)分為4組(1、2、3 W和3 W+生理鹽水組)，前3組使用不同功率激光(1、2、3 W)在左耳鼓膜緊張部前下圓形造孔，第4組在左耳鼓室內(nèi)注射生理鹽水后再行3 W激光打孔。右耳均使用細(xì)針機(jī)械圓形造孔。比較各組穿孔愈合時(shí)間，術(shù)前和術(shù)后即刻、術(shù)后2周處死前行聽(tīng)性腦干反應(yīng)檢查了解聽(tīng)覺(jué)功能，術(shù)后2周行掃描電鏡觀察毛細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果 CO2激光造孔愈合時(shí)間較機(jī)械造孔明顯延長(zhǎng)(P<0.01);3 W 組激光造孔后出現(xiàn)耳蝸局部炭化，聽(tīng)閾不可逆升高，耳蝸外毛細(xì)胞靜纖毛倒伏和脫落。鼓室注射生理鹽水后行3 W激光鼓膜打孔也出現(xiàn)聽(tīng)閾不可逆升高，但是術(shù)后2周聽(tīng)閾有部分恢復(fù)，耳蝸毛細(xì)胞損傷輕微。結(jié)論 新型光纖CO2激光豚鼠鼓膜造孔術(shù)只要激光功率選擇合適，臨床治療分泌性中耳炎伴有鼓室積液更安全、有效。 (中國(guó)眼耳鼻喉科雜志，2015，15：185-188)

激光；鼓膜；穿孔；耳蝸；豚鼠

近年來(lái)，激光已被廣泛用于耳科疾病的手術(shù)治療，以損傷小、定位精確、并發(fā)癥少著稱。手術(shù)中使用二氧化碳(CO2)激光已有20多年的歷史。既往的CO2激光器必須與顯微鏡聯(lián)合使用，使其廣泛應(yīng)用于各種精確手術(shù)，特別是耳科、聲帶手術(shù)。但是，通過(guò)導(dǎo)光臂輸出的激光束，有時(shí)很難進(jìn)入一些咽喉或是有角度的部位，因?yàn)榧す馐仨氀刂本€傳播。為了解決這一問(wèn)題，新型柔軟的CO2激光光纖得以發(fā)明和應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究CO2激光行鼓膜造孔術(shù)對(duì)內(nèi)耳結(jié)構(gòu)和聽(tīng)覺(jué)功能的影響，初步探討這種新型光纖CO2激光在耳科應(yīng)用的可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 選用耳廓反射靈敏、電耳鏡檢查證實(shí)鼓膜正常，體重為250～400 g的健康紅目雄性豚鼠(本院提供)40只，隨機(jī)分為4組(1、2、3 W和 3 W+生理鹽水組)，每組10只。前3組使用不同功率激光(1、2、3 W)在左耳鼓膜緊張部前下圓形造孔，第4組左耳鼓室內(nèi)注射生理鹽水后再行3 W激光打孔。右耳均使用細(xì)針機(jī)械圓形造孔，直徑約0.5 mm(顯微鏡下用鉤針測(cè)量直徑大小)。分別于術(shù)后2周斷頭處死豚鼠。

1.2 激光照射方法 使用氯胺酮(40 mg/kg)和甲苯噻嗪(10 mg/kg)混合液肌內(nèi)注射麻醉成功后，在手術(shù)顯微鏡(OPMI 9-FC，Zeiss公司，德國(guó))下，采用新型CO2激光治療機(jī)和FiberLase CO2激光光纖(AcuPulse 40WG，Lumenis公司，美國(guó))，光纖輸出端光斑直徑為485 μm，工作距離3 mm(由于激光散射角很小，所以光纖的工作距離可以達(dá)到3 mm，而且無(wú)需與組織接觸)。使用脈沖(SP)模式1次，持續(xù)0.1 s。以左耳為激光照射耳，分別以1 W(54.1 J/cm2)、2 W(108.2 J/cm2)和3 W(162.3 J/cm2)行鼓膜前下象限打孔，造孔直徑約0.5 mm。激光造孔術(shù)后每天在電耳鏡下觀察和記錄穿孔愈合情況。

1.3 聽(tīng)性腦干反應(yīng)閾值的檢測(cè) 在隔聲靜電屏蔽室內(nèi)，分別于術(shù)前半小時(shí)，術(shù)后即刻和術(shù)后2周行雙耳聽(tīng)性腦干反應(yīng)(auditory brainstem response，ABR)檢測(cè)。ABR檢測(cè)使用聽(tīng)覺(jué)腦干誘發(fā)電位儀(AEP windows V 1.3.0, Bio-Logic公司，美國(guó))，以click短聲刺激。參考電極接于測(cè)試耳耳垂或乳突皮下，記錄電極接于顱頂雙耳中間，接地電極接于對(duì)側(cè)耳耳垂或乳突部皮下。該機(jī)器對(duì)于正常豚鼠使用耳塞測(cè)試的正常聽(tīng)閾為 30 dB SPL左右。

1.4 耳蝸標(biāo)本掃描電鏡的制作 術(shù)后2周各組檢測(cè)ABR后，斷頭處死豚鼠，分別快速取出聽(tīng)泡，在立體顯微鏡(解剖顯微鏡)(Stemi 2000，Zeiss公司，德國(guó))下刺破圓窗膜，從蝸尖行2.5%戊二醛灌注并固定12 h，立體顯微鏡下按耳蝸鋪片法，剝?nèi)ノ仛?，除去螺旋韌帶和前庭膜、蓋膜，制成耳蝸標(biāo)本,1%鋨酸后固定 1 h 后，0.1 mm/L磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline, PBS)漂洗。將耳蝸標(biāo)本放于2%單寧酸中浸2次，每次30 min，PBS漂洗3次，每次20 min。經(jīng)梯度乙醇脫水，臨界點(diǎn)干燥(EM CPD300，Leica公司，德國(guó))。固定于鋼座上，經(jīng)離子濺射儀(E-1045，Hitachi公司，日本)鍍膜行掃描電鏡SEM-LV(NOVA NanoSEM 230，F(xiàn)ei公司，美國(guó))觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行成組樣本的t檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察 4組左耳分別行不同功率激光鼓膜前下象限打孔，右耳對(duì)照組使用細(xì)針機(jī)械打孔，均使得穿孔直徑達(dá)0.5 mm。術(shù)后即刻在顯微鏡下見(jiàn)1、2 W組和3 W+生理鹽水組鼓膜穿孔邊緣光整，中耳鼓室和耳蝸未見(jiàn)明顯黑色炭化樣物。但是單純3 W激光造孔組，可見(jiàn)耳蝸鼓岬處黑色炭化明顯。術(shù)后第3天開(kāi)始3 W激光組就開(kāi)始有豚鼠死亡，至術(shù)后2周，3 W組豚鼠死亡3只，考慮可能術(shù)后炎癥反應(yīng)較強(qiáng)，進(jìn)食差或感染死亡。術(shù)后2周發(fā)現(xiàn)1 W組豚鼠1只、2 W組豚鼠2只、3 W組豚鼠2只和 3 W+生理鹽水組豚鼠2只中耳感染，中耳較多膿性分泌物，故給予排除計(jì)數(shù)。

2.2 穿孔愈合時(shí)間觀察 激光造孔后1周后電耳鏡下觀察每組雙側(cè)鼓膜愈合情況，因?yàn)橹邦A(yù)實(shí)驗(yàn)觀察1周內(nèi)鼓膜穿孔均不會(huì)愈合，并記錄每組實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組時(shí)間(表1)，其中4組實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組愈合時(shí)間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說(shuō)明激光行鼓膜打孔比傳統(tǒng)的機(jī)械穿孔愈合時(shí)間稍長(zhǎng)。

表1 激光照射后實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組鼓膜穿孔愈合時(shí)間±s)

注：a表示各組與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)

2.3 ABR測(cè)試 所有豚鼠于打孔前、打孔后即刻和2周后處死前行ABR測(cè)試(表2)。從表2中可見(jiàn)，激光打孔后即刻1 W組ABR閾移與對(duì)照組比較無(wú)明顯差異(P=0.78)，但是2、3 W組和3 W+生理鹽水組術(shù)后即刻ABR閾移與對(duì)照組比較有明顯差異(P<0.01)；激光打孔后2周觀察發(fā)現(xiàn)，1 W組和2 W組ABR閾值均基本回復(fù)到術(shù)前水平，與對(duì)照組比較無(wú)明顯差異(P值分別為0.7和0.2)，但是3 W組和 3 W+生理鹽水組閾移與對(duì)照組比較有差異(P<0.01)。雖然3 W+生理鹽水組閾值比術(shù)后即刻有所降低，但是仍然未回復(fù)到術(shù)前水平。

表2 激光鼓膜打孔前后各組豚鼠ABR閾移檢測(cè)

組別打孔后即刻閾移打孔后2周閾移1W組21.50±3.373.33±2.502W組32.00±3.5a5.00±3.783W組41.50±3.37a49.00±4.18b3W+生理鹽水組40.50±3.69a23.75±3.54b,c對(duì)照組20.50±3.693.00±2.58

注：a表示打孔后即刻ABR閾移與對(duì)照組比較有差異(P<0.01)；b表示打孔后2周ABR閾移與對(duì)照組比較有差異(P<0.01)；c表示改組術(shù)后2周閾移與術(shù)后即刻閾移有明顯差異(P<0.01)

2.4 掃描電鏡觀察 術(shù)后2周行ABR測(cè)試后斷頭處死豚鼠，取耳蝸?zhàn)鰭呙桦婄R觀察發(fā)現(xiàn)，3 W激光鼓膜打孔組，耳蝸底中回3排外毛細(xì)胞中均見(jiàn)部分靜纖毛脫落破壞，表皮板部分有裂開(kāi)(圖1A)，內(nèi)毛細(xì)胞完整，且排列整齊。正常對(duì)照組、1 W組和2 W組(圖1B)，外毛細(xì)胞排列基本正常，未見(jiàn)明顯破壞和脫落。

圖1. 術(shù)后2周掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，3 W激光鼓膜打孔組，耳蝸底中回3排外毛細(xì)胞(白色箭頭)中均見(jiàn)部分靜纖毛脫落破壞，表皮板部分有裂開(kāi)(A)，內(nèi)毛細(xì)胞完整排列整齊。正常對(duì)照組、1 W組和2 W組(B)，外毛細(xì)胞排列基本正常，未見(jiàn)明顯破壞和脫落。IHC為內(nèi)毛細(xì)胞，OHC1為第1排外毛細(xì)胞；OHC2為第2排外毛細(xì)胞；OHC3為第3排外毛細(xì)胞 ×5 000

3 討論

分泌性中耳炎是耳科常見(jiàn)病和多發(fā)病，尤其多見(jiàn)于兒童，傳導(dǎo)性聾和鼓室積液病程較長(zhǎng)，在一定程度上影響著患兒的生活。一般認(rèn)為與咽鼓管功能障礙、感染和自身免疫失調(diào)所致中耳分泌、吸收和排泄障礙引起中耳積液有關(guān)。既往有報(bào)道[1]指出，激光治療分泌性中耳炎具有操作簡(jiǎn)單、時(shí)間短、傷口愈合慢、痛苦小、療效好等優(yōu)點(diǎn)，有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值。激光波長(zhǎng)及其射線束特征提供了有效的能量來(lái)源，用于切割和消融含水量高的組織。最早在1995年開(kāi)始報(bào)道鈥激光用于鼓膜照射引起的改變[2]，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者相繼使用CO2激光[3]行動(dòng)物鼓膜手術(shù)，證明其安全性和有效性。

激光鼓膜打孔手術(shù)可以避免鼓膜置管和全身麻醉手術(shù)，因此值得推廣，尤其適合門(mén)診手術(shù)[4]。本實(shí)驗(yàn)選用新型FiberLase CO2激光波導(dǎo)技術(shù)和AcuPulse波導(dǎo)(WG)激光系統(tǒng)，使得用小纖維、轉(zhuǎn)角、可彎曲手柄和纖維內(nèi)鏡直接照射組織成為可能。采用該光纖型CO2激光進(jìn)行鼓膜打孔，提供了清晰的瞄準(zhǔn)光束，可用于定位不可見(jiàn)的CO2激光能量，充分保障了手術(shù)安全。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)不同激光功率大小進(jìn)行鼓膜打孔，了解該新型激光行鼓膜打孔的可行性和合適參數(shù)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在激光功率為1、2、3 W和3 W+生理鹽水組，鼓膜穿孔愈合時(shí)間均較對(duì)照組機(jī)械損傷組長(zhǎng)。有研究[1]表明，如果激光打孔后鼓膜過(guò)早愈合而鼓室內(nèi)仍有積液者可以再次接受激光鼓膜造孔治療，手術(shù)較安全。造孔主要是利用激光熱效應(yīng)減少穿孔邊緣的血供，延遲穿孔愈合。造孔直徑控制在2～4 mm，有利于中耳腔的通氣、引流，促進(jìn)咽鼓管功能的恢復(fù)，療效較好，治愈率和好轉(zhuǎn)率達(dá)68.8%。

為探討新型FiberLase CO2激光鼓膜造孔的安全性，本實(shí)驗(yàn)對(duì)于1、2、3 W組和3 W+生理鹽水組術(shù)前和術(shù)后即刻、術(shù)后2周均行ABR檢測(cè)聽(tīng)覺(jué)功能的改變，發(fā)現(xiàn)鼓膜穿孔對(duì)于ABR是有影響的。1 W組術(shù)后即刻和對(duì)照組ABR閾移沒(méi)有明顯差異，本實(shí)驗(yàn)中說(shuō)明鼓膜穿孔一般影響ABR閾移在17～24 dB SPL，在2、3 W組和3 W+生理鹽水組術(shù)后即刻ABR閾移與對(duì)照組比較有差異，說(shuō)明激光在術(shù)后即刻可能造成了輕微的內(nèi)耳損傷。我們選擇術(shù)后2周處死小鼠行聽(tīng)力學(xué)和形態(tài)學(xué)檢查，主要是因?yàn)榧す馑斓拇┛子蠒r(shí)間基本上在術(shù)后2周，所以檢查鼓膜愈合的各組豚鼠ABR閾值改變，發(fā)現(xiàn)1 W和2 W組閾值基本回復(fù)到術(shù)前水平，與對(duì)照組比較閾移無(wú)明顯差異；而3 W組和3 W+生理鹽水組閾值仍然沒(méi)有回復(fù)到術(shù)前水平，與對(duì)照組比較有明顯差異，說(shuō)明內(nèi)耳有不可逆性損傷。3 W+生理鹽水組術(shù)后2周閾值較術(shù)后即刻有明顯改善(P<0.01),說(shuō)明生理鹽水有明顯保護(hù)內(nèi)耳的作用。CO2激光是水溶性激光，適合用于含水豐富的組織和器官，不易穿透。另外在大功率3 W組術(shù)后有3只豚鼠死亡，主要原因考慮為激光功率過(guò)大，耳蝸損傷嚴(yán)重引起感染死亡可能。而在3 W+生理鹽水組未見(jiàn)死亡豚鼠，這也再次說(shuō)明生理鹽水減少了激光的損傷，所以在分泌性中耳炎有鼓室積液中使用是比較安全的。結(jié)合掃描電鏡觀察耳蝸的毛細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)同時(shí)證明，3 W 激光功率對(duì)內(nèi)耳外毛細(xì)胞有一定的損傷作用，尤其在中底回外毛細(xì)胞，每層外毛細(xì)胞均可見(jiàn)靜纖毛部分或完全脫落、倒伏和表皮板裂開(kāi)，與聽(tīng)覺(jué)功能的改變基本一致。本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，使用合適功率密度如1 W(54.1 J/cm2)和2 W(108.2 J/cm2)的FiberLase CO2激光豚鼠鼓膜造孔是安全的。有報(bào)道[5]表明，豚鼠耳蝸對(duì)聲損傷的敏感度是人類的10倍以上，因此本實(shí)驗(yàn)的激光劑量用于人類是很安全的。有報(bào)道[1]使用CO2激光鼓膜打孔功率一般為8～10W(連續(xù)脈沖)，臨床使用也是安全、有效的。

近幾年也有許多報(bào)道說(shuō)明激光鼓膜造孔治療分泌性中耳炎有較高的復(fù)發(fā)率，有文獻(xiàn)[6-7]報(bào)道激光鼓膜打孔治療分泌性中耳炎的兒童有效率為40%～83%，其中有手術(shù)失敗，需要再次行鼓膜置管手術(shù)。這個(gè)結(jié)果的差異與手術(shù)選擇何種病例有很大關(guān)系。有報(bào)道[8]表明，如果單純激光打孔對(duì)于兒童雙側(cè)分泌性中耳炎效果不佳，不如傳統(tǒng)的全身麻醉下鼓膜置管手術(shù)；但是在需要重復(fù)置管的患兒可以考慮局部麻醉下激光打孔+鼓膜置管手術(shù)，可以減輕反復(fù)手術(shù)的風(fēng)險(xiǎn)；對(duì)于不嚴(yán)重的分泌性中耳炎的患兒局部麻醉下激光打孔或激光打孔+鼓膜置管手術(shù)比全身麻醉下鼓膜置管手術(shù)要?jiǎng)?chuàng)傷小。內(nèi)鏡下鼓膜置管手術(shù)安全性較高，臨床使用廣泛；但和傳統(tǒng)的顯微鏡下鼓膜置管相比都需要長(zhǎng)期留置管在鼓膜上，易產(chǎn)生鼓膜瘢痕、鈣化和永久性穿孔可能，影響患者的生活質(zhì)量。CO2激光鼓膜打孔，可以清除內(nèi)耳積液，引起的永久性穿孔并發(fā)癥可能性小。另外激光照射可能會(huì)產(chǎn)生熱效應(yīng)，促進(jìn)受損細(xì)胞功能恢復(fù)，加快中耳上皮細(xì)胞代謝，促進(jìn)黏液排出，中耳黏膜恢復(fù)效果好[9]。

綜上所述，激光治療分泌性中耳炎有以下優(yōu)點(diǎn)：①損傷小，可以反復(fù)進(jìn)行，可以控制穿孔大小，沒(méi)有異物反應(yīng)；②操作簡(jiǎn)便，帶有可以彎曲操作的光纖，準(zhǔn)確度高，患者可在局部麻醉下進(jìn)行，兒童也可以耐受，門(mén)診可以完成；③手術(shù)時(shí)間短，一般1次激光脈沖即可造孔成功；④并發(fā)癥少，很少引起鼓膜鈣化和感音神經(jīng)性聾[1,7,10]。新型光纖FiberLase CO2激光用于豚鼠鼓膜打孔安全、可行，只要功率密度控制在合適范圍內(nèi)不會(huì)造成內(nèi)耳損傷。臨床應(yīng)用于分泌性中耳炎的治療也是有理論根據(jù)的,值得推廣應(yīng)用。

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(本文編輯 楊美琴)

Research of fiber-enabled CO2laser tympanostomy in guinea pigs

YANG Xiao-yu， REN Dong-dong

Department of Otorhinolaryngology， Eye Ear Nose and Throat Hospital of Fudan University， Shanghai 200031， China

REN Dong-dong, Email: dongdong_ren@163.com

Objective To explore the feasibility of fiber-enabled CO2laser tympanostomy in guinea pigs and its influence on the structure and function of inner ear. Methods Forty guinea pigs were randomly divided into four groups. Guinea pigs belonging to the first three groups were treated with laser power(1，2，3 W) respectively for the left ear, while the forth group received intratympanic saline injection before 3W laser power. Laser treatment caused perforation on anterior inferior of pars tensa membrane tympani. Circular perforation was caused by needle for the right ear in all groups as controls. Otoscopes examinations were performed to evaluate the healing time of perforation. Auditory brainstem response(ABR) were accessed preoperatively， immediately and 2 weeks postoperatively. Morphological changes of hair cells′ microstructure were observed by scanning electron microscopy(SEM) 2 weeks postoperatively. Results The healing time of perforation of CO2laser-caused perforation was longer than needle-caused perforation(P<0.01). In 3 W CO2laser treatment group, part of cochlea carbonized, ABR threshold increased irreversibly and stereocilia of outer hair cells collapsed and disoriented. With previous intratympanic saline injection, ABR threshold increased immediately after laser perforation, but got partial restoration in 2 weeks with minor inner ear damage. Conclusions The new fiber-enabled CO2laser is effective and safe for secretory otitis media with effusion if the total amount of energy is kept within the limits. (Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2015,15:185-188)

Laser； Tympanic membrane； Perforation； Cochlea； Guinea pigs

國(guó)家自然基金青年-面上連續(xù)資助項(xiàng)目(81370022)；國(guó)家自然基金青年基金項(xiàng)目(81000413)；上海市衛(wèi)生系統(tǒng)優(yōu)秀青年人才培養(yǎng)計(jì)劃(XYQ2013084)

復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院耳鼻喉科 衛(wèi)生部聽(tīng)覺(jué)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海 200031

任冬冬(Email：dongdong_ren@163.com)

10.14166/j.issn.1671-2420.2015.03.009

2015-01-14)