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臨床醫(yī)學(xué)研究

青蒿琥酯對肺腺癌PC9細胞中Axl及其下游信號分子的影響

臨床醫(yī)學(xué)研究

張鈺1，韓靜3，周建國1，王菲1，王怡1，馬虎1,2，陳正堂3

臨床醫(yī)學(xué)研究

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤醫(yī)院，貴州 遵義563099；2.貴州省生物治療人才基地及遵義醫(yī)學(xué)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心，貴州 遵義563099；3.第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院 全軍腫瘤研究所，重慶404100)

[摘要]目的 觀察青蒿琥酯處理前后人肺腺癌PC9細胞增殖率的變化、對Axl與下游信號分子表達水平的變化及凋亡相關(guān)蛋白的影響。方法 用不同終濃度的青蒿琥酯分別處理PC9細胞，24、48、72 h后通過cck-8檢測細胞的增殖率。經(jīng)25 μmol/L及100 μmol/L青蒿琥酯分別處理PC9細胞48 h后用qRT-PCR檢測Axl、Akt mRNA的表達水平，用Western blot檢測Axl、Akt及凋亡相關(guān)蛋白的表達水平。結(jié)果 ①青蒿琥酯以劑量和時間依賴性地抑制PC9細胞的增殖，且凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、PARP表達上調(diào)。②用藥48 h后可以下調(diào)p-Axl、p-Akt的表達。結(jié)論 青蒿琥酯能抑制肺腺癌細胞的增殖，導(dǎo)致凋亡相關(guān)蛋白表達上調(diào)，且能下調(diào)Axl及下游信號分子Akt mRNA和蛋白的表達。

[關(guān)鍵詞]非小細胞肺癌；青蒿琥酯；增殖；凋亡；Axl

肺癌是死亡率最高的惡性腫瘤，在過去的40年，肺癌的5年生存率并沒有得到很大的改善，目前為17%左右[1],其中非小細胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer,NSCLC)占到80%左右[2]，而NSCLC中又以肺腺癌最常見，因此對肺腺癌發(fā)病機制以及體內(nèi)各基因的表達情況的研究有助于肺腺癌診斷、治療和新藥的研發(fā)。隨著醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)及相關(guān)技術(shù)的快速發(fā)展，人們逐漸找到了與NSCLC有關(guān)的關(guān)鍵基因，并開發(fā)出針對這些基因及調(diào)控靶點的抑制劑，其中靶向表皮生長因子受體(EGFR)和間變性淋巴瘤激酶(ALK)的酪氨酸激酶抑制劑(TKIs)已經(jīng)廣泛用于NSCLC的治療中，并取得了顯著的療效。除了EGFR和ALK外，有研究發(fā)現(xiàn)在肺腺癌的大多數(shù)病例中都存在Axl的激活[3]，其蛋白質(zhì)和mRNA水平與肺腺癌的不良預(yù)后有關(guān)[4]。Axl是一種酪氨酸激酶受體，它與配體生長停滯特異性基因6(Gas6)結(jié)合后可以導(dǎo)致酪氨酸自身磷酸化并且導(dǎo)致下游分子的磷酸化，磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/Ras相關(guān)的C3肉毒素底物1(PI3K/Akt/Rac1)是其中的一條下游信號途徑，可以促進細胞的增殖，抗凋亡及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)[5]。

研究顯示青蒿琥酯(一種青蒿提取物)除了具有傳統(tǒng)的抗瘧疾作用外，還可以從減緩腫瘤細胞的增殖、促進腫瘤細胞凋亡、阻止血管生成、防止腫瘤組織的侵襲和轉(zhuǎn)移4個方面來發(fā)揮其抗癌作用[6]。本課題組前期的研究也發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯可以抑制肺腺癌A549細胞的增殖及促進其凋亡[7]，但其具體機制仍不是很清楚，因此本文旨在探討青蒿琥酯發(fā)揮抗腫瘤的藥理作用與Axl及其下游信號途徑的關(guān)系。

1材料與方法

1.1細胞和試劑人肺腺癌PC9細胞由第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院全軍腫瘤研究所陳正堂教授惠贈，培養(yǎng)于含10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培養(yǎng)液中，在37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；青蒿琥酯購自Sigma Addinich公司；Cell Counting Kit-8(cck-8)試劑盒購自日本同仁公司，Axl、p-Axl、Akt、p-Akt及凋亡相關(guān)抗體購自英國abcam公司。

1.2細胞增殖測定實驗利用cck-8試劑盒檢測青蒿琥酯對肺腺癌PC9細胞增殖能力的影響。將指數(shù)生長期的PC9細胞以每孔5×103個細胞的密度，接種于96孔板，每孔100 μL，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，加入青蒿琥酯使其終濃度分別為0、6.25、12.5、25、50、100 μmol/L終體積150 μL，并設(shè)置調(diào)零孔(無細胞孔)、溶劑組(0.1%DMSO)、空白對照組，每個濃度重復(fù)3孔。分別培養(yǎng)24、48、72 h后，棄上清液，每孔加入不含F(xiàn)BS的RPMI-1640培養(yǎng)基，加入10 μL cck8，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1~4 h后，用酶標儀測波長490 nm處的吸光度(OD)值。

1.3RNA提取和qRT-PCR檢測分別收集青蒿琥酯25 μmol/L及100 μmol/L作用48 h及0.1%DMSO對照組的細胞，加入1 mL TRIzol試劑，室溫放置5 min，吸取細胞裂解液，加入200 μL氯仿，混勻，12 000 rpm在4 ℃離心15 min；離心后吸取上層液體，加入500 μL異丙醇，混勻，12 000 rpm在4 ℃離心10 min；棄上清，空氣干燥，加入適量DEPC水溶解沉淀，即為細胞總RNA；測量RNA濃度，以A(260/280)在1.8~2.0的總RNA為模版進行逆轉(zhuǎn)錄；采用SYBR Green PCR Master Mix進行qRT-PCR，使用β-actin作為mRNA定量的內(nèi)參，對RNA進行定量。mRNA表達水平以2-ΔΔCt表示，ΔΔCt=ΔCt實驗組-ΔCt對照組，ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因。

1.4Western Blot檢測細胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白、Axl及其下游信號分子的表達利用Western Blot實驗檢測青蒿琥酯對PC9細胞凋亡相關(guān)蛋白的影響。實驗分為0.1%DMSO對照組，青蒿琥酯25 μmol/L組和青蒿琥酯100 μmol/L組，用青蒿琥酯處理48 h后收集對數(shù)生長期的PC9細胞，棄去培養(yǎng)基，冷PBS洗2次，加入混合有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液裂解細胞，冰上靜置30 min，用細胞刮將細胞輕輕刮至EP管內(nèi)，4 ℃，12 000 rpm離心20 min，取少量上清BCA法測定蛋白濃度。用裂解液將蛋白調(diào)整至相同濃度，1∶4比例加入5x上樣緩沖液(碧云天)后，99 ℃金屬浴5 min，冷卻后上樣電泳。凋亡相關(guān)蛋白PARP、Cleaved PARP、caspase-3、active capase-3及Axl、p-Axl、Akt、p-Akt用10%的聚丙烯酰胺凝膠分離，采用Bio-Rad濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)進行轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗均以1∶1 000比例稀釋，4 ℃孵育過夜。經(jīng)TBST洗滌后，加入辣根過氧化物酶標記的特異性二抗以1∶5 000比例稀釋，搖床上孵育1 h，最后用ECL化學(xué)發(fā)光檢測，凝膠成像儀掃描。

2結(jié)果

2.1青蒿琥酯可以抑制肺腺癌PC9細胞的增殖能力

2.1.1青蒿琥酯對肺腺癌PC9細胞數(shù)量和形態(tài)學(xué)的影響用終濃度為25、50、100 μmol/L的青蒿琥酯作用于PC9細胞，48 h后在光學(xué)顯微鏡下觀察到和對照組(0.1%DMSO)相比，各用藥組的細胞數(shù)量明顯減少，細胞形態(tài)由短梭形逐漸變成不規(guī)則形或三角形，且隨著劑量的增加，數(shù)量減少得更明顯(見圖1)。

2.1.2采用cck-8法檢測青蒿琥酯對PC9細胞增殖能力的影響用終濃度為6.25、12.5、25、50、100 μmol/L作用于PC9細胞，24、48、72 h后測定490 nm波長的OD值，結(jié)果表明，各實驗組青蒿琥酯對PC9細胞均有抑制作用，并隨藥物濃度的增加抑制率顯著提高，其48 h的IC50大約為32.14±4.69 μM(見表1及圖2)。

A:0.1%DMSO對照; B:青蒿琥酯25 μmol/L組; C:青蒿琥酯50 μmol/L組; D:青蒿琥酯100 μmol/L組。圖1　光學(xué)顯微鏡下不同濃度青蒿琥酯處理作用于PC9細胞后的細胞數(shù)量及形態(tài)的變化(×40)

表1青蒿琥酯對PC9細胞增殖抑制效應(yīng)(%)

青蒿琥酯濃度(μM)24h48h72h96h6.256.59±5.696.12±6.859.64±13.0911.89±7.5112.59.73±7.4510.01±6.3012.99±12.9719.97±7.732511.91±7.2518.38±7.3718.25±12.5633.4±8.365019.75±12.0645.32±8.9660.52±8.8979.01±3.1310055.37±4.29*87.69±1.93*97.10±0.82*98.71±0.38*#

組內(nèi)差異 *P<0.05；組間差異 #P<0.05。

圖2　青蒿琥酯對PC9細胞的增殖抑制作用

2.2青蒿琥酯可以下調(diào)肺腺癌PC9細胞Akt和Axl mRNA的表達分別收集青蒿琥酯25、100 μmol/L作用48 h及0.1%DMSO對照組的細胞，提取總RNA后行Real-time RT-PCR檢測，通過ABI系統(tǒng)獲得細胞內(nèi)Axl和Akt基因的相對拷貝數(shù)。與對照組比較，青蒿琥酯作用后PC9細胞內(nèi)Axl和Akt mRNA的表達均較對照組降低，隨著青蒿琥酯劑量的增加，其降低更為顯著(P<0.01)，說明青蒿琥酯能下調(diào)PC9細胞內(nèi)Axl和Akt mRNA的表達(見圖3)。

與對照組比較，*P<0.05;**P<0.01。

圖3青蒿琥酯處理48h后PC9細胞中Axl和Akt mRNA的相對表達

2.3青蒿琥酯下調(diào)肺腺癌PC9細胞Akt和Axl蛋白及凋亡相關(guān)蛋白的表達

2.3.1青蒿琥酯可下調(diào)PC9細胞后Axl和Akt的磷酸化水平分別收集青蒿琥酯25、100 μmol/L作用48 h及0.1%DMSO對照組的細胞，提取總蛋白后Western blot檢測相關(guān)蛋白Axl、p-Axl、Akt、p-Akt表達的變化?？梢娗噍镧プ饔?8 h后PC9細胞內(nèi)Axl、Akt、p-Axl、p-Akt蛋白的表達較對照組均有不同程度的降低，且以p-Axl和p-Akt降低更為明顯(見圖4)。

圖4　青蒿琥酯處理48 h后PC9細胞中Axl、Akt及其磷酸化蛋白的表達水平

2.3.2青蒿琥酯可影響PC9細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達分別收集青蒿琥酯25、100 μmol/L作用48 h及0.1%DMSO對照組的細胞進行Western blot定量檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達。發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯作用48 h后Caspase-3、Active caspase-3、PARP、Cleaved PARP的表達水平均有不同情況的上調(diào)(見圖5)。

圖5　青蒿琥酯處理48 h后PC9細胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達水平

3討論

目前的多項研究顯示青蒿琥酯除了抗瘧疾作用外，還有廣闊的應(yīng)用前景，其對乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌等均具有細胞毒作用，可以從減緩腫瘤細胞的增殖、促進腫瘤細胞凋亡、阻止血管生成、防止腫瘤組織的侵襲和轉(zhuǎn)移四個方面來發(fā)揮抗癌作用[6]。本課題組前期的研究結(jié)果表明青蒿琥酯能以濃度和時間依賴性地抑制人肺腺癌A549細胞的生長和增殖，而且能劑量依賴性地誘導(dǎo)細胞凋亡。本研究采用cck8檢測不同濃度的青蒿琥酯處理PC9細胞24、48、72 h后也發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯能夠以濃度和時間依賴性地抑制PC9細胞生長和增殖。這表明青蒿琥酯對肺腺癌具有細胞毒作用，其可以減緩腫瘤細胞的增殖并促進腫瘤細胞的凋亡。

近年來，有不少研究對青蒿琥酯所致凋亡的分子機制進行了探討，目前的研究已證實青蒿琥酯對PI3K/Akt、NF-κB、MAPK、PKC、STATs等信號通路均有抑制作用，但是具體機制尚不清楚。既往多項研究顯示Axl在細胞增殖、遷移、擴散、抗凋亡、EMT等細胞活動中都發(fā)揮著重要的作用。Axl是一種原癌基因，位于19號染色體的長臂上，在大約60%的NSCLC細胞系中能觀察到Axl的過表達[8]，作為酪氨酸激酶受體，Axl與GAS6結(jié)合并且形成二聚體，導(dǎo)致酪氨酸的磷酸化及下游分子的磷酸化，Axl的下游分子有很多，包括PLCγ、MMMP-9、SOCS、PI3K/Akt、ERK1/2、SRC等[9-10]。Sun等發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌中Axl及Gas6表達明顯高于正常子宮內(nèi)膜，與凋亡細胞比例呈負相關(guān)，推測Gas6/Axl信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的異常激活與其抑制癌細胞凋亡有關(guān)[11]。Sawu等在胃癌MKN7細胞系中發(fā)現(xiàn)，Gas6/Axl信號途徑能夠啟動下游PI3K/Akt信號通路，阻止細胞啟動程序性死亡程序，抑制胃癌細胞凋亡[12]。

本研究中也發(fā)現(xiàn)在PC9細胞中存在Axl及下游信號分子Akt的過表達。因此本研究旨在探討青蒿琥酯的抗增殖和促凋亡的作用是否與Axl及下游信號分子相關(guān)。

首先采用qRT-PCR及Western Blot檢測不同濃度的青蒿琥酯處理后PC9細胞48 h中mRNA和蛋白的表達，結(jié)果表明，經(jīng)青蒿琥酯處理后，細胞內(nèi)Axl和Akt mRNA和蛋白水平均有不同程度的下調(diào)，同時其活化形式p-Axl和p-Akt的蛋白表達下調(diào)更明顯。然后采用Western Blot檢測不同濃度的青蒿琥酯處理PC9細胞48h后凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Active caspase-3、PARP、Cleaved PARP的表達情況，結(jié)果表明，經(jīng)青蒿琥酯處理后，細胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Active caspase-3、PARP、Cleaved PARP均存在不同程度的上調(diào)，其中Active caspase-3和Cleaved PARP上調(diào)更加明顯。我們推測PC9細胞中存在Axl的過表達，Axl的激活能夠啟動下游的PI3K/Akt信號通路，而青蒿琥酯能夠抑制Axl和Akt的活化，促進細胞啟動程序性死亡程序，促進肺癌細胞的凋亡。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，Axl參與了NSCLC的發(fā)生發(fā)展過程，而青蒿琥酯可以通過抑制Axl及其下游信號通路的活化來發(fā)揮抗腫瘤的作用，為青蒿琥酯成為候選抗腫瘤藥物提供了又一理論依據(jù)。

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[收稿2015-10-16;修回2015-11-12]

(編輯：王福軍)

The effects of Artesunate on the expression of Axl and its downstream signal molecules in PC9 lung adenocarcinoma cells

ZhangYu1,HanJing3,ZhouJianguo1,WangFei1,WangYi1,MaHu1,2,ChengZhengtang3

(1.Tumor Hospital of Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099，China; 2.Biological Treatment Talent Base of Guizhou Province and Translation Medicine Research Center of Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099，China;3.Cancer Research Institute, Xinqiao Hospital of Third Military Medical University, Chongqing 404100,China)

[Abstract]Objective To observe the changes of cell proliferation rate, apoptosis and Axl expression level before and after the treatment of Artesunate in human lung adenocarcinoma PC9 cells.Methods Different concentrations of Artesunate were used to treat PC9 cells. Cell proliferation was analyzed by the cck-8 assay after 24, 48 and 72h. The final concentration of Artesunate treatment PC9 cells were 25, 100 μmol/l, respectively. The mRNA expression levels of Axl and Akt were determined by qRT-PCR; The protein expression levels of Axl、Akt and apoptosis-related proteins by Western blot after 48h.Results (1)Artesunate could inhibit PC9 cell proliferation dependent on the dose and time. The expression of caspase-3 and PARP increased after 48h.(2)The mRNA and protein expression of p-Axl and p-Akt were reduced after 48h.Conclusion Artesunate could inhibit the proliferation of lung adenocarcinoma cancer cells, up-regulate apoptosis-related proteins, and down-regulate the mRNA and protein expression of Axl and Akt, Which are downstream signaling molecules.

[Key words]Non-Small Cell Lung Cancer； Artesunate； proliferation； apoptosis；Axl

[中圖法分類號]R734.2

[文獻標志碼]A

[文章編號]1000-2715(2015)06-0610-05

[通信作者]馬虎，男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：肺癌分子靶向治療，E-mail:mahuab@163.com。

[基金項目]國家自然科學(xué)基金資助項目(NO：81360351)；貴州省科技廳基金資助項目(NO：黔科合SY字[013]3003)；貴州省高層次創(chuàng)新人才“千”層次人才基地項目。