岳　華,馬光輝

(中國科學(xué)院過程工程研究所 生化工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100190)

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特約專欄

第一作者：岳華，女，1984年生，助理研究員

Email:ghma@.ipe.ac.cn

基于納微米顆粒和凝膠佐劑的新型疫苗傳遞體系

岳華,馬光輝

(中國科學(xué)院過程工程研究所 生化工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100190)

摘要：新型疫苗的飛速發(fā)展對(duì)佐劑或遞送體系的研究提出了巨大的挑戰(zhàn)。針對(duì)傳統(tǒng)佐劑在細(xì)胞免疫應(yīng)答方面不足的問題，選取生物相容性好的高分子材料為主要基質(zhì)，設(shè)計(jì)并制備出一系列尺寸均一且具有不同顆粒性質(zhì)(粒徑、電荷或表面基團(tuán))的納微米顆粒佐劑。研究表明，新型顆粒佐劑表現(xiàn)出良好的增加抗原內(nèi)化、促進(jìn)抗原提呈和T淋巴細(xì)胞增殖等優(yōu)勢(shì)，有望滿足重要傳染性疾病甚至惡性腫瘤的防治需求。此外，針對(duì)目前仍無有效黏膜免疫佐劑的難題，以具有生物粘附性的殼聚糖為基質(zhì)，開發(fā)了溫度敏感性凝膠作為疫苗佐劑。該凝膠佐劑不僅可以使鼻黏膜制劑有效鋪展和停留，還可以借助材料本身特性增加抗原滲透性并活化T細(xì)胞，從而誘導(dǎo)高效的免疫應(yīng)答，拓展了傳統(tǒng)以注射為主的免疫遞送方式。上述基于納微米顆粒和凝膠佐劑的疫苗傳遞體系的系統(tǒng)性研究，為新型疫苗傳遞系統(tǒng)的開發(fā)提供了有意義的探索。

關(guān)鍵詞：納微米顆粒；凝膠；佐劑；疫苗傳遞系統(tǒng)；微孔膜乳化法

1前言

疫苗領(lǐng)域重要的難題之一是選擇合適的佐劑和遞送體系。傳統(tǒng)疫苗經(jīng)常直接來源于細(xì)菌或病毒，即使不添加佐劑也具有較高的免疫原性，但由于大量病原性組分的存在會(huì)導(dǎo)致安全性問題，此類疫苗正逐漸被替代。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，成分明確、安全穩(wěn)定的新型亞單位疫苗開始出現(xiàn)，但其免疫原性較差，難以誘導(dǎo)良好的免疫應(yīng)答效果，必須添加佐劑才能發(fā)揮疫苗抗感染的特性[1-2]。鋁佐劑是應(yīng)用最為廣泛的佐劑，不過其局限性在于僅誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，無法產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答，目前多用于特定傳染性疾病的預(yù)防方面，對(duì)亞單位疫苗(如H5N1裂解疫苗)效果不明顯，并且無法滿足其它新型疫苗尤其是治療性疫苗的發(fā)展需求。后續(xù)開發(fā)的油乳佐劑、弗氏佐劑、脂多糖等在免疫效果方面有所提升，但多數(shù)制劑在注射后會(huì)引起注射部位結(jié)塊，甚至系統(tǒng)性過敏性休克等反應(yīng)，導(dǎo)致疫苗產(chǎn)品無法被FDA批準(zhǔn)(繼鋁佐劑70余年后才有一種MF59佐劑獲批)。此外，很多感染性病原(包括禽流感病毒及手足口病EV71病毒等在內(nèi))都是通過呼吸道黏膜表面侵入機(jī)體的，僅依靠傳統(tǒng)的疫苗注射方式遞送抗原，在提高機(jī)體保護(hù)力方面十分有限。新型的黏膜遞送系統(tǒng)將很大程度上改善這一缺陷，遺憾的是現(xiàn)有的佐劑起初均針對(duì)注射式抗原而開發(fā)，忽略了黏膜特殊的生理結(jié)構(gòu)和功能，無法有效地刺激黏膜抗體的產(chǎn)生。因此，疫苗的開發(fā)受到了嚴(yán)重限制，而研制高效而安全的新型佐劑或遞送體系，從某種程度上將決定新型疫苗的誕生。

本研究小組長期以來一直致力于生物材料及生物劑型工程等領(lǐng)域的發(fā)展，并圍繞顆粒和凝膠佐劑的研究和應(yīng)用開展了一系列工作。與傳統(tǒng)的佐劑相比，納微米顆粒(如膠束、聚合物顆粒、脂質(zhì)體等)由于同自然界中的病原性細(xì)菌、真菌等尺寸或維度相近，容易被機(jī)體識(shí)別為外源性物質(zhì)，激活機(jī)體的免疫應(yīng)答[3]。納微米顆粒的優(yōu)勢(shì)使其有望成為高效、安全的疫苗佐劑，但如何使之發(fā)揮所期待的效果是當(dāng)前研究的重要難題?；诩{微米顆粒對(duì)生物學(xué)效應(yīng)影響的理論研究基礎(chǔ)，通過調(diào)控顆粒的物理或化學(xué)性質(zhì)，開發(fā)出具有優(yōu)良理化性質(zhì)的顆粒佐劑，可滿足疫苗對(duì)機(jī)體特異性應(yīng)答的需求。針對(duì)黏膜免疫的應(yīng)答特點(diǎn)，開發(fā)出溫度敏感性水凝膠佐劑，通過調(diào)整組分性質(zhì)制備出具有合適相轉(zhuǎn)變時(shí)間和溫度的凝膠制劑，可滿足呼吸道傳播疾病的預(yù)防性疫苗需求。對(duì)上述新型顆粒佐劑和凝膠佐劑的系統(tǒng)性研究，不僅為借助疫苗對(duì)抗病原體的早期感染甚至發(fā)揮更深層次的治療殺傷效果提供了借鑒，也為新型疫苗傳遞系統(tǒng)的免疫應(yīng)答機(jī)理進(jìn)行了有力補(bǔ)充。

2新型顆粒佐劑疫苗的研究進(jìn)展

2.1尺寸均一乳液和顆粒佐劑的制備

在諸多的納微米顆粒中，聚合物顆粒基于其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)成為近年來的研究熱點(diǎn)。制備聚合物顆粒的材料按其來源可以分為天然和合成高分子材料兩大類。天然高分子材料如淀粉、殼聚糖、海藻酸鹽、明膠以及白蛋白等具有良好的生物相容性，幾乎都可降解而且降解產(chǎn)物無毒。其中殼聚糖、海藻酸鹽因材料廉價(jià)、易得并具有較好的生物安全性，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。常見的合成高分子如聚乳酸(PLA)、聚乳酸乙醇酸(PLGA)、聚乙二醇-聚乳酸(PELA)、聚酸酐和聚己內(nèi)酯等具有結(jié)構(gòu)和性能可人為調(diào)控等優(yōu)點(diǎn)，近幾十年來發(fā)展迅速。PLA和PLGA是最典型的合成高分子材料，具有很好的生物降解性和生物相容性，已被FDA批準(zhǔn)作為可生物降解材料用于藥物輔料。

傳統(tǒng)高分子聚合物顆粒制備方法如超聲、攪拌、均質(zhì)等，由于剪切場(chǎng)不均一和Oswald熟化現(xiàn)象，無法形成均一液滴，造成乳液的穩(wěn)定性差，體內(nèi)分布不具有規(guī)律性。雖然有少量研究工作嘗試將納微米顆粒作為佐劑，評(píng)價(jià)其免疫學(xué)效果，然而由于評(píng)價(jià)中所使用的顆?？赡艽嬖诹椒植紝?、個(gè)體差異性大的問題，導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)不一致甚至截然相反的現(xiàn)象[4]。為解決上述難題，作者團(tuán)隊(duì)發(fā)展了一種獨(dú)特的微孔膜乳化技術(shù)，通過選取合適的膜孔徑來實(shí)現(xiàn)顆粒尺寸的控制(100 nm～100 μm范圍內(nèi)可控)，在膜孔均一剪切和合適壓力的作用下，制備得到粒徑均一的液滴，固化成球后進(jìn)而得到粒徑均一的顆粒(圖1)，從而保證了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可重現(xiàn)性?；谠擁?xiàng)核心技術(shù)，通過過程控制手段可以獲得具有不同結(jié)構(gòu)和不同性質(zhì)的納微米顆粒[5-6]，進(jìn)而滿足疫苗多樣化和抗原釋放的需求，最大程度地發(fā)揮佐劑疫苗的免疫應(yīng)答效果。

圖1　微孔膜乳化法原理示意圖(a)及利用該技術(shù)制備的PLA微球(b)和殼聚糖微球(c)Fig.1　Schematic diagram of membrane emulsification process (a) and PLA microparticles (b) and chitosan microparticles (c) prepared by this process

2.2納微米顆粒佐劑的設(shè)計(jì)及應(yīng)用舉例

在制備出均一顆粒的前提下，我們對(duì)顆粒佐劑引發(fā)的免疫應(yīng)答體系進(jìn)行了系統(tǒng)的探索，一方面是對(duì)免疫知識(shí)體系的補(bǔ)充，另一方面也期待能為顆粒佐劑的設(shè)計(jì)提供思路。例如，借助微孔膜乳化優(yōu)勢(shì)技術(shù)，制備出粒徑均一且具有不同粒徑的3種顆粒，從單因素水平分析粒徑效應(yīng)，保證評(píng)價(jià)結(jié)果的可重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性。與粒徑較大的微米球(如4.8 μm、1.9 μm)相比，納米球更容易被巨噬細(xì)胞(抗原提呈細(xì)胞APCs)大量而快速地?cái)z取(圖2，顆粒為灰白色)。納米球被內(nèi)吞后其顆粒表面積最大，適合作為有效的抗原吸附和運(yùn)輸載體，而微米球展示出較大的內(nèi)吞顆粒體積，在包埋抗原方面可能更具有優(yōu)勢(shì)[7]。此外，粒徑影響了細(xì)胞因子表達(dá)水平，納米球更有助于促進(jìn)細(xì)胞免疫相關(guān)因子(如IL-12等)的分泌。

圖2　J774A.1細(xì)胞對(duì)不同粒徑大小的納微球攝取的顯微照片 :(a) 430 nm, (b) 1.9 μm和(c) 4.8 μmFig.2　Micrographs of different sized micro/nanoparticles absorbed by macrophages :(a) 430 nm,(b) 1.9 μm,and (c) 4.8 μm

除粒徑之外，我們還研究了顆粒其他理化性質(zhì)對(duì)生物學(xué)效應(yīng)的影響[8-10]。以親疏水性為例，選取主體結(jié)構(gòu)為聚乳酸的3種材料(PLA、PLGA、PELA)，并借助膜乳化技術(shù)可制備出疏水性不同且粒徑均為1 μm的顆粒(PLGA和PELA因分別含有羥基乙酸和聚乙二醇而親疏水性不同)。通過比較三者在細(xì)胞攝取、細(xì)胞活化、細(xì)胞遷移行為后發(fā)現(xiàn)，隨著顆粒表面疏水性的增強(qiáng)，顆粒的佐劑效果也隨之增強(qiáng)。為揭示相關(guān)作用機(jī)制，通過巧妙地將3種微球修飾于原子力顯微鏡探針上，原位分析了細(xì)胞與顆粒間的相互作用，發(fā)現(xiàn)顆粒疏水性的增強(qiáng)將增大顆粒與細(xì)胞(尤其是疏水細(xì)胞膜)的相互作用力，進(jìn)而推動(dòng)細(xì)胞的攝取行為，最終提升免疫應(yīng)答。

上述研究提示我們，顆粒的粒徑大小及表面性質(zhì)等不僅會(huì)影響抗原負(fù)載行為，還對(duì)后續(xù)的細(xì)胞學(xué)、免疫學(xué)效應(yīng)有重要影響。傳統(tǒng)的預(yù)防性疫苗，主要激活CD4 T細(xì)胞，刺激抗體分泌，中和血液中游離的病毒，引發(fā)體液免疫應(yīng)答。后續(xù)發(fā)展的治療性疫苗或腫瘤疫苗，通過激活CD8 T(CTL)細(xì)胞，釋放穿孔素等，特異性地殺傷和裂解已經(jīng)被病原體感染的細(xì)胞，而引發(fā)細(xì)胞免疫應(yīng)答?；趯?duì)顆粒性質(zhì)影響佐劑免疫效果的知識(shí)體系，通過設(shè)計(jì)和調(diào)控顆粒性質(zhì)，有望滿足不同類型疫苗對(duì)免疫激活和應(yīng)答方面的需求。

2.2.1預(yù)防性疫苗

單獨(dú)H5N1流感裂解疫苗作為新型疫苗具有安全性高、易于大批量生產(chǎn)的優(yōu)勢(shì)，但其免疫原性較弱，需要疫苗佐劑保護(hù)疫苗不被降解，同時(shí)增強(qiáng)其免疫原性。為解決上述難題，作者團(tuán)隊(duì)將前期構(gòu)建的一種溫敏性殼聚糖凝膠體系與快速膜乳化技術(shù)相結(jié)合，利用顆粒37 ℃發(fā)生自固化現(xiàn)象，制備出一種新型顆粒作為H5N1流感裂解疫苗佐劑[11]。首先將溶有殼聚糖或其衍生物的弱酸溶液與甘油磷酸鹽水溶液在低溫下(4 ℃)混合，混合后溶液為中性(pH 7.4)，經(jīng)過快速膜乳化得到油包水型乳液后升溫至37 ℃，乳滴將發(fā)生自固化形成顆粒。與傳統(tǒng)的殼聚糖顆粒相比，該溫敏性顆粒制備和固化過程溫和，避免了因使用化學(xué)交聯(lián)劑導(dǎo)致的抗原失活，提高了生物利用度。研究發(fā)現(xiàn)，該顆粒注射制劑能顯著提高H5N1疫苗誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答，血清中特異性總IgG抗體效價(jià)和血凝中和抗體顯著高于商品化Al佐劑組和LPS組，表現(xiàn)出很好的預(yù)防效果。更重要的是，該顆粒還具有pH敏感性，可以促進(jìn)抗原被樹突細(xì)胞(DC)攝取并從溶酶體逃逸到細(xì)胞質(zhì)，顯著提高H5N1疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)，在提高體液免疫應(yīng)答的同時(shí)發(fā)揮交叉保護(hù)能力。

圖3　CS-NH2(伯胺顆粒，左)和CS-CL(叔胺顆粒，右)表面基團(tuán)示意圖Fig.3　Schematic diagrams of the structure of different chemical groups on the particles surface of CS-NH2(left) and CS-CL(right)

炭疽是由炭疽桿菌所致的一種人畜共患的急性傳染病，作為一種大規(guī)模殺傷性武器，至今仍然對(duì)人類構(gòu)成重大威脅。目前的減毒滅活疫苗和鋁佐劑基因重組疫苗雖有效力，具有一定副作用或效力不穩(wěn)定，亟需新的疫苗佐劑。通過利用殼聚糖和海藻酸鈉，結(jié)合快速膜乳化技術(shù)和層層自組裝技術(shù)，制備出含有不同表面基團(tuán)的1 μm顆粒(CS-NH2和CS-CL)(圖3)，然后與重組炭疽抗原(rPA)復(fù)配可得到疫苗制劑[12]。細(xì)胞試驗(yàn)表明，兩種顆粒對(duì)抗原的吸附率一致，并且被APCs的攝取的情況相當(dāng)(均高于單純抗原組且二者間無顯著差異)。但與表面富含叔胺的CS-CL顆粒相比，富含伯胺的CS-NH2顆粒誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生了快速的但可恢復(fù)的炎癥激發(fā)反應(yīng)(顯示出良好的生物安全性)，并顯著增強(qiáng)了抗原特異性的血清抗PA抗體分泌水平，提高疫苗的免疫保護(hù)能力。CS-NH2顆粒之所以表現(xiàn)出上述優(yōu)勢(shì)，主要因其表面富含親核反應(yīng)性很強(qiáng)的伯胺基團(tuán)，能與補(bǔ)體系統(tǒng)中的C3b分子共價(jià)結(jié)合，從而引發(fā)補(bǔ)體反應(yīng)。提高APCs抗原攝取量通常是免疫效果提升的前提條件，該研究通過引入特定的表面基團(tuán)，在攝取量一致時(shí)，通過誘導(dǎo)APCs攝取活化之外的激活途徑同樣也可以獲得高效的免疫應(yīng)答，為預(yù)防性顆粒佐劑開發(fā)的開辟了一個(gè)新的視角。

2.2.2治療性疫苗

由于外源性抗原通常經(jīng)溶酶體降解，引起CD4 T細(xì)胞為主的體液免疫應(yīng)答，因此激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生高效的細(xì)胞免疫應(yīng)答是治療性疫苗最大的挑戰(zhàn)。雖然鋁佐劑能夠誘導(dǎo)高效的體液免疫反應(yīng)，但由于其本身固有的局限性，對(duì)細(xì)胞免疫應(yīng)答無能為力。如果借助新型佐劑改善抗原的提呈或降解途徑，將有可能激活CD8 T，殺傷感染細(xì)胞，輔助疫苗發(fā)揮治療效果。

前期與微米顆粒的比較表明，納米顆粒有利于促進(jìn)APCs分泌與細(xì)胞免疫應(yīng)答相關(guān)的細(xì)胞因子。借助納米球佐劑的理論成果，嘗試將PLA納米球(350 nm)與HBsAg復(fù)配制得疫苗制劑，對(duì)納米球作為治療性乙肝疫苗佐劑進(jìn)行了應(yīng)用探索[13]。與商品化鋁佐劑相比，該納米球顆粒體系不僅可以增加乙肝抗原被細(xì)胞的攝取，提高抗原(灰白色)與細(xì)胞相互作用的機(jī)率，而且能夠拓展抗原的運(yùn)輸途徑，使其逃脫溶酶體(灰色)游離于胞質(zhì)中(圖4a)。在APCs攝取和提呈抗原效率同時(shí)得到提升的基礎(chǔ)上，納米球佐劑有效上調(diào)了細(xì)胞免疫應(yīng)答的兩個(gè)關(guān)鍵評(píng)價(jià)指標(biāo)，直接對(duì)靶細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞因子IFN-γ(圖4b)和細(xì)胞毒性T細(xì)胞CTL(圖4c)的特異性裂解作用。該研究說明，納米顆粒在引起細(xì)胞免疫方面具有獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)，為治療性疫苗打破乙肝病毒導(dǎo)致的免疫耐受提供了理論上的可行性。

圖4　納米顆粒促進(jìn)抗原從溶酶體逃逸(a)從而提升IFN-γ分水平(b)和CTL殺傷活性(c)Fig.4　Nanoparticles promote the antigen to escape from lysosomes (a) ，induce higher IFN-γ level (b) and CTL lysis activity (c)

為了得到更高水平的細(xì)胞免疫效果，分別采用3種多聚陽離子聚合物(殼聚糖CS、殼聚糖鹽酸鹽CSC和聚乙烯亞胺PEI)對(duì)PLA顆粒表面進(jìn)行鍍層修飾[14]。修飾后的微球顆粒表面電勢(shì)由負(fù)到正翻轉(zhuǎn)(其中PEI-PLA顆粒荷電水平最高)，并且對(duì)HBsAg抗原的吸附量也隨之增加。其中，荷正電最多的PEI-PLA體系可以使抗原最大程度地被APCs細(xì)胞內(nèi)化，提高炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，在體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生了接近甚至超過鋁佐劑的高水平乙肝IgG特異性抗體。特別地，鍍層后的PLA顆粒更容易促進(jìn)抗原逃逸出溶酶體，其中PEI-PLA顆粒還能同時(shí)提升IgG2a(偏向細(xì)胞免疫)比例，顯示出良好的細(xì)胞免疫效果。因此，增加顆粒的正電性能夠進(jìn)一步提高顆?；罨疉PCs的效果，最終獲得高水平的體液和細(xì)胞雙重免疫應(yīng)答。由此可見，通過調(diào)控顆粒性質(zhì)拓展抗原的運(yùn)輸途徑，是治療性疫苗發(fā)揮細(xì)胞免疫應(yīng)答的有效途徑。

2.2.3腫瘤疫苗

相比于放療、化療等傳統(tǒng)治療腫瘤的方法，免疫治療(如腫瘤疫苗)因其特異性高、副作用低等優(yōu)勢(shì)引起了廣泛關(guān)注。然而，腫瘤抗原免疫原性低，難以引起有效的腫瘤殺傷效果。為了增加腫瘤抗原被機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別的機(jī)會(huì)，作者團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)并制備了修飾有細(xì)胞穿膜肽(CPP)的尺寸均一的PLGA納米顆粒(CNP)[15]。借助腫瘤細(xì)胞對(duì)納米顆粒的攝取作用，將兩種細(xì)胞因子佐劑(粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子GM-CSF和白細(xì)胞介素2 IL-2)高效導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)滅活后制成多佐劑復(fù)合型腫瘤全細(xì)胞疫苗(圖5)。修飾CPP后的納米顆粒，不僅可以使免疫因子快速導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)，而且避免了溶酶體對(duì)外源性物質(zhì)的降解以保證免疫因子的活性。體內(nèi)的治療效果研究表明，疫苗中的復(fù)合成分，可以針對(duì)不同免疫應(yīng)答環(huán)節(jié)起效，使大量CTL遷移到腫瘤病灶部位，有效地抑制了腫瘤的生長，延長了小鼠的生存時(shí)間。此外，疫苗免疫后的小鼠血清中反映肝、腎和心肌毒性指標(biāo)值均處于正常范圍內(nèi)，證明了該疫苗具有良好的安全性。通過在顆粒表面嫁接配體，可以避開靶向至腫瘤細(xì)胞，

前面所述的絕大多數(shù)顆粒佐劑主要以球型為主，隨著新材料新技術(shù)的出現(xiàn)，開發(fā)與傳統(tǒng)顆粒形狀甚至維度不同的新型顆粒佐劑也將成為可能。例如，通過對(duì)二維平面粒子氧化石墨烯(GO)的生物學(xué)效應(yīng)進(jìn)行系統(tǒng)性評(píng)價(jià)，揭示了新型二維粒子與三維球型顆粒截然不同的性質(zhì)[16]。與微米級(jí)GO相比，納米級(jí)GO更能夠引起APCs強(qiáng)烈的應(yīng)激性行為，分泌與免疫激活相關(guān)的細(xì)胞因子?；谠摻Y(jié)果，借助二維GO粒子所特有的疏水多環(huán)平面結(jié)構(gòu)和高比表面積性質(zhì)，采用簡便而快速的吸附策略，制備出具有超高抗原負(fù)載量的腫瘤疫苗制劑。初步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，基于GO的腫瘤疫苗體系，可同時(shí)提升APCs細(xì)胞募集、抗原加工提呈以及T細(xì)胞免疫應(yīng)答的效果。該研究豐富了以傳統(tǒng)球型顆粒為主的知識(shí)體系，并拓展了新型顆粒在疫苗領(lǐng)域應(yīng)用的多樣化設(shè)計(jì)范疇。

圖5　基于納米顆粒的多佐劑復(fù)合型全細(xì)胞腫瘤疫苗示意圖Fig.5　Schematic diagram of nanoparticles-based multi-adjuvant whole cell tumor vaccine for cancer immunotherapy

2.3納微米顆粒佐劑作用機(jī)理

2.3.1增加APCs對(duì)抗原的攝取和提呈

傳統(tǒng)鋁佐劑以及新型顆粒佐劑的作用機(jī)制如圖6所示。單純抗原制劑經(jīng)肌肉注射后，會(huì)被機(jī)體快速清除[17]，而鋁鹽佐劑可以顯著提高其在注射部位的停留(儲(chǔ)庫效應(yīng))，誘導(dǎo)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，募集大量的免疫細(xì)胞(如中性粒細(xì)胞、DC等)[18]。顆粒佐劑因其材料來源和表面性質(zhì)的不同，作用機(jī)制有所區(qū)別。如殼聚糖凝膠顆粒在注射后也發(fā)揮了類似募集APCs的作用，但PLA微球佐劑卻并未延長抗原在注射部位的停留，而是略微加速了抗原被APCs的清除。然而，兩種顆粒佐劑共同的特點(diǎn)是可以促使大量抗原進(jìn)入APCs，其中表面帶正電荷的顆粒更有利于被細(xì)胞內(nèi)化攝取，促進(jìn)細(xì)胞分泌與免疫激活相關(guān)的細(xì)胞因子。

圖6　鋁佐劑和納微米顆粒佐劑的不同作用機(jī)制圖示Fig.6　Graphic representing of mechanisms of alum and MP/NPs adjuvanted vaccine.

2.3.2提升抗體滴度水平

鋁鹽佐劑可以促使外源性疫苗抗原以MHC II的途徑提呈到APCs表面，從而為CD4 T細(xì)胞提供特異性的抗原識(shí)別信號(hào)。這也是鋁佐劑可以誘導(dǎo)IgG抗體水平，發(fā)揮高效體液免疫應(yīng)答的原因之一。與鋁佐劑相比，顆粒佐劑也可以提升APCs(如脾細(xì)胞DC)的MHCⅡ分子的表達(dá)量，誘導(dǎo)產(chǎn)生接近甚至超越鋁佐劑的IgG滴度水平，以及更高水平的中和抗體(HI)滴度和IgM滴度(免疫應(yīng)答初期)。由此可見，在以預(yù)防為主的體液免疫方面，顆粒佐劑具有匹配或略微強(qiáng)于鋁鹽的佐劑效果。

2.3.3提高細(xì)胞免疫應(yīng)答

商品化鋁佐劑無法有效提升細(xì)胞免疫應(yīng)答的可能原因是T細(xì)胞識(shí)別信號(hào)MHC I和CD80/CD86共刺激因子表達(dá)水平的下調(diào)[13]。與之相反，顆粒佐劑可以同時(shí)提升APCs的MHC I分子和共刺激因子的表達(dá)水平，從而為特異性CD8 T細(xì)胞提供識(shí)別(第1信號(hào))和激活(第2信號(hào))。特別地，外源性抗原從溶酶體逃逸至胞質(zhì)中降解，循MHC I分子途徑提呈(即“交叉提呈”)激活CD8+CTL，是以顆粒為佐劑的治療性疫苗或腫瘤疫苗發(fā)揮作用的關(guān)鍵。激活后的CTL通過釋放穿孔素和顆粒酶裂解靶細(xì)胞，達(dá)到殺傷清除靶細(xì)胞的目的。因此，在以治療為主的細(xì)胞免疫應(yīng)答方面，顆粒佐劑發(fā)揮著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，遠(yuǎn)優(yōu)于當(dāng)前商品化佐劑的效果。

3新型凝膠佐劑疫苗的研究進(jìn)展

3.1凝膠佐劑的制備

目前仍沒有針對(duì)黏膜系統(tǒng)的免疫佐劑，多數(shù)是將傳統(tǒng)的佐劑體系制成溶液、噴霧或粉末等，其黏膜粘附性差，容易被清除，無法有效攜帶抗原跨越黏膜系統(tǒng)屏障。而高分子水凝膠，具有良好的粘附性，有助于延長抗原與黏膜的接觸時(shí)間，可作為黏膜免疫抗原的良好遞送載體，彌補(bǔ)目前黏膜免疫佐劑的不足。天然多糖殼聚糖是近年來被廣泛關(guān)注的高分子凝膠材料，通過將殼聚糖改性合成得到殼聚糖季銨鹽材料，一方面可以改善殼聚糖的水溶性，另一方面增加其正電荷量以增強(qiáng)黏膜粘附性[19]。研究發(fā)現(xiàn)，季銨鹽殼聚糖(HTCC)與甘油磷酸鈉(GP)通過電荷相互作用后能夠形成一種具有明顯的溶液(Sol)-凝膠(Gel)轉(zhuǎn)換特性溫度敏感的水凝膠(圖7)。在此過程中，HTCC含量、GP含量以及季銨取代度(QD)都會(huì)影響凝膠體系的黏度和凝膠轉(zhuǎn)變時(shí)間。以QD為例，取代度越高(>79.5%)時(shí)，在37 ℃下加熱后，體系需要較長時(shí)間發(fā)生從溶液到凝膠的轉(zhuǎn)變。一方面是因?yàn)榧句@基團(tuán)引入越多，空間位阻作用越大，分子鏈不容易卷曲而聚集；另一方面，季銨基團(tuán)的陽離子性較強(qiáng)，增大了鏈間的靜電斥力，阻礙了分子鏈的相互靠近；同時(shí)，季銨基團(tuán)具有較強(qiáng)的親水性，在周圍形成一層規(guī)整的水合層，增加了溶液穩(wěn)定性。

圖7　季銨鹽殼聚糖溫敏性水凝膠機(jī)理圖(a)及溶液-凝膠狀態(tài)照片(b)Fig.7　The mechanism of thermo-sensitive HTCC gel (a) and sol-gel image (b)

通過一系列條件優(yōu)化，可篩選出適宜鼻黏膜免疫水凝膠載體的配方，使凝膠體系在室溫下為流動(dòng)性良好的液體，而37 ℃時(shí)，能在一定時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)椴涣鲃?dòng)的凝膠。借助上述特性，凝膠系統(tǒng)與抗原混合后以液體方式滴鼻免疫，可以使抗原在鼻腔能充分鋪展，并與鼻黏膜緊密接觸。在鼻腔溫度下一定時(shí)間后，轉(zhuǎn)變?yōu)殡y以流動(dòng)的凝膠，從而為后續(xù)免疫應(yīng)答的發(fā)揮奠定基礎(chǔ)。

3.2凝膠作為疫苗佐劑的應(yīng)用探索

流感病毒變異快，人體接種或感染后經(jīng)常對(duì)變異后新病毒不具有免疫力。而黏膜免疫應(yīng)答誘導(dǎo)產(chǎn)生的分泌性IgA (sIgA) 抗體能產(chǎn)生針對(duì)不同亞型病毒的免疫，起到交叉保護(hù)作用，在應(yīng)對(duì)流感病毒的感染上具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。針對(duì)流感病毒感染的特殊性，以所開發(fā)的殼聚糖水凝膠作為佐劑[20-21]，采用MF59商業(yè)化佐劑作為陽性對(duì)照，肌肉注射組作為傳統(tǒng)免疫方式對(duì)照進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)。與鼻黏膜免疫其他各組比較，溫敏水凝膠組誘導(dǎo)產(chǎn)生了最高的IgG抗體水平和HI效價(jià)，表明凝膠疫苗在機(jī)體發(fā)生流感病毒感染時(shí)，能快速中和病毒表面，減弱其與細(xì)胞膜結(jié)合而感染細(xì)胞的能力。更重要的是，溫敏凝膠組誘導(dǎo)產(chǎn)生了最高的黏膜IgA抗體效價(jià)(顯著高于MF59)。雖然抗原肌肉注射組產(chǎn)生的抗體和HI效價(jià)較高，但是幾乎未能誘導(dǎo)產(chǎn)生鼻腔和肺部的IgA抗體反應(yīng)。該結(jié)果揭示了凝膠佐劑誘導(dǎo)系統(tǒng)和黏膜共同免疫應(yīng)答的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)也反映出針對(duì)特定抗原選擇合適疫苗傳遞系統(tǒng)的重要性。

埃博拉病毒也是一種能經(jīng)過呼吸道傳播的烈性病原體，感染后具有高達(dá)90%的死亡率。以HTCC水凝膠作為黏膜免疫佐劑，與埃博拉膜蛋白抗原(Ad-Gpz)混合均勻制得疫苗制劑。小鼠滴鼻免疫試驗(yàn)表明，凝膠抗原體系在1 h內(nèi)能維持鼻腔高濃度的抗原量(>80%)，而單獨(dú)抗原滴鼻則僅有25%抗原在鼻腔停留。特定HTCC取代度的水凝膠誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的血清IgG和鼻黏膜IgA抗體水平。特別地，凝膠組腸系膜淋巴細(xì)胞分泌的抗原特異性的IL-4水平顯著增強(qiáng)，表明鼻腔免疫引起了遠(yuǎn)端腸道黏膜的體液免疫反應(yīng)，這對(duì)從腸道黏膜和鼻黏膜兩個(gè)方面共同防止病原體的感染具有顯著的優(yōu)勢(shì)。

3.3凝膠佐劑作用機(jī)理

3.3.1延長抗原停留時(shí)間

鼻黏膜纖毛清除鼻腔異物的半衰期是15 min 左右，因此經(jīng)鼻的抗原或藥物要達(dá)到高的生物利用度需要克服這一生理因素，否則抗原或藥物在鼻腔內(nèi)還未進(jìn)入到鼻黏膜下層即被清除體外或進(jìn)入胃內(nèi)被強(qiáng)酸環(huán)境代謝降解。例如，以MF59為佐劑的疫苗制劑在滴鼻后段時(shí)間內(nèi)即被小鼠吞咽進(jìn)胃部代謝失活，不能持續(xù)刺激黏膜的免疫細(xì)胞，只能誘導(dǎo)產(chǎn)生較低的黏膜IgA抗體水平。而水凝膠佐劑可以顯著延長抗原在鼻腔的組織的停留時(shí)間。黏膜上皮細(xì)胞膜帶負(fù)電荷，帶大量正電荷的殼聚糖凝膠溶液可充分鋪展在黏膜表面并借助其電荷相互作用緊密地黏附在鼻黏膜表面。另外，凝膠具有溫度敏感性的特點(diǎn)，在體系從溶液向凝膠轉(zhuǎn)變后，可有效限制鼻黏膜纖毛的擺動(dòng)，極大地減緩黏膜的清除速率。

3.3.2增加抗原在黏膜的滲透

單獨(dú)抗原僅在1 h內(nèi)有少量停留。水凝膠和抗原體系在鼻腔發(fā)生膠凝后，抗原從水凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)內(nèi)逐步擴(kuò)散到鼻黏膜表面，1 h后抗原進(jìn)一步滲透至鼻黏膜下層開始彌散均勻的分布，滲透深度為50 μm后到達(dá)鼻中隔軟骨組織層，顯示出了凝膠一定的抗原緩釋效果。這種增強(qiáng)作用與凝膠獨(dú)特的溫敏性和正電荷性是分不開的。借助殼聚糖季銨鹽強(qiáng)的正電荷效應(yīng)，有助于刺激細(xì)胞之間的緊密連接蛋白ZO-1的聚集和重排，打開黏膜上皮細(xì)胞間通路，增強(qiáng)抗原的滲透量(圖8)。而抗原以磷酸鹽(PBS)溶液形式免疫后，主要經(jīng)鼻黏膜M細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入黏膜下層，其通過胞內(nèi)途徑轉(zhuǎn)運(yùn)抗原的效率明顯低于水凝膠細(xì)胞間隙途徑。

圖8　水凝膠使得抗原通過細(xì)胞間隙進(jìn)入黏膜下層的顯微照片F(xiàn)ig.8　 Micrographs of hydrogel leading to antigen penetrating to down layer of mucous membrane through cellular gap

3.3.3T細(xì)胞的活化

水凝膠協(xié)助大量抗原進(jìn)入到黏膜下層后，可有效地激活鼻黏膜相關(guān)淋巴結(jié)中T細(xì)胞(提升T細(xì)胞活化標(biāo)志CD127)，并加快CD8 T細(xì)胞功能成熟并向其他淋巴結(jié)和淋巴器官引流。注射免疫不僅不能產(chǎn)生鼻黏膜IgA的抗體反應(yīng)，對(duì)黏膜部位T細(xì)胞的抗原特異性激活也處于失效狀態(tài)。另外，MF59佐劑并未誘導(dǎo)CD8 T細(xì)胞高表達(dá)CD127，這可能是因?yàn)镸F59抗原復(fù)合物在鼻腔與黏膜層細(xì)胞接觸時(shí)間短，對(duì)黏膜相關(guān)免疫細(xì)胞刺激較弱造成。

4結(jié)語

隨著生物材料技術(shù)的發(fā)展，集靶向遞送和聯(lián)合刺激于一體的智能型體系將成為新型疫苗傳遞系統(tǒng)的發(fā)展方向。首先，基于對(duì)佐劑性質(zhì)對(duì)免疫學(xué)效果的理論結(jié)果，可以在尺寸均一顆粒的基礎(chǔ)上通過對(duì)材料的控制、共價(jià)偶聯(lián)改性或者嫁接靶向配體，進(jìn)一步引入多個(gè)組份，使體系具有特定的功能(運(yùn)輸或靶向)和活性(免疫刺激或調(diào)節(jié))。其次，如何獲得高效而安全的“最優(yōu)組合”，使引入的各組分不只是簡單相加，而是充分發(fā)揮協(xié)同作用達(dá)到“1+1>2”的提高效果，亟需對(duì)免疫學(xué)機(jī)理進(jìn)行更深入的探討。對(duì)疫苗制劑免疫學(xué)效應(yīng)的考察，可以從細(xì)胞層面上的研究向更宏觀和微觀的層面上拓展，從分子-細(xì)胞-組織-動(dòng)物-臨床整體跨層次多尺度地動(dòng)態(tài)研究各組分之間的相互制約和協(xié)同作用，將為疫苗遞送體系的設(shè)計(jì)提供更準(zhǔn)確而全面的理論依據(jù)和指導(dǎo)。最后，絕對(duì)安全的佐劑是不存在的，但可以根據(jù)其作用機(jī)制盡可能保持微妙的平衡。如通過選擇黏膜、口服或者微針等其它遞送方式，利用佐劑對(duì)抗原的特異性靶向(如甘露糖受體)到達(dá)APCs細(xì)胞，或者通過局部淋巴結(jié)達(dá)到組織特異性，將有利于保持上述平衡，以達(dá)到最大的免疫刺激作用和最小的毒副作用。

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(編輯易毅剛)

專欄特約編輯顧忠偉

顧忠偉:男，1949年生，教授，博士生導(dǎo)師。國家“973”計(jì)劃生物材料領(lǐng)域連續(xù)三屆首席科學(xué)家，國際生物材料科學(xué)與工程Fellow，四川省學(xué)術(shù)與技術(shù)帶頭人。1981年畢業(yè)于北京大學(xué)化學(xué)系高分子專業(yè)，師從我國高分子學(xué)科創(chuàng)始人馮新德院士，1994年被評(píng)聘為教授。曾在美國北卡州RTI研究所、猶他大學(xué)生物工程系學(xué)習(xí)工作,2005年被引進(jìn)四川大學(xué)?，F(xiàn)任國家生物醫(yī)學(xué)材料工程技術(shù)研究中心主任、四川大學(xué)生物材料工程研究中心主任；中國生物材料學(xué)會(huì)副理事長、中國材料研究學(xué)會(huì)常務(wù)理事、中國生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會(huì)常務(wù)理事、四川省生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會(huì)理事長等；聚合物分子工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(復(fù)旦大學(xué))學(xué)委會(huì)委員、國家納米藥物工程技術(shù)研究中心(華中科技大學(xué))工程技術(shù)委員會(huì)委員、南開大學(xué)生物活性材料教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室學(xué)委會(huì)副主任、天津市材料復(fù)合與功能化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室學(xué)委會(huì)副主任、武漢大學(xué)生物醫(yī)用高分子教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室學(xué)

特約撰稿人胡金蓮

委會(huì)委員、中科院生態(tài)環(huán)境高分子材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室學(xué)委會(huì)委員、中科院寧波材料技術(shù)與工程研究所高分子與復(fù)合材料事業(yè)部學(xué)術(shù)與工程技術(shù)指導(dǎo)委員會(huì)委員等。長期從事生物醫(yī)用高分子、基因/藥物高效傳遞系統(tǒng)、功能納米生物材料與有序組裝等研究，從可控合成、結(jié)構(gòu)調(diào)控、新功能與多功能構(gòu)筑等方面做了一系列開創(chuàng)性工作。在AdvMater,AngewChemIntEd,ACSNano,AdvFunctMater,Biomaterials,JControlRel,Small等國際著名學(xué)術(shù)期刊上共發(fā)表論文～300篇，以及100余篇國際及全國學(xué)術(shù)會(huì)議報(bào)告摘要；授權(quán)國家發(fā)明專利20余項(xiàng)；編寫及翻譯13部專著及章節(jié)(含英文專著/章節(jié))；主持和參與生物材料國際及全國學(xué)術(shù)會(huì)議20余次；多次參與討論并撰寫關(guān)系我國生物材料發(fā)展的規(guī)劃和建議。主要研究方向：生物醫(yī)用高分子；藥物/基因遞送與控釋系統(tǒng)；納米生物醫(yī)用材料；仿生與自組裝生物材料。

特約撰稿人楊　軍

胡金蓮:女，1961年生，香港理工大學(xué)紡織及制衣學(xué)系教授，博士生導(dǎo)師；智能高分子材料領(lǐng)域活躍和多產(chǎn)的研究者之一，國際著名的形狀記憶高分子材料科技領(lǐng)域的領(lǐng)航者之一，引導(dǎo)了世界形狀記憶紡織品科技研究的潮流。主要從事智能聚合物研究，包括形狀記憶聚合物在紡織品、服裝、生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究；紡織材料的檢測(cè)、儀器測(cè)試、紡織結(jié)構(gòu)/動(dòng)力學(xué)；纖維復(fù)合材料研究以及織物外觀、織物懸垂性的數(shù)字化評(píng)估和模擬。2003年成立形狀記憶紡織品研究中心，擔(dān)任中心主任。2004年全球首創(chuàng)形狀記憶纖維素面料，并且奠定了形狀記憶聚合物在紡織上應(yīng)用的理論基礎(chǔ)。首次提出了形狀記憶聚合物性能如何與紡織品性能相結(jié)合的概念，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域上研發(fā)新物料及產(chǎn)品。

楊軍:女，1968年生，工學(xué)博士，教授，博士生導(dǎo)師。主要從事生物材料與再生醫(yī)學(xué)研究。近年來著眼于融合生物學(xué)、材料學(xué)及生物工程學(xué)的原理與技術(shù)，開發(fā)基因工程生物合成融合蛋白生物材料及其與天然多糖的復(fù)合材料；研究三維動(dòng)態(tài)仿生細(xì)胞外微環(huán)境構(gòu)建的基本機(jī)制與技術(shù)；進(jìn)一步揭示材料與細(xì)胞之間的相互作用及生物材料在體內(nèi)外促進(jìn)誘導(dǎo)組織再生的基本原理和規(guī)律；探索肝臟、血管相關(guān)組織工程支架材料及其在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用開發(fā)。發(fā)表SCI收錄論文30余篇，被SCI論文引用500余次，授權(quán)國家發(fā)明專利2項(xiàng)。

特約撰稿人馬光輝

馬光輝：女，1964年生，研究員，博士生導(dǎo)師。1988年獲得日本群馬大學(xué)纖維高分子工學(xué)科學(xué)士學(xué)位，1990年和1993年分別獲東京工業(yè)大學(xué)高分子工學(xué)科碩士和博士學(xué)位。1994～2001年任東京農(nóng)工大學(xué)生物系統(tǒng)應(yīng)用科學(xué)研究科的Assistant Professor。2001年回國后入選中科院“百人計(jì)劃”，國家杰出青年獲得者(2001 年)，“百千萬人才工程”國家級(jí)人選(2003 年)，生化工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任、國家生化工程技術(shù)研究中心主任、中國顆粒學(xué)會(huì)副理事長、中國化工學(xué)

會(huì)生物化工專業(yè)委員會(huì)副主任委員、中國生物工程學(xué)會(huì)理事等，國際期刊JMicroencapsulation，F(xiàn)rontierofChemicalScienceandEngineering編委。主要從事高分子微球和微囊的制備及其在生化工程和醫(yī)藥工程的應(yīng)用研究。發(fā)明了均一高分子微球和微囊的制備方法，解決了傳統(tǒng)攪拌分散法尺寸不均一、尺寸難以控制且需要篩分的關(guān)鍵難題。通過與GE、輝瑞、聯(lián)合利華、華蘭生物等企業(yè)合作將專利成果產(chǎn)業(yè)化，微球和微囊技術(shù)及設(shè)備在200多家單位獲推廣；在生物化工分離介質(zhì)、細(xì)胞培養(yǎng)微載體、藥物載體等領(lǐng)域獲得重要應(yīng)用。主持國家科技重大專項(xiàng)2項(xiàng)，自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目、“973”、“863”等重要課題多項(xiàng)；在JACS,AdvMater，AdvFunctMater，Biomaterials，Nanomedicine，JControlRelease等期刊發(fā)表論文210余篇，他引700余次；撰寫英文專著10部。申請(qǐng)中國發(fā)明專利75項(xiàng)，國際專利3項(xiàng)；中國發(fā)明專利授權(quán)42項(xiàng)、國際專利授權(quán)3項(xiàng)(美國2、歐洲1)。獲國家技術(shù)發(fā)明二等獎(jiǎng)(2009年)及省部級(jí)科技進(jìn)步獎(jiǎng)10余項(xiàng)。主要研究方向：生化反應(yīng)及生化分離用新型微球介質(zhì)的制備和應(yīng)用；新型納微米顆粒疫苗佐劑的制備和應(yīng)用；蛋白質(zhì)/多肽藥物緩控釋制劑以及抗癌藥物載體的制備和應(yīng)用。

The Development of Micro/Nano Particles and HydrogelBased Vaccine Delivery System

YUE Hua, MA Guanghui

(State Key Laboratory of Biochemical Engineering, Institute of Process Engineering,

Chinese Academy of Sciences, Beijing 100190, China)

Abstract：The development of novel vaccines posed several challenges for the study of adjuvant. To overcome the incapability of conventional adjuvant on cellular immune response, a series of uniform sized micro/nano-particles (MP/NPs) with different physio-chemical properties (size, charge or surface group) were prepared by using the polymer materials with good biocompatibility. MP/NPs could improve the antigen internalization, antigen presentation and T cell proliferation, which were catering for the preventive or therapeutic effect against the infectious diseases or cancer. To complement the nasal immune adjuvant, a novel thermal-sensitive hydrogel, which can undergo sol-gel transition at body temperature were developed by using the chitosan with good bioadhesion. This hydrogel could significantly prolong the antigen residence time, enhance the antigen penetration, and activate the immune cells, thus inducing strong immune responses and expanding the conventional vaccination by injection. The MP/NPs and hydrogel based adjuvant exhibited a promising era for the novel vaccine delivery system.

Key words：micro/nano particles; hydrogel; adjuvant; vaccine delivery system;membrane emulsification process

中圖分類號(hào)：R944

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1674-3962(2015)03-0216-08

DOI:10.7502/j.issn.1674-3962.2015.03.04

通訊作者：馬光輝，女，1964年生，研究員，博士生導(dǎo)師，

基金項(xiàng)目：國家科技重大專項(xiàng)(2014ZX09102045)；科技部“973”計(jì)劃項(xiàng)目(2013CB531500)；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(51302265)

收稿日期：2014-10-29