Jayakumar Gladstone Christophera, Sivaraman Ganesh , Saravanan Palanivel等著姜志偉編譯

一個生態(tài)良性的鞣前操作架構(gòu)：酶脫毛和松散纖維緊密系統(tǒng)

Jayakumar Gladstone Christophera, Sivaraman Ganesh , Saravanan Palanivel等著
姜志偉編譯

摘要：由于會產(chǎn)生大量的固體廢棄物，皮革生產(chǎn)過程中的鞣前操作總是一個具有挑戰(zhàn)性的工作。清潔生產(chǎn)是消除現(xiàn)有制革污染問題的新途徑。在清潔皮革加工技術(shù)背景下，酶是傳統(tǒng)化學(xué)品的最好替代者。目前研究在鞣前操作中使用酶，蛋白酶用于脫毛，淀粉酶用于除去纖維間質(zhì)。蛋白酶和淀粉酶可以復(fù)配和單獨用于傳統(tǒng)的浸灰和脫灰工序。在轉(zhuǎn)鼓中復(fù)合酶用量3.5%最佳。脫毛效果和纖維松散程度通過孔隙尺寸和污染負(fù)荷來評價，形貌特征通過染色和掃描電鏡觀察分析評價，也評價了坯革的物理力學(xué)性能、感官性能和視覺效果。就脫毛和一般外觀而言，復(fù)合酶的脫毛效果與傳統(tǒng)脫灰系統(tǒng)相當(dāng)。酶脫毛后藍(lán)濕革收縮溫度約為112益，成革的力學(xué)強度符合聯(lián)合國工發(fā)組織（UNIDO）規(guī)范。掃描顯微電鏡證實纖維未損傷變形。酶處理過程中，纖維緊實、松散及分布均勻。單一的酶處理步驟降低了污染負(fù)荷。本研究揭示了制革工業(yè)中酶的作用，并對現(xiàn)有的清潔生產(chǎn)系統(tǒng)提供了一個新的生物資源利用途徑。

1　前言

為了滿足污水排放限值，皮革工業(yè)面臨著來自污染控制部門嚴(yán)格的規(guī)定。眾所周知，皮革生產(chǎn)會產(chǎn)生大量的固體和液體廢棄物。研究者把精力主要集中在研發(fā)一系列清潔技術(shù)，最大限度地減少制革對環(huán)境的負(fù)面影響。制革者主要關(guān)注準(zhǔn)備和鞣制工段產(chǎn)生的高污染。傳統(tǒng)制革過程每kg原皮消耗約25～30 L水，隨后作為廢水與污染物質(zhì)一起排出。浸水至軟化操作主要目的是清潔皮質(zhì)，先決條件是皮質(zhì)和不想要的物質(zhì)結(jié)合不牢容易除去，以此減少濕操作和涂飾的化料用量。浸灰是準(zhǔn)備工段的重要操作之一，它可以脫毛、去肉、分散纖維束。傳統(tǒng)的灰堿法產(chǎn)生大量的硫化物廢物，對人類身體健康有害且難處理。此外，傳統(tǒng)的灰堿毀毛法導(dǎo)致廢水中的高COD、BOD、TDS負(fù)荷。酶法脫毛通過有選擇性地破壞膠結(jié)物質(zhì)松動毛根，并可回收毛。酶的應(yīng)用立體專一，中性pH條件下有活性，減少污染負(fù)荷，且有回收利用的可能性。酶法在脫毛和松散纖維方面的主要優(yōu)點是：完全消除石灰和硫化鈉的使用；回收高質(zhì)量的毛；較好的強度性能；增加得革率和顯著縮短作用時間。除浸灰外，準(zhǔn)備工段其他重要的操作旨在除去纖維間質(zhì)（主要是蛋白多糖，用堿性蛋白酶促進去除）。

酶常用于制革工業(yè)的脫毛。然而，為了確保充分松散纖維，酶處理后又要進行復(fù)灰，這導(dǎo)致污染負(fù)荷受到深切關(guān)注。本研究嘗試使用一種混合酶制劑復(fù)合酶（蛋白酶和淀粉酶混合配方）脫毛和松散纖維，處理流程如圖1所示。在轉(zhuǎn)鼓中進行，以縮短作用時間。

2　材料和方法

2.1材料

采用鹽濕山羊皮（4～5平方英尺），制革所用的化學(xué)品均為商業(yè)級，化學(xué)分析所用試劑為分析純。復(fù)合酶復(fù)合酶（蛋白酶和淀粉酶混合配方）由M/s United Alacrity (I) Pvt有限公司提供（蛋白酶活性100 U/g，淀粉酶活性1 000 U/g）。牛血清蛋白（BSA）、粘蛋白、Folin ciocelatu試劑、高碘酸由印度Sigmae Aldrich Chemicals提供，其他分析試劑由印度

SD Fine Chemicals提供。

圖1　制革的傳統(tǒng)和試驗流程

2.2對處理過程釋放的蛋白和蛋白多糖定量分析

取5張山羊鹽濕皮（腌制1天的）進行酶脫毛和松散纖維試驗（如表1所示）。加酶前將浴液pH調(diào)至8.5～9.0以便有效脫毛且分散纖維。所有實驗樣液用Whatman濾紙過濾。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序，用分光光度法對過濾后樣品中的蛋白和蛋白多糖進行評估。

2.2.1用Bradford法評估蛋白質(zhì)

用Bradford法評估廢液中的總蛋白含量。Bradford試劑的制備是將考馬斯藍(lán)G溶于乙醇和磷酸中。廢液樣品用Bradford試劑孵育，并用量熱法在595 nm讀數(shù)。利用BSA標(biāo)準(zhǔn)液制作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出酶作用過程廢液樣品中的蛋白含量。

2.2.2蛋白多糖的評估

高碘酸氧化復(fù)合多糖可以通過席夫堿檢測來評估。用粘蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過粘蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出廢液樣品中的蛋白多糖含量。

2.3酶處理山羊皮纖維孔隙尺寸評估分析

表1　復(fù)合酶應(yīng)用工藝配方

按Fathima等人描述的方法進行熱孔分析。TA儀器在-40～10℃范圍，升溫速率1℃/min條件下進行，每次測量前檢查基線的穩(wěn)定性。放有樣品的密封封裝鋁盤放入一個裝有DSC電池量熱儀的加熱裝置內(nèi)。使用這一技術(shù)的優(yōu)點是皮可以在濕態(tài)下測量。傳統(tǒng)的復(fù)灰裸皮（空白試驗）同樣用此法測量。

2.4染色技術(shù)

組織病理學(xué)實驗室經(jīng)常使用蘇木精和曙紅(H&E)染色，這樣病理學(xué)家或研究人員能夠非常詳細(xì)地觀察所研究的組織。雖然出現(xiàn)了幾種染色新技術(shù)，H&E染色被認(rèn)為是研究組織試樣的關(guān)鍵。對復(fù)灰和復(fù)合酶處理后的裸皮進行染色觀察，以了解其纖維取向。用光學(xué)顯微鏡和數(shù)碼相機成像分析，捕獲每個樣品的彩色影像。

2.5酶處理廢液分析

收集酶處理廢液，依照標(biāo)準(zhǔn)程序分析COD，取三個平行試驗的平均值。

2.6鉻鞣

酶處理后的皮徹底水洗，按傳統(tǒng)方法浸酸。酶處理過程pH約8～9，省去了脫灰和軟化過程，沒有用石灰。浸酸裸皮隨后按傳統(tǒng)方法用6% BCS鉻鞣劑鞣制（表2所示）。收集廢液，分析鉻的吸收率，這也間接證明皮纖維的松散程度。

2.7收縮溫度測定

表2　鉻鞣工藝配方

衡量皮革濕熱穩(wěn)定性的收縮溫度用Theis收縮試驗儀測定。從鞣制好的皮革上切取2 cm2的試樣，用夾爪兩頭夾住依次浸入水：甘油混合物（3∶1）溶液中。溶液用機器強力攪拌，溶液溫度逐漸升高，記錄試樣收縮時的溫度。

2.8鞣后操作

鞣制后的革削勻成1.1～1.2 mm的均勻厚度，頭層革鞣后操作如表3所示。然后堆放過夜，第二天伸展、繃板干燥、整軟、磨革。

2.9皮革樣品的物理測試

依據(jù)IULTCS方法對皮革樣品進行物理測試。將皮革樣品在26℃，相對濕度65%條件下調(diào)節(jié)48 h，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法測試其物理性能如抗張強度、伸長率、撕裂強度和粒面脆裂強度。每一個給出的值是四次測量的平均值（兩個縱向，兩個橫向）。

2.10感官特性評價

通過感官評價鞋面革的柔軟性、粒面平滑性、豐滿性和外觀進行評價。三個經(jīng)驗豐富的制革人員對皮革的每項性能進行打分，分值為0～10分。

2.11坯革掃描電子顯微鏡分析

空白和試驗坯革樣品按規(guī)定的取樣位置取樣。按照標(biāo)準(zhǔn)程序，試驗樣品先用水洗，然后用丙酮和

甲醇逐漸脫水。用Quanta 200掃面電子顯微鏡進行分析。通過在5 kV加速電壓和不同放大倍數(shù)下操作掃面電子顯微鏡，獲得粒面和橫截面顯微照片。

表3　藍(lán)濕革制作鞋面革鞣后操作配方

2.12統(tǒng)計分析

物理強度性質(zhì)試驗一式三份，數(shù)據(jù)為平均值± SD，p＜0.05就認(rèn)為是顯著的。統(tǒng)計分析使用Student's t-test。

3　結(jié)果與討論

3.1同步脫毛和松散纖維酶配方的標(biāo)準(zhǔn)化

酶脫毛和松散纖維過程的優(yōu)化有賴于酶的濃度。基于酶的活性，采用了四種不同的酶濃度：2.5%、3.0%、3.5%、4.0%（以山羊原皮質(zhì)量計）。同步脫毛和纖維松散過程按表1進行，包括用300%的水兩步浸水，接著使用30%的水、2.5%～4.0%的酶濃度轉(zhuǎn)鼓中進行酶處理?？倳r間6 h，每小時轉(zhuǎn)10 min，停50 min。然后在轉(zhuǎn)鼓中靜置過夜（12 h）。早期的研究報道需要24 h才能完全脫毛。圖2顯示了本實驗的作用時間、脫毛效率、纖維松散程度和裸皮質(zhì)量。從圖中可以看出，復(fù)合酶用量3.5%和4.0%脫毛完全，而酶用量2.5%和3.0%，脫毛不完全。復(fù)合酶用量2.5%時因濃度低氣味小。根據(jù)評估研究，復(fù)合酶用量3.5%時脫毛效果較好，粒面平滑，氣味較小。因此將復(fù)合酶最佳用量定為3.5%。進一步研究，根據(jù)蛋白多糖的釋放、鉻的吸收率、革的力學(xué)性能、皮中纖維的形態(tài)分布來評價酶的作用效果。蘇木精和伊紅染色方法用于皮革制備過程中直觀視覺評估纖維取向。通過熱孔分析試驗了解酶處理時孔隙大小分布（增加或減少）。還進行了鉻吸收、污染負(fù)荷和經(jīng)濟分析，以了解酶的重要性。本研究對同步脫毛和松散纖維過程提供了定性和定量評估。

3.2酶處理后釋放的多糖

表4　釋放于廢水中的蛋白和多糖

圖2　復(fù)合酶處理后山羊皮評估等級

在傳統(tǒng)復(fù)灰過程中多糖的釋放量是纖維松散程度的標(biāo)志。通過評估廢液中釋放的多糖和蛋白質(zhì)來檢驗復(fù)合酶松散纖維的程度。淀粉酶對催化水解分裂特定的糖苷鍵具有高度特異性。當(dāng)用淀粉酶處理皮時，最初可能顯著影響皮基質(zhì)蛋白多糖糖苷鍵的斷裂，特別是與膠原基質(zhì)鍵接的蛋白多糖。使用它們的標(biāo)準(zhǔn)曲線和表4給出的數(shù)據(jù)可計算多糖和蛋白質(zhì)的濃度予以評估。由于酶的活性，廢液中釋放的大量的蛋白和多糖。由于白蛋白和球蛋白的釋放以及酶的存在，酶處理液中蛋白濃度較高。試驗觀察到的結(jié)果與Madhan等人在傳統(tǒng)浸灰過程中觀察到的結(jié)果一致。然而，對廢液進行羥脯氨酸含量測試，以檢測皮質(zhì)是否由于酶的作用而降解，結(jié)果顯示本試驗廢液中未檢出羥脯氨酸。這表明脫毛和松散纖維過程中皮質(zhì)未被降解。

3.3復(fù)合酶處理后山羊皮的孔隙尺寸評價

圖3　復(fù)灰（A)和復(fù)合酶處理(B)山羊皮孔隙尺寸分布

在皮革生產(chǎn)過程中，皮的孔隙尺寸是重要的因素之一。鞣劑、加脂劑、染料、復(fù)鞣劑等化學(xué)品的擴散主要通過皮的孔隙進入皮內(nèi)。通常，皮的孔隙充滿了纖維間質(zhì)如彈性蛋白、網(wǎng)狀蛋白、蛋白聚糖與非膠原纖維蛋白。這些材料對于皮實現(xiàn)其生理功能是非常重要的。在皮革生產(chǎn)過程中，這些纖維間質(zhì)阻止了化學(xué)品的擴散。所以，為了使化學(xué)品能在皮中較好地擴散，需要除去這些物質(zhì)。酶松散纖維選擇性裂解纖維間質(zhì)，確保均勻裂解出蛋白多糖。圖3A 和3B顯示了酶和石灰處理后山羊皮的孔隙分布。從圖中可以看出，酶處理明顯有助于打開皮的孔隙，酶處理的皮孔隙尺寸分布更均勻，其范圍從10～100 nm，而空白試驗是10～50 nm?？紫冻叽绶植季鶆蚓湍鼙ＷC化學(xué)品擴散均勻，成革的表面粒紋就均勻。傳統(tǒng)的準(zhǔn)備操作，孔隙尺寸分布被限制在60 nm，而酶松散纖維過程中裸皮孔隙尺寸分布范圍從10～100 nm。

3.4復(fù)合酶處理山羊皮的組織學(xué)特征

將原料皮、復(fù)灰皮、復(fù)合酶處理皮用蘇木精和曙紅（H&E）進行染色，以研究皮在脫毛和纖維松散后的組織學(xué)特征。組織學(xué)研究揭示酶處理前后皮質(zhì)中纖維取向的致密性。染色的差異性表明皮在不同處理階段的纖維取向。用福爾馬林固定的充水皮樣沿毛囊切割成7 μm厚的薄片，然后用H&E染色，置于光學(xué)顯微鏡下觀察。這些彩色圖像可以視覺觀察到皮纖維間質(zhì)去除情況。圖4 A-C為原料皮、脫灰皮和復(fù)合酶處理皮的染色圖像。從圖中可見，皮質(zhì)由膠原蛋白、網(wǎng)狀蛋白、彈性蛋白和其他非膠原蛋白組成，真皮區(qū)的纖維取向比原料皮更有序。復(fù)灰的皮纖維比酶處理的更松

弛，這主要是由于石灰的感膠離子效應(yīng)影響。復(fù)灰皮和酶處理皮纖維取向一致，這表明皮中的非膠原基質(zhì)被選擇性去除了。這證實酶處理的裸皮與傳統(tǒng)復(fù)灰裸皮相似，不影響材料的強度。

圖4　H&E染色原料皮（A）、復(fù)灰皮（B）和復(fù)合酶處理皮（C）的顯微照片

3.5酶處理廢液特性

按標(biāo)準(zhǔn)程序分析酶處理廢液的COD值，給出的值為三個平行試驗的平均值。酶處理廢液的COD約為8 000 mg/kg，而傳統(tǒng)過程約為26 432 mg/kg。傳統(tǒng)處理過程的值較高是由于毛的降解對COD貢獻較大。反之，酶處理不僅回收毛，且不使用石灰和硫化鈉，因此其廢水中的COD顯著降低。這證明了復(fù)合酶脫毛和分散纖維的效果。這種方法可以徹底消除石灰污泥和有毒氣體。傳統(tǒng)復(fù)灰裸皮通常要進行脫灰以去除復(fù)灰階段添加的石灰。脫灰時會釋放有害氣體。因此，復(fù)合酶處理的另一個優(yōu)點是避免了脫灰，裸皮直接進行浸酸。這種方法明顯地減少了化學(xué)品的使用，降低了污染負(fù)荷，省掉了目前的脫灰、軟化過程。

3.6藍(lán)濕皮中的鉻含量

復(fù)合酶處理后按傳統(tǒng)方法進行鞣制。然后陳放過夜，評價其各種性能如鉻含量、皮對鉻的吸收率。復(fù)合酶處理后鞣制的皮鉻含量為3.9%，皮對鉻的吸收率約89%，濕熱穩(wěn)定性約為112℃，鉻含量和收縮溫度都比較高。鉻吸收率高主要是由于酶處理過程纖維束分散比較好，去除纖維間質(zhì)好。

3.7藍(lán)濕革的視覺評估

在皮革生產(chǎn)的不同階段，裸皮呈現(xiàn)出不同的形態(tài)。不同等級的皮革價格也不同。發(fā)生形態(tài)改變主要是在藍(lán)濕革階段。因此，這一階段出現(xiàn)的任何缺陷都會影響皮革的質(zhì)量，需要在濕操作后的涂飾工序中需要加以彌補。在鉻鞣后期會遇到鉻斑和鉻吸收不好的問題。為了建立酶處理藍(lán)濕皮的最終質(zhì)量診斷，進行了視覺評估，結(jié)果列于表5。所有的指標(biāo)即粒面平滑性、色澤、鉻斑和外觀都不錯。綜合評價結(jié)果表明，酶處理的皮革和傳統(tǒng)方法處理的皮革一樣沒有鉻斑，且外觀優(yōu)于傳統(tǒng)方法處理的皮革。

表5　藍(lán)濕革的視覺評估數(shù)據(jù)

3.8坯革的物理性能

復(fù)合酶處理后，坯革的力學(xué)性能如抗張強度、撕裂強度和粒面崩裂強度列于表6。山羊面革的抗張強度為260 kg/cm2，撕裂強度43 kg/cm。酶處理后坯革的粒面崩裂強度符合規(guī)范。根據(jù)聯(lián)合國產(chǎn)業(yè)發(fā)展組織規(guī)范，強度特性表明復(fù)合酶處理后的皮具有較好的抗張強度和撕裂強度。

3.9復(fù)合酶處理后坯革的感官性能

復(fù)合酶處理后坯革的感官性能列于表7。用眼觀手摸的方法，對皮革的豐滿性、柔軟性、粒面緊實性、圓潤性、染色性和外觀等性能進行了評價。數(shù)字越大表明性能越好。結(jié)果表明，酶處理皮革緊實度較高，粒面平滑性、粒面緊實性、圓潤性、染色性和強度與傳統(tǒng)處理的皮革相當(dāng)。

表7　山羊面革的感官性能

表6　頭層革的強度性質(zhì)（表中值表示為平均值±SD，n=3，ρ＜0.05認(rèn)為顯著）

圖5　復(fù)合酶處理山羊皮掃描電鏡顯微圖像（a：表面，b：橫截面）

圖6　藍(lán)濕革掃描電鏡顯微圖像（a：表面，b：橫截面）

圖7　山羊坯革掃描電鏡顯微圖像（a：表面，b：橫截面）

3.10掃描電鏡評價復(fù)合酶對皮質(zhì)的影響

使用顯微技術(shù)觀察了山羊皮在不同制革階段的的形貌變化，觀察了纖維取向、纖維分散、纖維束的致密性。這種方法定性地確定了復(fù)合酶在皮革生產(chǎn)中的作用。圖5～7顯示的是復(fù)合酶處理后裸皮、藍(lán)濕革、坯革的粒面和橫截面的電子掃描顯微圖像。從圖中可以看出，酶處理后的皮表面性能沒有顯著變化。圖6顯示藍(lán)濕革樣品纖維取向均勻、規(guī)整。山羊藍(lán)濕革樣品纖維表現(xiàn)出非常有序和結(jié)構(gòu)密實，特別是在粒面層和真皮的主要連接層之間。纖維的密實和有序主要是因為纖維束的有效分散，使鉻的吸收率高。如圖7所示，坯革的纖維結(jié)構(gòu)更致密，整個橫截面松散均勻。纖維束的有序分散使后續(xù)化料如復(fù)鞣劑、染料、加脂劑在皮中擴散更好。

3.11同步脫毛和松散纖維系統(tǒng)的經(jīng)濟可行性

應(yīng)用配方復(fù)合酶（蛋白酶和淀粉酶）可有效地脫毛和去除纖維間質(zhì)。新制革清潔技術(shù)的工業(yè)應(yīng)用，可能從實驗室規(guī)模獲得較好的皮革強度開始。商業(yè)酶產(chǎn)品（蛋白酶活力100 U/g，淀粉酶活力1 000 U/g，用量3.5%）來自印度金奈的美國Alacrity (I)私人有限公司，所獲得的皮革質(zhì)量顯示出了良好的前景。傳統(tǒng)制革過程使用化學(xué)品的成本為每噸原皮約54美元，而酶處理過程花費的化料成本約為每噸原皮55美元，去掉了脫灰、軟化等中間過程。本法完全不用石灰和硫化物，使污水中的硫化物含量為零，脫灰過程也省去了。傳統(tǒng)方法軟化時使用堿性蛋白酶去除短毛和脫灰后遺留的纖維間質(zhì)，因此本方法也可省去軟化步驟。使得制革過程中使用酶又不增加制革成本成為可能，同時酶處理過程降低了COD和TS負(fù)荷，降低了污水處理成本。本方法與傳統(tǒng)方法比較，降低了COD。由于酶處理，使得坯革的面積大約增加了2%。本方法同時使用了蛋白酶和淀粉酶，與傳統(tǒng)方法比較增加了得革率。按增加3%的面積計算，每噸原料皮節(jié)省570美元。傳統(tǒng)的準(zhǔn)備操作要處理浸灰污泥，導(dǎo)致經(jīng)濟和生態(tài)問題。總之，這些新方法有利于制革者采取生態(tài)友好的制革方法，減少污染負(fù)荷，不增加制革成本。

4　結(jié)論

本研究涉及準(zhǔn)備工段使用酶的清潔工藝。當(dāng)復(fù)合酶用量3.5%時，可達到有效的脫毛和松散纖維效果。建立了染色和熱孔測量法，作為了解制革過程中纖維松散情況的工具。復(fù)合酶處理后的皮質(zhì)用蘇木精和曙紅染色，顯微圖像證明纖維束分散良好、有序?？紫冻叽绶植几鶆?，酶處理的裸皮孔隙尺寸10～100 nm，而傳統(tǒng)方法處理的裸皮孔隙尺寸只有10～50 nm。一般參數(shù)如粒面平滑性、染色性、鉻斑和外觀可與傳統(tǒng)灰堿法處理的裸皮媲美。復(fù)合酶處理后鞣制的藍(lán)濕皮鉻吸收率為89%，收縮溫度112℃。山羊面革的抗張強度和撕裂強度分別為260 kg/cm2和43 kg/cm。坯革的力學(xué)性能符合工發(fā)組織規(guī)范，這是一種有效的皮革加工方法。其形態(tài)特征證明酶處理過程纖維分散良好，坯革纖維緊實表明鉻和鞣后化學(xué)品吸收率高。環(huán)境參數(shù)受益于化學(xué)品吸收率高，降低了污染負(fù)荷。本研究直指皮革生物過程新領(lǐng)域，滿足了鞣前操作所面臨問題的解決。

（編譯自：Journal of Cleaner Production，83 (2014) 428-436）