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基礎醫(yī)學研究

鹽酸丁卡因脂質體凝膠皮膚刺激性實驗及藥效

王敏1,2，林茂1，鄧英杰2，王春梅1

(1.遵義醫(yī)學院珠海校區(qū)，廣東 珠海519041；2.沈陽藥科大學 藥學院，遼寧 沈陽110016)

[摘要]目的 考察鹽酸丁卡因脂質體凝膠劑的皮膚刺激性及藥效。方法 通過皮膚刺激性試驗考察了鹽酸丁卡因脂質體凝膠劑對家兔完整或破損皮膚的刺激性。通過小鼠熱板試驗、小鼠甩尾試驗和豚鼠背部皮膚擦傷試驗考察了鹽酸丁卡因脂質體凝膠劑的藥效。結果 鹽酸丁卡因脂質體凝膠劑對完整或破損皮膚均無刺激性。與鹽酸丁卡因凝膠劑相比，鹽酸丁卡因脂質體凝膠劑使熱板試驗中小鼠的鎮(zhèn)痛時間明顯延長(P<0.05)，小鼠甩尾試驗中小鼠的痛閾提高率明顯提高(P<0.05)，以及提高豚鼠擦傷試驗的最大效能。結論 鹽酸丁卡因脂質體凝膠劑無皮膚刺激性，與鹽酸丁卡因凝膠劑相比，鹽酸丁卡因脂質體凝膠劑延長了局麻時間。

[關鍵詞]脂質體凝膠；鹽酸丁卡因；藥效學；刺激性；局麻藥

鹽酸丁卡因是一種常用于粘膜表面較理想的局部麻醉藥，由于鹽酸丁卡因可以解離出陽離子，容易進入脂質膜中，通過在脂質膜上波動的孔隙來發(fā)揮局麻作用[1]，現(xiàn)已廣泛應用于臨床，但是其局部藥效維持時間并不長久，還具有一定的毒副作用。因此，為了延長鹽酸丁卡因在用藥局部的作用時間，降低其毒副作用，本實驗研究制備了鹽酸丁卡因脂質體凝膠劑，并與自制鹽酸丁卡因凝膠劑比較，通過小鼠熱板試驗、小鼠甩尾試驗、豚鼠背部皮膚擦傷試驗初步考察了鹽酸丁卡因脂質體凝膠劑的藥效。由于鹽酸丁卡因脂質體凝膠劑屬于非口服的經(jīng)皮給藥及可能接觸皮膚的制劑，還應進行皮膚刺激性試驗[2]。因此，本文通過皮膚刺激性試驗評價了自制鹽酸丁卡因脂質體凝膠劑對家兔皮膚的刺激性作用。

1材料與方法

1.1試藥鹽酸丁卡因(廣東逸舒制藥有限公司，產(chǎn)品批號20090101)；鹽酸丁卡因脂質體凝膠劑(自制，含量2 mg/g)；鹽酸丁卡因凝膠劑(自制，含量2 mg/g)。

1.2實驗動物新西蘭種家兔(♂♀，2.0~2.5 kg)，昆明種小鼠(♀，18~22 g)，豚鼠(♂♀，350~400 g)，均由沈陽藥科大學動物實驗中心提供。

1.3儀器AR1140 電子天平(美國Ohaus corp公司)；HSS-1B數(shù)字超級恒溫浴槽(成都儀器廠)；恒溫水浴鍋(鞏義市予華儀器有限責任公司)；電動剃毛刀(美國Oster公司)。

1.4鹽酸丁卡因脂質體凝膠的制備

1.4.1鹽酸丁卡因脂質體的制備采用硫酸銨梯度載藥法制備鹽酸丁卡因脂質體，處方組成中磷脂與膽固醇質量比4∶1，藥物與磷脂質量比1∶14.4，磷脂濃度(W/W)為4%，硫酸銨濃度300 mmol/L。將制備得到的空白脂質體裝于透析袋中，置于裝有500 mL 生理鹽水的溶出杯中，100 rpm，37 ℃透析，每隔6 h更換外部介質，透析24 h。在透析后的空白脂質體中加入1 mL處方量的鹽酸丁卡因水溶液，于50 ℃恒溫水浴中孵化5 min，冷卻后即得鹽酸丁卡因脂質體混懸液。

1.4.2鹽酸丁卡因脂質體凝膠劑的制備取10.8 mL鹽酸丁卡因脂質體混懸液(含藥物30 mg)，先用一部分脂質體混懸液溶脹凝膠基質，12 h后，加入另一部分脂質體混懸液，充分攪拌，加入處方量的甘油，用三乙醇胺調節(jié)脂質體凝膠的pH為6~8，最后蒸餾水補充總質量至15 g(藥物含量約為2 mg/g)。

1.4.3鹽酸丁卡因凝膠劑的制備制備與鹽酸丁卡因脂質體凝膠劑藥物濃度相同的鹽酸丁卡因凝膠劑，制備過程的不同僅在于加入藥物水溶液而不是脂質體混懸液。

1.5皮膚刺激性試驗

1.5.1實驗動物分組與給藥健康家兔12只按體重分層后隨機平均分為2組：完整皮膚組和破損皮膚組。每組再次按照受試物不同隨機分為2組：基質組和藥物組，進行皮膚刺激性試驗。其中基質組和藥物組均以左側去毛區(qū)皮膚作為模型組，采用同體自身對照。

在受試前去除家兔背部脊柱兩側兔毛，每側的面積約為9 cm2。破損皮膚組除毛后需用砂紙磨擦，去毛部位以滲血為度。左側去毛區(qū)完整皮膚或破損皮膚均作為自身對照，不給予干預，而右側去毛區(qū)完整皮膚或破損皮膚均涂抹1.0 g基質或藥物。

涂抹受試物4 h后用溫水洗去殘留受試物，并在去除受試物后的1、24和48 h時觀察涂抹部位有無紅斑、水腫等情況，觀察結果均與動物左側去毛區(qū)皮膚作為自身對 照以判斷是否存在皮膚刺激性[2]。

1.5.2評價方法按表1中的評價方法進行刺激性評分，計算出平均值后根據(jù)以下評價標準進行評價。無刺激性：0~0.49；輕度刺激性：0.50~2.99；中度刺激性：3.00~5.99；強刺激性：6.00~8.00。

表1皮膚刺激性反應評分標準

刺激反應的表征(紅斑)分值刺激反應的表征(水腫)分值無紅斑0無水腫0輕微紅斑(勉強可見)1輕微水腫(勉強可見)1中度紅斑2中度水腫(涂藥區(qū)域隆起輪廓明顯)2嚴重紅斑3重度水腫(涂藥區(qū)域隆起約1mm,輪廓清楚)3紫紅色紅斑并有焦痂形成4嚴重水腫(涂藥區(qū)域隆起約1mm,并范圍擴大)4

1.6藥效實驗

1.6.1小鼠熱板試驗在(55±0.5) ℃恒溫水浴中放入1 000 mL燒杯進行預熱，燒杯達到(55±0.5) ℃后，放入小鼠，并記錄小鼠舔后足或跳出燒杯的時間，即為熱板試驗的潛伏期。挑選5～30 s反應靈敏且穩(wěn)定的小鼠40只，按此法測定2次潛伏期，每次間隔30 min，計算平均值，記為基礎潛伏期。將小鼠按照基礎潛伏期分層后隨機分成空白對照組(A組)、空白凝膠基質組(B組)、鹽酸丁卡因脂質體凝膠組(C組)和鹽酸丁卡因凝膠組(D組)，每組10只。分別于每只小鼠4個足跖涂抹相應受試物，0.5 g/只。分別于0.5、1、1.5、2、2.5、3、6和8 h時測定小鼠給藥后的潛伏期[3-4]。測定時間上限為60 s。根據(jù)公式：最大可能效應=(給藥后潛伏期-基礎潛伏期)×100%/(40-基礎潛伏期)[5](式中40表示致痛時燒杯加熱的時間為40 s，該值可以直觀的反應藥物的鎮(zhèn)痛效果)計算最大可能效應的值。

1.6.2小鼠甩尾試驗取小鼠在試驗前于距離尾尖5 cm 處用酒精擦干凈，酒精揮發(fā)后，使小鼠尾部下垂浸入(55±0.5) ℃的恒溫水浴中，浸入長度為距離尾尖3 cm處。以鼠尾回縮出水面的時間為潛伏期，間隔5 min測定2次潛伏期，取其均值作為基礎潛伏期，將基礎潛伏期大于13 s的小鼠棄去。篩選出40只小鼠按基礎潛伏期分層后隨機分成4組：空白對照組(A組)、空白凝膠基質組(B組)、鹽酸丁卡因脂質體凝膠組(C組)和鹽酸丁卡因凝膠組(D組)，每組10只。給予相應受試物涂抹，給藥劑量0.5 g/只。清除鼠尾多余受試物后，分別于0.5、1、1.5、2、2.5、3、6和8 h時測定小鼠給藥后的潛伏期。按公式計算脂質體凝膠組與凝膠組的痛閾提高率：痛閾提高率(%)=(給藥后潛伏期-基礎潛伏期)/基礎潛伏期×100%，該值可直觀反應藥物的鎮(zhèn)痛效果[5]。

1.6.3豚鼠背部皮膚擦傷法試驗取豚鼠按體重分層后隨機分為3組，即模型對照組，鹽酸丁卡因脂質體凝膠組和鹽酸丁卡因凝膠組，每組6只，在其背上正中前部皮膚剃毛，大小約為3 cm2。將豚鼠麻醉，腹臥位固定，按擦傷法(選粗金剛砂石，在裸露皮膚上，向同一方向，加壓重擦5次，隨即換成垂直方向，再擦5次，使該處皮膚受損)來處理皮膚。待豚鼠清醒后，將受試物涂布于擦傷處。用針刺法測定用藥部位皮膚的痛覺反應。針刺皮膚有收縮現(xiàn)象為陽性，無收縮為陰性反應。針刺部位應在損傷區(qū)周邊寬約6 mm的帶狀區(qū)內(nèi)，因該處最敏感，受損皮膚的中心部位不敏感。涂抹受試物后10 min內(nèi)，每1分鐘測定1次，10 min后每5分鐘測定一次[6-7]。每只豚鼠測定12次，記錄其陰、陽性反應數(shù)，計算最大效能=(陰性反應數(shù)/測試次數(shù))×100%，最大效能≤1。

2結果

2.1鹽酸丁卡因脂質體的外觀、粒徑和包封率鹽酸丁卡因脂質體的外觀(見圖1 A)，為球形或類球形。激光粒度儀測定其平均粒徑為(168±22) nm且粒度分布范圍窄(見圖1 B)。微柱離心法[8]測定其包封率為82.40%。

圖1　鹽酸丁卡因脂質體透射電鏡圖片(×40k，A)和粒度分布范圍(B)

2.2皮膚刺激性試驗結果根據(jù)“1.5.2”中的評價方法考察家兔涂抹部位的紅斑和水腫情況，結果顯示給予受試物后，無論是完整皮膚還是破損皮膚的模型組、脂質體凝膠組和空白凝膠基質組均未見皮膚刺激性表征。

2.3小鼠熱板試驗結果由表2可知，鹽酸丁卡因脂質體凝膠組(C)在測試的8 h內(nèi)各時間點的痛閾潛伏期均顯著大于空白對照組(A)和空白基質組(B)(P<0.05)。鹽酸丁卡因凝膠組(D)僅在給藥后2.5 h內(nèi)的潛伏期大于A和B組。鹽酸丁卡因脂質體凝膠組(C)于給藥后3~8 h的潛伏期顯著大于鹽酸丁卡因凝膠組(D)(P<0.01)。

由表3可知，鹽酸丁卡因脂質體凝膠組的最大可能效應值顯著高于鹽酸丁卡因凝膠組(P<0.05)。表明，鹽酸丁卡因脂質體凝膠組的鎮(zhèn)痛效果強于鹽酸丁卡因凝膠組。

組別基礎潛伏期(s)給藥后的潛伏期(s)0.5h1h1.5h2hA17.60±5.6016.10±7.7517.40±8.7517.30±9.1218.10±11.18B17.30±5.2817.30±6.5218.60±7.5619.60±7.9619.80±7.78C16.00±5.6829.70±7.04☆△36.80±6.38☆△▲38.20±6.13☆△▲▲33.80±6.52☆△▲D18.20±7.3127.80±8.86☆△29.70±6.88☆△27.30±6.06☆△26.10±7.21☆△

(續(xù)表)

組別基礎潛伏期(s)給藥后的潛伏期(s)2.5h3h6h8hA17.60±5.6017.60±8.2717.80±7.3217.30±8.2518.20±9.03B17.30±5.2818.20±8.4719.30±7.7218.60±7.6919.50±8.23C16.00±5.6833.20±7.21☆△▲▲32.70±7.56☆△▲▲28.20±6.23☆△▲▲23.70±7.24☆△▲D18.20±7.3124.70±6.72☆△19.60±7.6718.70±7.3218.20±8.56

與A組比較，☆P<0.05；與B組比較，△P<0.05；與D組比較，▲P<0.05；與D組比較，▲▲P<0.01。

表3小鼠熱板試驗的最大可能效應結果(%)

組別給藥后時間(h)0.511.522.5368χ2P鹽酸丁卡因脂質體凝膠57.3186.1992.8973.6471.6769.5850.8332.08747.000.00鹽酸丁卡因凝膠 44.2453.0041.9435.4829.826.422.290.00

2.4小鼠甩尾試驗結果由表4可知，鹽酸丁卡因脂質體凝膠(A)組在給藥后各時間點的潛伏期均顯著高于空白對照組和空白基質組(P<0.05)；在給藥后1~8 h顯著高于鹽酸丁卡因凝膠(D)組(P<0.05或P<0.01)。

由表5可知，鹽酸丁卡因脂質體凝膠組在給藥后的測定時間范圍內(nèi)，對小鼠的痛閾提高率均>0。而鹽酸丁卡因凝膠組在給藥6 h后幾乎降為0。鹽酸丁卡因脂質體凝膠組提高小鼠痛閾率顯著大于鹽酸丁卡因凝膠組(P<0.05)，其鎮(zhèn)痛效果較強。

表4小鼠甩尾試驗給藥前的基礎潛伏期和給藥后的潛伏期

組別基礎潛伏期(s)給藥后的潛伏期(s)0.5h1h1.5h2hA5.81±1.125.91±1.125.66±1.495.45±1.105.43±1.11B5.33±1.245.43±1.295.56±1.675.11±1.085.40±1.07C5.85±1.148.42±1.81☆△10.96±2.36☆△▲11.08±2.03☆△▲11.34±2.49☆△▲▲D5.62±1.218.31±2.25☆△9.12±2.06☆△9.51±2.05☆△8.48±2.06☆△

(續(xù)表)

組別基礎潛伏期(s)給藥后的潛伏期(s)2.5h3h6h8hA5.81±1.125.63±1.215.75±1.135.68±1.575.62±1.32B5.33±1.245.42±1.215.37±1.185.43±1.255.50±1.65C5.85±1.1411.27±2.42☆△▲▲11.15±2.23☆△▲▲10.32±2.12☆△▲▲9.67±2.11☆△▲▲D5.62±1.218.27±2.12☆△5.83±1.375.65±1.425.63±1.51

與A組比較，☆P<0.05；與B組比較，△P<0.05；與D組比較，▲P<0.05；與D組比較，▲▲P<0.01。

表5小鼠甩尾試驗的痛閾提高率(%)

組別給藥后時間(h)0.511.522.5368χ2P鹽酸丁卡因脂質體凝膠43.8687.2089.2593.6992.6590.6076.4165.30920.000.00鹽酸丁卡因凝膠 47.7861.8169.0950.8047.153.740.530.18

2.5豚鼠背部皮膚擦傷法試驗結果最大效能的試驗結果分別為模型對照組0%，鹽酸丁卡因脂質體凝膠組0.57%，鹽酸丁卡因凝膠組0.43%?？梢?，鹽酸丁卡因脂質體凝膠組的最大效能高于鹽酸丁卡因凝膠組。說明脂質體凝膠作為鹽酸丁卡因的載體可以更好地發(fā)揮其局部麻醉效果。

3討論

脂質體類似于細胞結構，它本身可生物降解，無毒性，不產(chǎn)生皮膚刺激性，其水化磷脂還能夠促進干燥皮膚的水化，使藥物更容易透過皮膚角質層，還能使皮膚細膩光澤[9]，因此是皮膚局部給藥的理想載體[10]。本實驗中皮膚刺激性觀察結果也表明，鹽酸丁卡因脂質體凝膠劑對家兔皮膚無刺激性。但脂質體物理穩(wěn)定性較差，所以不宜以脂質體混懸液直接作為劑型應用。因此，本文選擇將脂質體與凝膠基質相結合，制備成為穩(wěn)定性好，應用方便的脂質體凝膠劑。

在藥效學實驗中，選用小鼠熱板法、小鼠甩尾法和豚鼠皮膚擦傷法為疼痛模型，分別考察自制鹽酸丁卡因脂質體凝膠劑與模型組、空白基質組以及鹽酸丁卡因凝膠劑組的最大效應，即鎮(zhèn)痛效果，以及給藥后潛伏期，即鎮(zhèn)痛時間的比較。結果顯示，鹽酸丁卡因脂質體凝膠劑組的鎮(zhèn)痛效果，鎮(zhèn)痛作用時間均強于鹽酸丁卡因凝膠組，顯示了其緩釋性的特點，這可能是由于脂質體作為經(jīng)皮給藥途徑的載體可以滯留于皮膚內(nèi)，起到緩釋作用。鹽酸丁卡因脂質體凝膠劑的鎮(zhèn)痛效果強，還提示可適當降低其給藥劑量，在保證其鎮(zhèn)痛效果的前提下，降低其毒副作用。

在實際應用中，鹽酸丁卡因溶液劑中常加入一定量的腎上腺素，后者收縮血管而起到延緩鹽酸丁卡因的吸收作用，但腎上腺素強烈縮血管的作用會對局部皮膚組織產(chǎn)生刺激作用，使其應用具有一定的局限性。因此，期望本實驗研究會對鹽酸丁卡因新劑型的開發(fā)提供理論依據(jù)。

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[收稿2015-10-12;修回2015-11-10]

(編輯：王靜)

Study of hydrochloride tetracaine liposome gel for skin irritation and analgesic effects

WangMin1,2,LinMao1,DengYingjie2,WangChunmei1

(1.Zhuhai Campus of Zunyi Medical University, Zhuhai Guangdong 519041, China; 2.School of Pharmacy, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang Liaoning 110016, China)

[Abstract]Objective To investigate the hydrochloride tetracaine liposome gel for skin irritation and pharmacodynamics.Methods Irritation effects of hydrochloride tetracaine liposome gel on rabbit intact or damaged skin were studied by the skin irritation test. The analgesic effect of hydrochloride tetracaine liposome gel was investigated by the mouse hot plate test, the mouse tail flick test, and the guinea pig dorsal skin abrasion test, respectively.Results The hydrochloride tetracaine liposome gel did not cause irritation on the intact skin and the damaged skin. Compared with tetracaine hydrochloride gel, the hydrochloride tetracaine liposome gel could prolong the analgesic time of the mouse hot plate test (P<0.05), increase the pain threshold rate of the mouse tail flick test (P<0.05) and improve the maximum effect of the guinea pig dorsal skin abrasion test.Conclusion The hydrochloride tetracaine liposome gel is not a skin irritant. Compared with the tetracaine hydrochloride gel, the hydrochloride tetracaine liposome gel can prolong the local anesthesia effect.

[Key words]liposome gel; hydrochloride tetracaine; pharmacodynamics; irritation; local anesthetics

[中圖法分類號]R943

[文獻標志碼]A

[文章編號]1000-2715(2015)06-0599-05

[通信作者]王春梅，女，教授，碩士生導師，研究方向：神經(jīng)內(nèi)分泌疾病發(fā)病機制及治療，E-mail:295446806@qq.com。

[基金項目]廣東省衛(wèi)生廳基金資助項目(NO: A2013651)。