趙云紅　趙　敏　張　強(qiáng)　郝　芳

云南省腫瘤醫(yī)院昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院　650106

論著

S100A4和HIF-1α與卵巢漿液性囊腺癌預(yù)后的關(guān)系研究

趙云紅趙敏張強(qiáng)郝芳

云南省腫瘤醫(yī)院昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院650106

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，由于起病隱匿，缺乏早期特異性癥狀和早期有效的診斷篩查方法，85%病例在晚期才得以診斷，而5年生存率僅15%[1]，目前標(biāo)準(zhǔn)的治療方案是腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)以及以鉑類為基礎(chǔ)聯(lián)合化療，然而70%的晚期患者最終將復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，耐藥是導(dǎo)致其化療失敗的主要原因。S100A4是鈣離子結(jié)合蛋白，通過鈣離子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞黏附和運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞增殖分化、基因表達(dá)、酶的激活及細(xì)胞凋亡[2]。目前研究證實(shí)S100A4 可在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，且與浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。HIF-1α是介導(dǎo)哺乳動(dòng)物和人類細(xì)胞缺氧反應(yīng)的核轉(zhuǎn)錄因子[3]，在低氧環(huán)境下HIF-1α可以激活產(chǎn)生多種靶基因產(chǎn)物，促進(jìn)腫瘤血管生成、能量代謝、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移、腫瘤生存和增殖、放化療耐受性、免疫逃逸等[4]；本研究檢測(cè)卵巢漿液性囊腺癌中S100A4與HIF-1α的表達(dá)情況，旨在進(jìn)一步探討S100A4和HIF-1α與卵巢漿液性囊腺癌鉑類化療耐藥和生存期的關(guān)系。

1資料與方法

1.1一般資料收集2007-2010年期間在我院首次手術(shù)并確診的卵巢漿液性囊腺癌初治患者50例，同時(shí)收集卵巢漿液性囊腺瘤28例和正常卵巢組織15例(因子宮肌瘤行子宮、雙附件/單側(cè)附件切除術(shù)患者)作為對(duì)照。所有卵巢漿液性囊腺癌病例術(shù)后均予鉑類為基礎(chǔ)的多藥聯(lián)合化療，主要化療方案為PC和TC方案，給藥途徑為靜脈化療和腹腔化療，療程為4～10個(gè)不等。參照2010年版NCCN卵巢癌臨床實(shí)踐指南對(duì)鉑類耐藥和鉑類敏感的定義，50例患者中28例為鉑耐藥患者(22/28,78.6%)，22例為鉑敏感患者(10/22,45.5%)。50例卵巢漿液性囊腺癌患者均以電話或來(lái)院復(fù)查方式進(jìn)行隨訪，隨訪截止時(shí)間為2014年4月。試劑：(1)S100A4濃縮型兔抗人單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Epitomics公司。(2)HIF-1α濃縮型鼠抗人單克隆抗體購(gòu)于Merck Millipore公司。PBS緩沖液、抗原修復(fù)液、DAB顯色劑購(gòu)于福建邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學(xué)法。所有組織標(biāo)本均經(jīng)甲醛固定，石蠟包埋，制備4μm厚切片，恒溫箱60℃內(nèi)烤片過夜，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，3%H2O2溶液室溫下孵育10min，微波抗原修復(fù)15min，正常山羊血清封閉30min、一抗(工作濃度S100A4 1∶1 000；HIF-1α 1∶100) 4℃孵育過夜, 37℃復(fù)溫45min后加即用型二抗工作液，室溫下孵育15min，DAB顯色、自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染1~1.5min，0.1%鹽酸酒精分化，PBS返藍(lán)10~15min。常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片。S100A4用已知扁桃體S100A4陽(yáng)性標(biāo)本作為陽(yáng)性對(duì)照；HIF-1α用已知乳腺癌HIF-1α陽(yáng)性標(biāo)本作為陽(yáng)性對(duì)照，用PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.2.2評(píng)分方法。采用綜合計(jì)分法[5]，無(wú)色為0分，著色弱但明顯強(qiáng)于陰性對(duì)照者為1分，染色清晰者為2分，強(qiáng)染色為3分。陽(yáng)性細(xì)胞率即陽(yáng)性細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞的比例，以隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)高倍視野細(xì)胞為準(zhǔn)：陽(yáng)性細(xì)胞<5%為0分，5%~25%為1分，26%~50%為2分，51%~75%為3分，>75%為4分。兩項(xiàng)乘積1~2分為陰性，3分及以上為陽(yáng)性，無(wú)論染色強(qiáng)度如何，細(xì)胞陽(yáng)性率<10%為陰性。

2結(jié)果

2.1S100A4和HIF-1α蛋白的表達(dá)S100A4在卵巢漿液性囊腺癌組織和部分卵巢漿液性囊腺瘤組織中呈胞核和/或胞漿著淺黃色至棕黃色顆粒表達(dá)；HIF-1α在卵巢漿液性囊腺癌組織中呈胞核和/或胞漿著淺黃色至棕黃色顆粒表達(dá)，見圖1、2和表1。

圖1　S100A4蛋白陽(yáng)性表達(dá)(×400)

圖2　HIF-1α蛋白陽(yáng)性表達(dá)(×400)

組別nS100A4蛋白表達(dá)陽(yáng)性陰性陽(yáng)性表達(dá)率(%)HIF-1α蛋白表達(dá)陽(yáng)性陰性陽(yáng)性表達(dá)率(%)卵巢漿液性囊腺癌5041982.0△▲321864△▲卵巢漿液性囊腺瘤2832510.7#0280 正常卵巢1501500150

注：良性與正常組比較,#P>0.05；惡性與正常組比較,△P<0.001；惡性與良性組比較,▲P<0.001。

2.2S100A4和HIF-1α蛋白表達(dá)的相關(guān)性卵巢漿液性囊腺癌中的S100A4蛋白表達(dá)與HIF-1α蛋白表達(dá)進(jìn)行配對(duì)卡方檢驗(yàn)(χ2=8.315，P=0.004)(見表2)，兩種蛋白表達(dá)存在關(guān)聯(lián)性。進(jìn)一步Spearman相關(guān)性分析(r=0.408，P=0.003)，說(shuō)明兩種蛋白表達(dá)存在顯著正相關(guān)性。

表2　S100A4蛋白表達(dá)與HIF-1α蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析

2.3S100A4和HIF-1α與卵巢漿液性囊腺癌鉑化療耐藥和生存時(shí)間的關(guān)系鉑類化療耐藥組中S100A4陽(yáng)性表達(dá)率為89.29%(25/28)，與敏感組(72.73%，16/22)，差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；鉑類化療耐藥組中HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)率為78.57%(22/28)，與敏感組(45.45%，10/22)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。S100A4與HIF-1α聯(lián)合表達(dá)在鉑化療耐藥中P<0.005,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表3)。

2.4S100A4蛋白與HIF-1α蛋白的表達(dá)與患者生存期的關(guān)系S100A4蛋白和HIF-1α蛋白陽(yáng)性表達(dá)患者的生存時(shí)間較陰性者明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3、4。

圖3S100A4蛋白表達(dá)與生存時(shí)間的關(guān)系

圖4　HIF-1α蛋白表達(dá)與生存時(shí)間的關(guān)系

3討論

S100A4是鈣離子結(jié)合蛋白S100家族的24個(gè)成員之一[2]，分子量為 11.5KD，由101個(gè)氨基酸組成的多肽。編碼基因定位于1q21，該區(qū)穩(wěn)定性差，易發(fā)生各種染色體的缺失、易位、重疊等改變。近年研究發(fā)現(xiàn)，S100A4蛋白參與了細(xì)胞異常增生、細(xì)胞惡變、瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性增強(qiáng)、細(xì)胞間黏附力降低、浸潤(rùn)力增強(qiáng)、促新生血管生長(zhǎng)等過程，與惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有著密不可分的聯(lián)系[6]。 S100A4 可在多種惡性腫瘤中高表達(dá)。本研究中，S100A4蛋白在卵巢漿液性囊腺瘤組織標(biāo)本中低表達(dá)，正常卵巢組織標(biāo)本中無(wú)表達(dá)，而在卵巢漿液性囊腺癌組織中呈高表達(dá)，提示S100A4 蛋白可能參與了卵巢漿液性囊腺癌發(fā)生發(fā)展過程。Chen等[7]siRNA沉默S100A4基因在食管鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力明顯降低。Mencia等[8]研究證實(shí)，S100A4在甲氨蝶呤耐藥細(xì)胞系中高表達(dá)，與結(jié)腸癌甲氨蝶呤化療敏感度相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)鉑類化療耐藥患者中S100A4陽(yáng)性表達(dá)率與敏感患者的陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但聯(lián)合HIF-1α表達(dá)后與患者的化療耐藥顯著相關(guān)，這可能與本研究病例偏少有關(guān)，有待擴(kuò)大病例進(jìn)一步研究。同時(shí)， S100A4低表達(dá)的患者生存期較高表達(dá)者明顯延長(zhǎng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

缺氧誘導(dǎo)因子-1(Hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)是介導(dǎo)哺乳動(dòng)物和人類細(xì)胞缺氧反應(yīng)的核轉(zhuǎn)錄因子[9]由α和β亞單位組成， HIF-1α是缺氧調(diào)節(jié)的功能亞單位[10]。腫瘤細(xì)胞的無(wú)限增殖常常使腫瘤處于缺氧狀態(tài)，低氧是惡性腫瘤存在的一個(gè)重要的微環(huán)境。近年研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α參與了促進(jìn)多種腫瘤生長(zhǎng)[11]、血管生成和侵襲轉(zhuǎn)移的過程[12]。本研究結(jié)果顯示，HIF-1α在卵巢漿液性囊腺癌組織標(biāo)本中高表達(dá)，與正常卵巢組織和卵巢漿液性囊腺瘤組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。聶春蓮等[13]研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào) HIF-1α的表達(dá)，結(jié)果癌細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性顯著增高。本研究發(fā)現(xiàn)化療耐藥者HIF-1α的表達(dá)明顯高于敏感者(P<0.05)，低表達(dá)HIF-1α的患者生存期較高表達(dá)者明顯延長(zhǎng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Horiuchi等[14]研究發(fā)現(xiàn)缺氧能夠誘導(dǎo)S100A4的表達(dá)， S100A4被siRNA抑制后，缺氧條件下，S100A4表達(dá)增加，并且侵襲力也增加。S100A4和HIF-1α之間可能存在著某種相互作用的機(jī)制，本研究發(fā)現(xiàn)，S100A4和HIF-1α的表達(dá)不僅呈明顯正相關(guān)(r=0.408，P=0.003)，并且兩因子的聯(lián)合表達(dá)與卵巢漿液性囊腺癌患者的鉑化療耐藥有關(guān)(P<0.05)。提示S100A4與HIF-1α高表達(dá)可能是卵巢漿液性囊腺癌發(fā)生和進(jìn)展過程中的重要分子事件，可能是影響卵巢漿液性囊腺癌的鉑化療耐藥重要因素。

綜上所述，S100A4和HIF-1α有望作為一個(gè)分子指標(biāo)，對(duì)預(yù)測(cè)腫瘤鉑化療藥物敏感度和判斷預(yù)后具有一定的臨床指導(dǎo)價(jià)值。

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(編輯落落)

摘要目的：探討S100A4和HIF-1α與卵巢漿液性囊腺癌預(yù)后的關(guān)系。方法：收集50例卵巢漿液性囊腺癌，28例卵巢漿液性囊腺瘤和15例正常卵巢組織為對(duì)照，采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)S100A4和HIF-1α的表達(dá)，并分析與患者預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果：S100A4和HIF-1α在卵巢漿液性囊腺癌組織中高表達(dá)，而在卵巢漿液性囊腺瘤組和正常卵巢組中低表達(dá)或不表達(dá)。S100A4與HIF-1α表達(dá)呈顯著正相關(guān)性。S100A4與鉑化療耐藥無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，HIF-1α與鉑化療耐藥有密切關(guān)系(P<0.05)。 S100A4和HIF-1α同時(shí)表達(dá)與鉑化療耐藥密切相關(guān)(P<0.05)；同時(shí)S100A4和HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)患者的生存時(shí)間較陰性者明顯減少(P<0.05)。結(jié)論：S100A4和HIF-1α的表達(dá)促進(jìn)卵巢漿液性囊腺癌的發(fā)生發(fā)展，并且與患者鉑化療耐藥和生存時(shí)間相關(guān)。

關(guān)鍵詞卵巢漿液性囊腺癌S100A4HIF-1α免疫組化

Expression and Clinical Significance of S100A4 and HIF-1α Protein in Ovarian Serous Cystadenocarcinoma

ZHAO Yunhong, ZHAO Ming,ZHANG Qiang，etal.TheThirdAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,KunmingCity,YunnanProvince650106

ABSTRACTObjective:To study the expression of S100A4 and HIF-1α protein in Ovarian Serous Cystadenocarcinoma，analyzed the relationship between the two proteins.Methods:Immunohistochemistry method was used to detect S100A4 and HIF-1α proteins expression and analysis the correlation of proteins expression in Ovarian Serous Cystadenocarcinoma.Results:S100A4 and HIF-1α in Ovarian Serous Cystadenocarcinoma showed a high expression. S100A4 protein expression in Ovarian Serous carcinoma was positive relation with HIF-1α protein expression.The expression of S100A4 and HIF-1α protein existed intimate relation with cisplatin-based chemotherapy resistance (P<0.05).They are associated with overall survival,longer the overall survival,lower the expression (P<0.05).Conclusion:Expression of S100A4 and HIF-1α existed significant positive correlation.High S100A4 and HIF-1α expression predicts cisplatin-based chemotherapy resistance and the overall survival in Ovarian Serous Cystadenocarcinoma.

KEY WORDSOvarian Serous Cystadenocarcinoma，S100A4 and HIF-1α，Immunohistochemistry, Chemotherapy resistance

收稿日期2014-10-11

中圖分類號(hào)：R737.31

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-7585(2015)01-0015-04