張　妍,許　可,高　超,楊　軍

(南開(kāi)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 生物活性材料教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300071)

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特約專欄

第一作者：張妍，女，1988年生，博士研究生

基于融合蛋白的生物材料及其在組織工程中的應(yīng)用

張妍,許可,高超,楊軍

(南開(kāi)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 生物活性材料教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300071)

摘要：模似生物體組織的結(jié)構(gòu)與狀態(tài)、研制細(xì)胞與支架材料三維復(fù)合體，將有望開(kāi)發(fā)出用于修復(fù)受損組織和器官的生物替代品。細(xì)胞的正常生物活動(dòng)需要來(lái)自細(xì)胞外微環(huán)境中的信號(hào)分子持續(xù)刺激。作為人工細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分，材料的物理及化學(xué)信號(hào)能夠影響細(xì)胞基因及蛋白表達(dá)，但遠(yuǎn)不足以達(dá)到體外重建組織器官的長(zhǎng)遠(yuǎn)目標(biāo)。利用基因與蛋白質(zhì)工程技術(shù)對(duì)天然蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行融合改造，設(shè)計(jì)并生物合成具有多重結(jié)構(gòu)與功能的融合蛋白生物材料,可用于改善天然或化學(xué)合成生物材料的生物活性。綜述了國(guó)內(nèi)外基于融合蛋白的生物材料發(fā)展動(dòng)態(tài)，概括了融合蛋白的設(shè)計(jì)思路與制備技術(shù)，重點(diǎn)詳述了與細(xì)胞生長(zhǎng)因子以及細(xì)胞粘附因子相關(guān)的融合蛋白在組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：融合蛋白；組織工程；細(xì)胞外基質(zhì)；細(xì)胞外微環(huán)境；血管化；干細(xì)胞

1前言

組織工程的核心是建立由細(xì)胞和生物材料構(gòu)成的功能化三維復(fù)合體[1]。生物材料作為人工細(xì)胞外基質(zhì)，形成了組織工程種子細(xì)胞的細(xì)胞外微環(huán)境模板。材料本體及其表面理化性質(zhì)誘導(dǎo)產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)不僅決定了生物材料的安全性，也對(duì)細(xì)胞的形態(tài)、增殖與分化以及組織結(jié)構(gòu)、功能的修復(fù)與重建具有重要的調(diào)控作用[2]。隨著組織工程和再生醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展，設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)具有良好生物相容性、結(jié)構(gòu)與功能仿生天然細(xì)胞外基質(zhì)的生物材料，正在成為材料科學(xué)和生命科學(xué)共同關(guān)注的研究熱點(diǎn)。

縱觀生物材料的發(fā)展，經(jīng)歷了第一代惰性材料，第二代具有活性或降解性質(zhì)的材料，現(xiàn)已發(fā)展到兼具可降解和生物活性的第三代生物材料，并開(kāi)始從生命科學(xué)的角度研究和設(shè)計(jì)生物材料的分子結(jié)構(gòu)與功能[3]。其中，蛋白質(zhì)是以氨基酸為基本單位構(gòu)成的具有一定空間結(jié)構(gòu)的天然高分子，是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者。機(jī)體內(nèi)細(xì)胞外微環(huán)境中各種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、酶以及多種細(xì)胞因子等蛋白組分，通過(guò)協(xié)同調(diào)控多個(gè)細(xì)胞信號(hào)通路，參與組織器官的發(fā)生、發(fā)育以及功能表達(dá)、修復(fù)等一系列生命活動(dòng)，是人體組織更新和修補(bǔ)的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。通過(guò)組織和細(xì)胞水平上的生物操作，模擬自然組織的結(jié)構(gòu)與狀態(tài)，將細(xì)胞與天然或人工合成的支架材料結(jié)合起來(lái)，將有望研發(fā)出用于修復(fù)或改善缺損組織和器官的生物替代品(圖1)[4]。目前，已有多種蛋白(如膠原、纖維蛋白、細(xì)胞生長(zhǎng)因子等)廣泛用于組織工程支架的研究，表現(xiàn)出改善組織工程支架與種子細(xì)胞的相互作用，促進(jìn)并誘導(dǎo)組織再生及其結(jié)構(gòu)與功能的重建的優(yōu)良性質(zhì)。然而天然蛋白多由動(dòng)物組織分離提純獲得，且病毒感染、抗原反應(yīng)、結(jié)構(gòu)與功能的穩(wěn)定性和機(jī)械強(qiáng)度不足等問(wèn)題，仍始終制約著天然蛋白在組織工程中的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)與應(yīng)用[5]。

圖1　仿生構(gòu)建細(xì)胞外基質(zhì)調(diào)控細(xì)胞行為示意圖[4]Fig.1　Schematic diagram of biomimetic extracellular matrix regulating cell behavior[4]

近年，基于基因和蛋白質(zhì)工程原理與技術(shù)，人們根據(jù)特定組織的需要(如目標(biāo)蛋白的分子量大小、序列、功能組成等)將編碼目標(biāo)蛋白的DNA分子進(jìn)行“剪切”、“拼接”設(shè)計(jì)重組基因序列，不僅實(shí)現(xiàn)了生物合成具有可控結(jié)構(gòu)與多重功能的融合蛋白，并且其用于制備具有特定生物學(xué)功能的仿生人工細(xì)胞外基質(zhì)的研究，也取得了很大進(jìn)展，為人們體外構(gòu)建功能性組織或器官提供了新的發(fā)展機(jī)遇[6]。如今已經(jīng)得到學(xué)者普遍關(guān)注的的融合蛋白主要有結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成的融合蛋白(如具有彈性蛋白、絲蛋白特性的重組蛋白)、細(xì)胞生長(zhǎng)因子的融合蛋白、以及細(xì)胞粘附因子(如整合素、Ca粘素等)的融合蛋白[7]。本文將重點(diǎn)介紹基于細(xì)胞生長(zhǎng)因子以及細(xì)胞粘附因子融合蛋白的生物材料及其在組織工程中的應(yīng)用。

2基于融合蛋白的生物材料結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)與制備

用于組織工程的材料不僅為組織再生提供結(jié)構(gòu)支持，還要綜合考慮體內(nèi)溫度、pH及細(xì)胞粘附、增殖、遷移等因素，并應(yīng)滿足細(xì)胞增殖與材料降解的動(dòng)態(tài)平衡[8]。基于蛋白的生物材料能夠以生物化學(xué)信號(hào)引導(dǎo)細(xì)胞行為，因而其生物活性片段的種類、結(jié)構(gòu)、結(jié)合及釋放的調(diào)控在材料開(kāi)發(fā)過(guò)程中均至關(guān)重要。蛋白材料用于生物材料的生物功能化改性方法主要有物理吸附、共價(jià)固定、材料包封等，但這些方法均有明顯的缺陷。在自組裝和生物技術(shù)領(lǐng)域，重組DNA的方法為新一代蛋白質(zhì)生物材料的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)(圖2)[9]。目前常用的融合蛋白生物材料主要有以下3種設(shè)計(jì)思路：①改變粘附蛋白及多肽片段的種類；②調(diào)整蛋白及多肽片段的密度和空間分布；③優(yōu)化蛋白及多肽片段的時(shí)間可控性。

2.1融合蛋白的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)

圖2　模擬天然ECM構(gòu)建復(fù)雜生物材料的設(shè)計(jì)策略[9]Fig.2　Design strategies for the creation of synthetic biomolecular materials that mimic the complexity of natural ECMs[9]

構(gòu)建融合蛋白的基本方法是將具有特定功能的天然或人工編碼的多肽序列模塊化,并使用基因編碼的DNA序列模板合成[10]，隨后將第1個(gè)蛋白的終止密碼子刪除，再接上帶有終止密碼子的第2個(gè)蛋白基因，以實(shí)現(xiàn)兩個(gè)基因的共同表達(dá)。通過(guò)控制每一個(gè)功能肽模塊在整體蛋白材料中的確切位置和密度，人們便能夠根據(jù)實(shí)際需要改變?nèi)诤系鞍椎慕M成。融合蛋白的設(shè)計(jì)大致分為基于重復(fù)結(jié)構(gòu)、基于生長(zhǎng)因子以及基于細(xì)胞粘附分子3類(表1[11])。第1類融合蛋白中最典型的是來(lái)源于彈性蛋白(Elastin-Like Polymers，ELPs)及絲素蛋白(Silk-Like Polymers，SLPs)的融合蛋白。ELPs是一種由數(shù)個(gè)重復(fù)的氨基酸序列組成的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，由兩種短肽段交替排列構(gòu)成，主要包括VPGZG、VPGVG、APGVGV、VPGFGCGAG以及VPGG等5種[12]。最著名的當(dāng)屬VPGZG

融合蛋白(Z可換為除了脯氨酸外任意氨基酸)。重復(fù)的VPGVG序列能夠使融合蛋白具有溫敏特性[13]，將溫敏性ELP與化學(xué)、酶、物理等多種交聯(lián)方式的水凝膠結(jié)合起來(lái)能夠衍生出多種應(yīng)用方式。ELPs主要由甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸組成，極易形成反向平行的β-折疊片層結(jié)構(gòu)，具有多樣側(cè)鏈化學(xué)修飾位點(diǎn)，良好的熱穩(wěn)定性和機(jī)械性能，在生物醫(yī)學(xué)上常用作手術(shù)縫合線，人工皮膚及軟骨修復(fù)材料[14]。對(duì)于此類融合蛋白，只需通過(guò)調(diào)節(jié)其氨基酸序列和分子鏈長(zhǎng)度，便能夠精確控制其對(duì)溫度、pH、離子強(qiáng)度的響應(yīng)敏感性，從而實(shí)現(xiàn)可逆的溶解轉(zhuǎn)變[15]。

表1　蛋白質(zhì)工程生物材料中常用的肽段序列[11]

目前對(duì)于生長(zhǎng)因子及細(xì)胞粘附因子功能域多肽的篩選研究尚未取得突破，因此基于全長(zhǎng)蛋白分子的融合蛋白，通過(guò)具有特異材料親和性的蛋白片段賦予其新功能的設(shè)計(jì)理念仍屬主流。例如，將蛋白分子連接在膠原蛋白結(jié)合域[16]和免疫球蛋白Fc段[17]上制備的融合蛋白，不僅能提高蛋白與多種支架材料親和性，還能夠大大延長(zhǎng)這些因子的半衰期，并使其長(zhǎng)期發(fā)揮效用。膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，作為細(xì)胞生長(zhǎng)的依附與支架，能誘導(dǎo)上皮細(xì)胞等的增殖和分化。在膠原酶的膠原結(jié)合區(qū)中有一段肽序列為 TKKTLRT，具有特異的膠原結(jié)合能力，被命名為膠原結(jié)合區(qū) (Collagen Binding Domain, CBD)。采用基因工程的方法，在生長(zhǎng)因子上融合CBD能夠賦予生長(zhǎng)因子更強(qiáng)的特異結(jié)合膠原蛋白的能力。從而制備適用于不同組織損傷修復(fù)的功能性膠原生物材料[18]。基于以上原理，戴建武教授課題組[19]進(jìn)一步開(kāi)發(fā)出能夠特異性結(jié)合細(xì)胞外間質(zhì)中一種非膠原性結(jié)構(gòu)蛋白——層連蛋白的多肽片段(Laminin Binding Domain, LBD)用以融合蛋白設(shè)計(jì)，并將其應(yīng)用于大鼠坐骨神經(jīng)損傷模型，表明該片段能夠維持神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)的活性，并定位于天然神經(jīng)細(xì)胞外基質(zhì)成分的層粘連蛋白且持續(xù)集中在神經(jīng)損傷部位，以提高周圍神經(jīng)再生(圖3)。免疫球蛋白(IgG)，由4條肽鏈組成的對(duì)稱結(jié)構(gòu)組成。4條肽鏈有兩條重鏈和兩條輕鏈，鏈間具有二硫鍵，根據(jù)各結(jié)構(gòu)的氨基酸組成和功能的不同，分為可變區(qū)和恒定區(qū)，位于肽鏈N端的是可變區(qū)結(jié)合抗原，恒定區(qū)在肽鏈C端，稱為Fc段。Fc段可與其他多種蛋白結(jié)合，構(gòu)建基于Fc的融合蛋白，可作為純化標(biāo)簽使用，半衰期持久，可介導(dǎo)ADCC及CDC作用 ，在藥物和疫苗研發(fā)、蛋白純化等諸多領(lǐng)域有著十分廣泛的應(yīng)用[20]。

圖3　坐骨神經(jīng)損傷大鼠植入材料7 d后神經(jīng)恢復(fù)情況[19]Fig.3　Recovery of sciatic injury rat after biomaterials implanted for 7 d[19]

2.2融合蛋白的制備

基于重復(fù)結(jié)構(gòu)的融合蛋白大多為短肽，不具有復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)，因此只需簡(jiǎn)單的多肽合成過(guò)程即可獲得目標(biāo)蛋白。由單個(gè)氨基酸合成多肽主要通過(guò)兩個(gè)氨基酸之間脫水形成肽鍵來(lái)實(shí)現(xiàn)，主要包括以下基本步驟：首先對(duì)兩性離子結(jié)構(gòu)的氨基酸進(jìn)行相應(yīng)的氨基或梭基保護(hù)，其次將羧基活化為活性中間體，待耦合過(guò)程結(jié)束后，對(duì)肽鏈上氨基酸的保護(hù)基團(tuán)選擇相應(yīng)的方式進(jìn)行選擇性的脫除或者是全脫除。目前常用的多肽合成方法為液相合成和固相合成兩種。液相合成法是將所需的氨基酸配制成溶液，并對(duì)其中一個(gè)氨基酸的氨基、其余氨基酸的羧基和不參與反應(yīng)的側(cè)鏈基團(tuán)進(jìn)行化學(xué)基團(tuán)保護(hù)，只活化參加反應(yīng)的氨基酸的羧基，待耦合反應(yīng)完成后再將沒(méi)有參加反應(yīng)的原料、活化劑等分離除去，得到純化多肽產(chǎn)物。這種方法雖然操作繁瑣，卻具有目標(biāo)產(chǎn)物純度高的優(yōu)勢(shì)。而固相合成法，則是將多肽序列C端的第1個(gè)氨基酸的羧基通過(guò)酯化反應(yīng)固定于不溶性的樹(shù)脂上，進(jìn)而以此氨基酸作為氨基組分，脫除其氨基保護(hù)基團(tuán)并同過(guò)量的活化后的羧基組分耦合形成肽鍵，重復(fù)脫保護(hù)、縮合、洗滌過(guò)程持續(xù)合成，獲得所需的肽鏈。合成完成后，再試用三氟乙酸將產(chǎn)物從樹(shù)脂上切割下來(lái)，同時(shí)脫除所有保護(hù)基團(tuán)，純化回收獲得所需多肽[21]。

相對(duì)來(lái)說(shuō)，具有一定空間結(jié)構(gòu)且序列復(fù)雜的其他兩種融合蛋白的合成過(guò)程則復(fù)雜得多。精確構(gòu)建所需DNA模版是保證融合蛋白多樣性及穩(wěn)定性的基礎(chǔ)。在獲得目標(biāo)DNA序列后，將其連接進(jìn)入特定的載體之中,以獲得充足融合蛋白質(zhì)粒,見(jiàn)圖4[22]。由于遺傳基因的簡(jiǎn)并性，同一種融合蛋白可對(duì)應(yīng)著多種DNA序列，但序列合成蛋白效率卻與擴(kuò)增時(shí)選取的宿主種類有關(guān)(大腸桿菌、酵母菌及真核細(xì)胞等)。例如，“AAG及AGA”片段如果出現(xiàn)在需要使用大腸桿菌表達(dá)體系的質(zhì)粒中便會(huì)大大影響蛋白產(chǎn)率[23]。當(dāng)然，重組質(zhì)粒中密碼子的優(yōu)化還有許多影響因素——密碼子偏倚、tRNA可用性、mRNA穩(wěn)定性和mRNA結(jié)構(gòu)都在基因表達(dá)中起重要作用，而且選擇DNA片段時(shí)也應(yīng)盡量避免在重組基因載體中存在高度重復(fù)的部分以避免發(fā)生錯(cuò)配，影響mRNA轉(zhuǎn)錄[24]。

圖4　重組融合蛋白制備與應(yīng)用流程[22]Fig.4　Flow chart of the preparation and application of recombinant fusion protein[22]

最優(yōu)化后的DNA序列需要引入到合適的生物體中表達(dá)。大腸桿菌是目前最常用的表達(dá)系統(tǒng)，相對(duì)便宜、擴(kuò)增迅速，并且可以通過(guò)基因修飾提高蛋白表達(dá)水平。但由于大腸桿菌為原核生物，沒(méi)有高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)，無(wú)法對(duì)重組蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后修飾(糖基化)，且重組蛋白過(guò)表達(dá)會(huì)產(chǎn)生包涵體，需進(jìn)一步處理以恢復(fù)蛋白活性。酵母菌也是廣泛應(yīng)用于重組蛋白表達(dá)的宿主，同樣具有易于擴(kuò)增、費(fèi)用低廉的優(yōu)勢(shì)，屬真核表達(dá)體系，能夠?qū)χ亟M蛋白進(jìn)行修飾。但酵母菌的蛋白糖基化仍與哺乳動(dòng)物有較大差異，使用昆蟲(chóng)細(xì)胞及哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的重組融合蛋白往往與天然蛋白的結(jié)構(gòu)和功能更為接近[25]。一般來(lái)說(shuō)，重組融合蛋白的表達(dá)效果越好，所需的轉(zhuǎn)染及細(xì)胞擴(kuò)增過(guò)程便越復(fù)雜，所需時(shí)間和成本也就越高。

3基于融合蛋白的生物材料在組織工程中的應(yīng)用

3.1基于細(xì)胞生長(zhǎng)因子的融合蛋白生物材料在組織工程中的應(yīng)用

正常細(xì)胞的生物活動(dòng)受到細(xì)胞外微環(huán)境中信號(hào)分子的持續(xù)刺激與調(diào)控，同時(shí)細(xì)胞也會(huì)通過(guò)分泌多種因子，使其微環(huán)境更利于其增殖、分化及功能表達(dá)[26]。生長(zhǎng)因子作為細(xì)胞之間的信號(hào)傳導(dǎo)分子調(diào)控多種細(xì)胞行為，其由多種細(xì)胞分泌，并與靶細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合而發(fā)揮作用，能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化和功能表達(dá)，在傷口愈合和組織再生過(guò)程中具有重要作用[27]。然而，大多數(shù)生長(zhǎng)因子在體內(nèi)均具有容易自由擴(kuò)散且難以長(zhǎng)期保持穩(wěn)定的特點(diǎn)，在機(jī)體內(nèi)存在潛在的風(fēng)險(xiǎn)，并影響組織修復(fù)[28]。如圖5所示，將生長(zhǎng)因子固定于生物材料的本體或表面，能夠顯著改善其穩(wěn)定性并控制其定量持續(xù)對(duì)細(xì)胞形成刺激[29]。

圖5　材料表面固定化生長(zhǎng)因子與細(xì)胞相互作用示意圖[29]　Fig.5　Schematic diagram of cell interactions with surface immobilized growth factors[29]

3.1.1EGF融合蛋白

EGF(表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子)是由53個(gè)氨基酸組成的單鏈多肽，能夠啟動(dòng)DNA復(fù)制，促進(jìn)細(xì)胞增殖及蛋白合成，促進(jìn)傷口愈合及上皮組織角質(zhì)化[30]。由于表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)在腫瘤生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著重要作用，并在相當(dāng)一部分人類腫瘤中均有表達(dá)，其配體EGF更多地應(yīng)用在抗癌藥物靶標(biāo)，應(yīng)用于腫瘤靶向治療。Yang Xiaoping[31]等將EGF與改性白喉毒素(Diphtheria Toxin，DT)通過(guò)組-丙氨酸相連，所得融合蛋白能夠?qū)υ缙诎螂装┘?xì)胞進(jìn)行靶向定位和治療，經(jīng)由動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明有效且無(wú)全身毒性反應(yīng)。Lan Keng-Li[32]等構(gòu)建了具有放射性標(biāo)記的VEGF-EGF融合蛋白并作為雙靶向劑用于癌癥診斷和治療，也取得了相似結(jié)論。

3.1.2FGF融合蛋白

bFGF(堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)是由150～200個(gè)氨基酸組成的多肽，相互之間的氨基酸序列有20%～50%是相同的,其中心區(qū)域有大約120個(gè)氨基酸序列存在高度的同源性。它是一種重要的信號(hào)分子，參與調(diào)控許多胚胎發(fā)育和器官形成過(guò)程，如原腸胚時(shí)期細(xì)胞遷移，中胚層形成，以及腦、肺、腎、肢體等器官發(fā)育[33]。同時(shí)，它也具有促進(jìn)纖維原細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用，調(diào)控組織創(chuàng)傷修復(fù)。Hashi H實(shí)驗(yàn)室[34]構(gòu)建了由纖連蛋白和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的細(xì)胞結(jié)合結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，并將其固定于培養(yǎng)皿表面以及膠原水凝膠中,用于HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該融合蛋白能夠刺激HUVEC的生長(zhǎng)并刺激雞胚中絨毛尿囊膜的血管生成。有學(xué)者將膠原蛋白結(jié)合域(Collagen Binding Domain，CBD)與bFGF結(jié)合起來(lái)制備CB-bFGF融合蛋白，能夠在體外培養(yǎng)中促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖，且在與可注射的膠原蛋白粉末混合后用以治療鼠骨折，較單純使用bFGF用量更低，效果更佳[35-36]。

3.1.3HGF融合蛋白

HGF(肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子)是一種旁分泌細(xì)胞因子，是具有調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、形態(tài)、粘附、遷移等功能的多效生長(zhǎng)因子，參與胚胎器官發(fā)育、成人組織再生及傷口愈合過(guò)程。此外，HGF與其受體c-Met與癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移也高度相關(guān)[37]。日本Takashi Kitajima實(shí)驗(yàn)室[38]將HGF與膠原結(jié)合域結(jié)合起來(lái)構(gòu)建CBD-HGF融合蛋白。實(shí)驗(yàn)表明，相較于液態(tài)添加HGF，固定化CBD-HGF可穩(wěn)定融合生長(zhǎng)因子結(jié)構(gòu)、延長(zhǎng)因子活性、更長(zhǎng)時(shí)間地促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)生長(zhǎng)。此外，該課題組還將該融合蛋白應(yīng)用于大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷的治療，發(fā)現(xiàn)結(jié)合有CBD-HGF的膠原支架能夠更好地促進(jìn)體內(nèi)損傷部位內(nèi)皮化及內(nèi)膜形成[39]。同樣地，赤池敏宏課題組[40]將HGF與IgG的Fc段融合構(gòu)建而成的HGF-Fc融合蛋白不僅能夠促進(jìn)Hepg2細(xì)胞在材料表面的粘附及伸展(圖6)，還可調(diào)控細(xì)胞PI3-k及AKT、ERK磷酸化信號(hào)通路活化。

3.1.4VEGF融合蛋白

VEGF(血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子)是一種具有肝素結(jié)合活性的同源二聚體糖蛋白，能夠特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞。VEGF165是其最常見(jiàn)的亞型，具有誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、功能表達(dá)等作用，并參與體內(nèi)創(chuàng)傷愈合、慢性炎癥、腫瘤的血管增生過(guò)程。它主要從兩個(gè)方面參與血管新生：①作為血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂素，促進(jìn)NO釋放，提高血管滲透性和擴(kuò)張性；②產(chǎn)生細(xì)胞趨化作用，募集游離細(xì)胞形成細(xì)胞群[41]。于美華等[42-43]利用基因重組技術(shù)構(gòu)建了具有VEGF165與免疫球蛋白IgG的Fc功能域基因序列的質(zhì)粒載體，經(jīng)真核細(xì)胞體系表達(dá)、純化得到了VEGF-Fc融合蛋白。研究結(jié)果表明，VEGF-Fc經(jīng)Fc的疏水結(jié)合可在聚苯乙烯平板表面穩(wěn)定形成VEGF蛋白層，不僅顯著改善聚苯乙烯平板的表面親水性，而且有效提高了平板表面HUVEC細(xì)胞粘附，并促進(jìn)HUVEC增殖以及vWF和VE-cadherin的表達(dá)；細(xì)胞骨架染色結(jié)果顯示：細(xì)胞絲狀偽足豐富，肌動(dòng)蛋白纖維轉(zhuǎn)化為較大的應(yīng)力纖維，有利于微血管網(wǎng)絡(luò)的形成(圖7)。此后，祝傳順等[44]進(jìn)一步將VEGF-Fc用于PCL多孔支架表面改性，發(fā)現(xiàn)其能夠顯著改善PCL支架表面親水性，提高支架吸水速度及吸水量，同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞快速增殖、均勻地浸入支架內(nèi)部，并保持良好細(xì)胞活性。

圖6　HGF-Fc固定化平板及普通板培養(yǎng)的表面HepG2細(xì)胞骨架染色的顯微照片，圖(b)，(c)是圖(a)中方框區(qū)的放大[40] 　　Fig.6　Micrographs of cells skeleton staining of HepG2 cells cultured on HGF-Fc immobilized plate and normal plate,figure (b),(c)are magnification of square zone in figure (a)[40]

圖7　VEGF-Fc基質(zhì)化平板培養(yǎng)HUVEC細(xì)胞的vWF表達(dá)：培育1 h(a)， 48 h(b)[42-43]Fig.7　The vWF expression of HUVECs cultured on VEGF-Fc coated plate:cultured for 1 h (a) and 48 h (b) [42-43]

3.2基于細(xì)胞粘附因子的生物材料在組織工程中的應(yīng)用

細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)間相互作用也是細(xì)胞外微環(huán)境的重要組成部分，主要包括Ca粘素蛋白家族、整合素家族等，其可介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞間特異性鏈接以及細(xì)胞-基質(zhì)間非特異性連接[45]。目前,細(xì)胞粘附分子可以分為5類,分別為整合素家族、Ca粘素家族、免疫球蛋白超家族、選擇素家族及其他家族(如透明質(zhì)酸粘素、血管附著素族粘附分子、H-細(xì)胞粘附分子超家族等)[46]。整合素是細(xì)胞表面受體的一大家族，包含由14種α及8種β兩大類亞單元構(gòu)成的20多種雜二聚體跨膜蛋白，參與細(xì)胞選擇性粘附及信號(hào)傳遞，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和凋亡。目前較為成熟的一類重組蛋白材料RGD短肽的主要受體便是整合素家族。RGD序列由精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸組成，是細(xì)胞外基質(zhì)中與細(xì)胞粘附相關(guān)的多種糖蛋白共同含有的高度保守序列，也是整合素受體可以識(shí)別的最小多肽序列。RGD序列于20世紀(jì)80年代發(fā)現(xiàn)并實(shí)現(xiàn)了人工合成，至今已在多種生物材料改性中應(yīng)用，其可在短期內(nèi)促進(jìn)細(xì)胞的粘附、遷移和生長(zhǎng)。但在長(zhǎng)期體外培養(yǎng)及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,RGD肽的變性、脫落以及肽鏈的構(gòu)象改變?nèi)杂写M(jìn)一步研究解決[47]。

細(xì)胞Ca粘素蛋白是粘著連接的重要組成成分，最早被認(rèn)為是一種Ca2+依賴性的粘附蛋白分子，以多種形式分布于不同組織中[48]。Ca粘素蛋白為I型跨膜蛋白，其胞外域由5個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，胞外近N端為Ca2+結(jié)合部位，其胞內(nèi)域與α，β，p120連環(huán)蛋白等分子結(jié)合，并與骨架蛋白相結(jié)合[49]，其不僅通過(guò)蛋白胞外域的同源結(jié)合介導(dǎo)細(xì)胞間連接，并參與調(diào)控細(xì)胞的分化和遷移，在細(xì)胞組織化過(guò)程中起著重要作用(圖8)[50]。以下將重點(diǎn)介紹Ca粘素融合蛋白在組織工程中的研究及應(yīng)用現(xiàn)狀。

圖8　Ca粘素胞內(nèi)信號(hào)通路示意圖[50]Fig.8　Schematic diagram of cadherin intracellular signaling pathways[50]

3.2.1Ca粘素融合蛋白對(duì)功能細(xì)胞的影響

AKaike T課題組[51]率先構(gòu)建了鼠源E-cadherin胞外域和IgG蛋白Fc結(jié)構(gòu)域的重組蛋白mE-cadherin-Fc。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與膠原對(duì)照，鼠肝原代細(xì)胞能夠在細(xì)胞膜蛋白E-cadherin介導(dǎo)下更好地粘附于mE-cadherin-Fc涂膜的平板表面，且細(xì)胞DNA合成活性降低、色氨酸合酶的表達(dá)保持不變。Fauke等[52]同樣通過(guò)構(gòu)建重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)得到了E-cadherin-Fc重組蛋白，并將此重組蛋白制備成基質(zhì)材料,考察MDCK細(xì)胞粘附和形態(tài)的影響。Johana等[53]將N-cadherin-Fc融合蛋白通過(guò)固定劑PHMAA-g-PEGNHS固定于聚苯烯酰胺水凝膠及丙烯酰胺取代的玻璃表面，發(fā)現(xiàn)N-cadherin能夠調(diào)控皮層及膠質(zhì)細(xì)胞粘附，同時(shí)對(duì)神經(jīng)突的生長(zhǎng)有明顯促進(jìn)作用.此外，Koki等[54]還將N-cadherin利用桿狀病毒-脂質(zhì)體膜融合方法與脂質(zhì)體相結(jié)合應(yīng)用于藥物傳遞系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)N-cadherin脂質(zhì)體能均勻粘附于LN-229膠質(zhì)瘤細(xì)胞膜表面，展示了N-cadherin脂質(zhì)體作為納米載體生物材料用于腫瘤治療的潛能。由于細(xì)胞微環(huán)境的復(fù)雜性，還有不少研究者考察了多種細(xì)胞粘附因子融合蛋白材料對(duì)細(xì)胞功能的影響。如Behiati等[55]將L-selectin-Fc和VE-cadherin-Fc共同固定于Ti材料表面，大大提高了EPC和HUVEC細(xì)胞的粘附、細(xì)胞活性、細(xì)胞增殖潛能。Jorge等[56]首先制備了具有控制神經(jīng)細(xì)胞粘附和生長(zhǎng)功能的聚(3.4-乙烯二氧噻吩)：聚(4-硫磺酸)-co-順丁烯二酸(PEDOT：PSS-co-MA),固定在金基質(zhì)和碳微纖維表面，隨后將N-cadherin和L1重組蛋白修飾在PEDOT：PSS-co-MA上，結(jié)果表明,該材料能顯著促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)和遷移。由此可見(jiàn)，基于Ca粘素家族構(gòu)建的融合蛋白能夠穩(wěn)定吸附于多種基質(zhì)材料表面，應(yīng)用形式豐富，均表現(xiàn)出與體內(nèi)相似的功能特性，對(duì)不同細(xì)胞的粘附、增殖及功能表達(dá)起到良好的促進(jìn)作用。

3.2.2Ca粘素融合蛋白對(duì)干細(xì)胞分化的影響

干細(xì)胞是具有高度自我更新及多向分化潛能的細(xì)胞，具有構(gòu)建復(fù)雜組織器官的可能。將分離的干細(xì)胞在某種刺激下形成新的組織用于替代損失的器官或組織，即干細(xì)胞治療法已進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)階段，但在干細(xì)胞治療過(guò)程的不確定性和不可控性仍然是這一技術(shù)的主要瓶頸[57]。因此，開(kāi)發(fā)能夠“控制”干細(xì)胞命運(yùn)的生物活性材料具有極高的臨床價(jià)值和應(yīng)用前景。

Bian等[58]將N-cadherin加入到丙烯酰胺-透明質(zhì)酸水凝膠中培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)，發(fā)現(xiàn)N-cadherin在體外培養(yǎng)及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)出促進(jìn)MSC向軟骨分化及產(chǎn)生特異軟骨基質(zhì)的作用。Zhang等[59]利用纖連蛋白III7-10片段與cadhrin11胞外域1和2片段構(gòu)建融合蛋白rFN/CDH，并將其固定在磷酸氫鈣陶瓷表面，發(fā)現(xiàn)該融合蛋白能夠促進(jìn)MSC在活性材料表面的粘附、增殖及成骨分化。而后，他們又利用層層(lbl)自組裝的方法構(gòu)建了BCP/lbl/Chi-rFN/CDH緩釋材料，探究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在材料表面的粘附和增殖能力，發(fā)現(xiàn)MSC的成骨分化能力明顯提高[60]。AKaike課題組[61]使用mE-cadherin-Fc基質(zhì)培養(yǎng)鼠源胚胎干細(xì)胞，誘導(dǎo)其向肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞定向分化，所得分化后細(xì)胞形態(tài)與功能上均與肝原代細(xì)胞十分接近。此外，他們還將E-cadherin-Fc和N-cadherin-Fc共同涂膜，獲得了表達(dá)βⅢ-tubulin，pax6和Tyrosine Hydroxylase等神經(jīng)元陽(yáng)性標(biāo)志蛋白，而不表達(dá)神經(jīng)膠質(zhì)指標(biāo)蛋白，獲得了具有高同源性的原始外胚層和神經(jīng)祖細(xì)胞[62]。由此可見(jiàn)，基于Ca粘素家族融合蛋白的基質(zhì)材料能夠模擬細(xì)胞與細(xì)胞間相互作用，刺激細(xì)胞產(chǎn)生分子水平的響應(yīng)性變化，最終達(dá)到調(diào)控干細(xì)胞增殖與分化的目的。

與胚胎干細(xì)胞相比，間充質(zhì)干細(xì)胞具有來(lái)源廣泛、免疫原性低、無(wú)倫理問(wèn)題等獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已成為再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最受關(guān)注的細(xì)胞[63]。然而隨著體外培養(yǎng)的MSC細(xì)胞不斷傳代擴(kuò)增，其增殖及分化潛能也會(huì)逐漸降低[64]。因此要真正將MSC細(xì)胞在臨床治療中應(yīng)用并推廣，則必須開(kāi)發(fā)能夠獲得大量維持干性的MSC的體外培養(yǎng)體系。已有研究發(fā)現(xiàn)在纖維粘連蛋白涂膜的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)MSC能夠更好地維持細(xì)胞多向分化潛能[65]。因此，模擬體內(nèi)干細(xì)胞生長(zhǎng)微環(huán)境，構(gòu)建人工細(xì)胞外基質(zhì)，將會(huì)成為解決這一問(wèn)題的最有效手段之一。通過(guò)生物材料的分子設(shè)計(jì)，仿生調(diào)控組織工程支架的生物、化學(xué)及力學(xué)信號(hào)，構(gòu)建三維細(xì)胞外微環(huán)境，可實(shí)現(xiàn)組織工程支架對(duì)細(xì)胞粘附、增殖、遷移、分化及相關(guān)功能表達(dá)的誘導(dǎo)與調(diào)控[66]。

作者課題組通過(guò)基因工程手段，將人源E-cadherin與免疫球蛋白IgG1的Fc結(jié)構(gòu)域融合構(gòu)建了hE-cadherin-Fc融合蛋白，并探討了其對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及定向分化的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明[67]，材料表面hE-cadherin-Fc基質(zhì)化后，通過(guò)與細(xì)胞表面E-cadherin形成同親性結(jié)合，顯著提高了hMSCs的粘附。與一般的細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)TC-PS平板及Gelatin涂膜平板相比(圖9，10)，在hE-cadherin-Fc改性平板表面培養(yǎng)hMSC細(xì)胞形態(tài)為長(zhǎng)梭狀，更接近成纖維狀態(tài)，并在保持較高增殖速率的同時(shí)維持了良好的細(xì)胞未分化性。此外，在hE-cadherin-Fc平板表面進(jìn)行hMSCs向肝細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化，所得肝樣細(xì)胞更多，CD117高表達(dá)，且肝樣細(xì)胞白蛋白分泌、尿素合成能力均高于對(duì)照組(圖11)。在后期實(shí)驗(yàn)中，本課題組還嘗試將hE-cadherin-Fc融合蛋白用于PCL三維納米纖維支架的表面

圖9　聚苯乙烯培養(yǎng)板(PS)、組織培養(yǎng)處理培養(yǎng)板(TC-PS)、明膠涂膜(Gelatin)及hE-cadherin-Fc涂膜對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)增殖活性的影響(CCK-8法)(a)； TC-PS(曲線1)、Gelatin(曲線2)及hE-cadherin-Fc(曲線3)涂膜對(duì)MSC細(xì)胞CD105表達(dá)的影響(流式細(xì)胞分析)(b)[67]Fig.9　The proliferative activity of hMSCs on the PS-, TC-PS-, Gelatin- and hE-cadherin-Fc-coated surfaces(a); Flow cytometry analysis of undifferentiated state for hMSCs using the definitive undifferentiated state marker CD105. TC-PS(curve 1), gelatin-coated surface (curve 2)and hE-cadherin-Fc-coated surface(curve 3) (b) [67]

圖10　TC-PS(a)、Gelatin(b)及hE-cadherin-Fc(c)涂膜對(duì)MSC細(xì)胞形態(tài)的影響(細(xì)胞骨架蛋白熒光染色)[67]Fig.10　Morphological analysis of hMSCs cultured at 4, 24 and 48 h on TC-PS (a), gelatin-coated surface (b) and hE-cadherin-Fc-coated (c) surface .FITC-phalloidin labeled F-actin (gray) and PI nuclear staining (incanus) were used for immunofluorescence staining[67]

改性，發(fā)現(xiàn)該融合蛋白在納米纖維支架表面形成了穩(wěn)定的Ca粘素單分子層，促進(jìn)hMSCs粘附、增殖及成骨分化(圖12)[68]。上述結(jié)果表明：hE-cadherin-Fc融合蛋白改性組織工程支架可顯著改善hMSCs的體外增殖能力，并與相關(guān)細(xì)胞分化誘導(dǎo)因子和支架的物理結(jié)構(gòu)特性協(xié)同調(diào)控hMSCs的定向分化，進(jìn)一步顯示了基于Ca粘素融合蛋白的組織工程支架在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用前景。

圖11　hE-cadherin-Fc融合蛋白基質(zhì)化平板上MSC細(xì)胞向肝細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化圖：(a)CD117染色，(b)白蛋白分泌和(c)尿素分泌Fig.11　Hepatocyte-like cells differentiated from MSCs on hE-cadherin-Fc-coated plate： (a) CD117 staining，(b) albumin secretion,and (c) urea secretion

圖12　hE-cadherin-Fc修飾的取向/非取向電紡絲(左)及培養(yǎng)MSC細(xì)胞成骨分化潛能(右)的形貌：(a) rPCL, (b) E-rPCL,(c) aPCL,(d) E-aPCL[68]Fig.12　Morphology of hE-cadherin-Fc-coated nanofibrous scaffolds (left)and differentiation potential of hMSCs cultured on them(right):(a) rPCL,(b) E-rPCL,(c) aPCL, and (d) E-aPCL[68]

4結(jié)語(yǔ)

進(jìn)入21世紀(jì)，生命科學(xué)發(fā)展日新月異，隨著國(guó)家綜合國(guó)力的增強(qiáng)，經(jīng)濟(jì)的穩(wěn)步提升，人們對(duì)個(gè)人生活質(zhì)量越來(lái)越重視，特別是對(duì)健康問(wèn)題尤為關(guān)注。我國(guó)生物材料在國(guó)家重點(diǎn)扶持之下，歷經(jīng)了近40年的發(fā)展，取得了累累碩果，其中生物材料科學(xué)在整個(gè)生命科學(xué)中起到了舉重若輕的作用，為人們研究生命科學(xué)提供了一個(gè)全新的平臺(tái)與手段。

作為材料科學(xué)與生命科學(xué)的交叉學(xué)科，生物材料研究?jī)?nèi)容已逐漸涉及到醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、工程學(xué)等諸多領(lǐng)域，并且從單一考察材料的化學(xué)、物理和力學(xué)加工性能逐步深入到植入材料對(duì)受體細(xì)胞和分子層面上的影響。通過(guò)基因重組技術(shù)，精確篩選具有特定分子量、氨基酸組成及序列、空間結(jié)構(gòu)和功能的蛋白,連接融合形成具有多結(jié)構(gòu)域的人工蛋白，并與高分子支架材料結(jié)合，仿生構(gòu)建具有生物功能的新型復(fù)合人工細(xì)胞外基質(zhì)的方法,逐漸展現(xiàn)出引人注目的應(yīng)用前景。

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(編輯蓋少飛)

Recombinant Fusion Protein Based Biomaterialsfor Tissue Engineering

ZHANG Yan, XU Ke, GAO Chao, YANG Jun

(State Key Laboratory of Medicinal Chemical Biology, College of Life Science, Nankai University,

Tianjin 300071, China)

Abstract：The construction of 3D biological substitutes consisting of cells and scaffolds is an expected approach for tissue repair and organ restoration. Normal biological activities of cells requires the continuous stimulation of signaling molecules from the extracellular microenvironment. As an important part of the artificial extracellular matrix, both chemical signals and physical forces of the biomaterials remodeling regulate cell gene and protein express but far not enough to extracorporealy re-sculpt tissue structure. Using gene and protein engineering technology, a fusion protein could be designed with multiple functions and improved the biological activities of natural or synthetic materials. In this article, we summarize the developments of biomaterials based on the fusion protein, as well as the concepts of fusion protein design and preparation. Meanwhile, we highlight the applications of fusion proteins that related to cell growth factors and cell adhesion factors in tissue engineering.

Key words：fusion protein; tissue engineering; extracellular matrix; extracellular microenvironment; vascularization; stem cells

中圖分類號(hào)：R318.08

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1674-3962(2015)03-0204-12

DOI:10.7502/j.issn.1674-3962.2015.03.03

通訊作者：楊軍，女，1968年生，教授，博士生導(dǎo)師，Email:yangjun106@nankai.edu.cn

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31370965 ); 科技部“973”計(jì)劃項(xiàng)目(2011CB606202 )

收稿日期：2014-11-18