周秀軍，周利芳，周建民，隋喜龍（威海天智皮毛制品有限公司，山東文登264400）

脂肪酶的制備及其在皮革工業(yè)中的應(yīng)用

周秀軍，周利芳，周建民，隋喜龍
（威海天智皮毛制品有限公司，山東文登264400）

摘要：來(lái)源于微生物的脂肪酶在皮革工業(yè)中的應(yīng)用具有無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)。本文綜述了產(chǎn)酶菌株的篩選（觀察透明圈和變色圈）、選育（馴化、誘變或者基因工程手段）和分離純化技術(shù)（膜處理、層析、免疫純化、雙水相萃取、反膠團(tuán)萃取等）。使用脂肪酶處理的皮革顏色均勻、表皮清潔，產(chǎn)品在防水性和低霧化等方面較優(yōu)。

關(guān)鍵詞：脂肪酶；菌株篩選；菌株誘變選育；分離；純化

1　前言

脂肪酶（Lipase, EC 3.1.1.3），也稱三?；视王；饷?，廣泛存在于動(dòng)、植物和微生物體內(nèi)，是一類水解和合成長(zhǎng)鏈脂肪酸甘油酯的生物催化劑，在油脂加工、洗滌、食品加工、醫(yī)藥、化妝品、皮革加工、飼料、造紙、有機(jī)合成、精細(xì)化工以及生物能源等諸多領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用[1]。

脂肪酶不僅可水解三脂酰甘油生成二脂酰甘油和脂肪酸，而且能催化水解反應(yīng)的逆反應(yīng)-酯化反應(yīng)。由于具有應(yīng)用范圍廣及易于生產(chǎn)等特點(diǎn)，微生物脂肪酶已經(jīng)成為一類在生物技術(shù)方面具有重要應(yīng)用價(jià)值的產(chǎn)品，脂肪酶是繼蛋白酶和糖酶之后的第三大類具有應(yīng)用價(jià)值的酶，應(yīng)用范圍很廣，每年脂肪酶的交易額有10億美元[2-3]。

2　脂肪酶的來(lái)源

表1　主要產(chǎn)脂肪酶的微生物

脂肪酶是科研研究中被關(guān)注最早的酶類之一，已經(jīng)有100多年的歷史[4]。脂肪酶廣泛存在于動(dòng)物、植物組織中及微生物中，尤其是微生物所產(chǎn)的脂肪酶有很多方面的優(yōu)勢(shì)，例如，能夠不被季節(jié)、氣候等環(huán)境的因素所影響，有利于連續(xù)進(jìn)行工業(yè)化的發(fā)酵生產(chǎn)；產(chǎn)酶所需的周期短、發(fā)酵獲得的產(chǎn)物比較單一，易純化；微生物脂肪酶具有異構(gòu)體選擇性、耐有機(jī)溶劑、高度位置選擇性、底物專一性和高催化活性等特點(diǎn)[5]。因此，微生物來(lái)源的脂肪酶研究有很高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，引起各國(guó)科研人員的廣泛關(guān)注，在理論研究上的發(fā)展迅速，帶動(dòng)了脂肪酶在工業(yè)生產(chǎn)實(shí)際開(kāi)發(fā)中的應(yīng)用[6]。目前脂肪酶的研究已成為酶學(xué)研究者關(guān)注的重點(diǎn)，使其在食品及醫(yī)藥生產(chǎn)、油脂的水解和改性、皮革的脫脂以及化妝品添加劑等各個(gè)方面得到了非常廣泛的應(yīng)用[7]。

表1列舉了一部分國(guó)內(nèi)外已經(jīng)報(bào)道的主要產(chǎn)脂肪酶的微生物種類[8]。

3　脂肪酶生產(chǎn)菌株的篩選及誘變選育

3.1脂肪酶生產(chǎn)菌株的篩選

目前篩選產(chǎn)脂肪酶菌株的方法追求的是快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)捷、選擇性強(qiáng)等特點(diǎn)，依據(jù)應(yīng)用對(duì)象、微生物的種類和酶特異性的不同，對(duì)于能夠生產(chǎn)脂肪酶的微生物菌株的篩選方法也各有特色。篩選脂肪酶菌常用的方法是采用含甘油三酯瓊脂平板。首先采集含油污土壤樣品或其它雜物如油垢、廢油布等，無(wú)菌水梯度稀釋樣品，涂平板，培養(yǎng)，觀察平板上菌落周圍透明圈或通過(guò)在培養(yǎng)基中添加指示劑如羅丹明B、澳甲酚紫、維多利亞藍(lán)等作為篩選標(biāo)記，觀察變色圈的大小。透明圈和變色圈的有無(wú)與大小說(shuō)明菌株產(chǎn)脂肪酶的能力，即透明圈和變色圈越大，菌株產(chǎn)脂肪酶能力可能越大[9]。

（1）觀察透明圈的方法。將處理好的樣品均勻地涂布在含有甘油三酯的固體平板上，根據(jù)菌株的直徑與透明圈直徑的比率，確定菌株產(chǎn)脂肪酶的能力大小。如Cardena等[10]、宋欣等[11]將從土壤中采集到的樣品先進(jìn)行富集培養(yǎng)，然后吸取一部分富集液均勻涂布在含有橄欖油成分的初篩用的平板上，待菌體長(zhǎng)出后觀察平板上菌落周圍透明圈的大小來(lái)選定所需要的菌株；王美英[12]、謝舜珍等[13]則是選用油同化的平板，即利用油脂作為碳源并且是唯一的碳源進(jìn)行同化試驗(yàn)，均篩選出了活性比較高的產(chǎn)脂肪酶的菌株。

（2）觀察變色圈的方法。在固體培養(yǎng)基中加入指示劑作為篩選標(biāo)記，觀察菌落周圍變色圈的大小，其變色圈越大，說(shuō)明此菌株生產(chǎn)脂肪酶的能力越大。常用的指示劑主要有三種，分別是溴甲酚紫，羅丹明B和維多利亞藍(lán)。例如Yeoh等[14]利用可生色的底物篩選得到了對(duì)不同碳鏈長(zhǎng)度脂肪酸具有特異性的產(chǎn)脂肪酶的菌株；馬抒晗等[15]以橄欖油為唯一碳源、羅丹明B為指示劑的培養(yǎng)基進(jìn)行初篩，搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，從70份含油脂豐富的樣品中篩選出

產(chǎn)脂肪酶酶活較高的菌株；施巧琴[16]、張嬋等[17]利用脂肪酸能夠與維多利亞藍(lán)反應(yīng)，從而呈現(xiàn)出藍(lán)綠色透明圈的原理，篩選出能夠產(chǎn)脂肪酶的菌株；李春華[18]的初篩過(guò)程則是以維多利亞藍(lán)B作為指示劑，復(fù)篩過(guò)程是以羅丹明B作為指示劑，最終也篩選獲得了能夠產(chǎn)脂肪酶的菌株。

3.2脂肪酶高產(chǎn)菌株的選育

從自然環(huán)境中經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單篩選而分離得到的產(chǎn)酶菌株雖然具備了一定的產(chǎn)酶能力，但是要達(dá)到某種特定代謝產(chǎn)物的大量積累，實(shí)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)、高質(zhì)量和低消耗的高效轉(zhuǎn)化，則需要對(duì)菌株進(jìn)行選育或改良，以提高脂肪酶產(chǎn)量或者解除、突破微生物自身的代謝調(diào)控。提高菌株脂肪酶產(chǎn)量的途徑，主要有菌種改良和發(fā)酵工藝優(yōu)化兩種途徑[19]（發(fā)酵工藝優(yōu)化不在本文討論范圍內(nèi)）。菌種改良的途徑主要有菌種馴化、誘變育種和基因工程改造等。

3.2.1菌種馴化

通過(guò)定向誘導(dǎo)以及貧瘠培養(yǎng)馴化可使產(chǎn)酶菌株對(duì)簡(jiǎn)單底物的利用能力加強(qiáng)，在一定程度可以提高菌株的產(chǎn)酶活力。與發(fā)酵工藝優(yōu)化有異曲同工之處，同時(shí)它也是退化菌種復(fù)壯的常用手段之一。

3.2.2誘變育種

誘變育種是微生物改良的常用方法，就是利用物理、化學(xué)等誘變劑處理均勻而分散的微生物細(xì)胞群，在大大提高其突變頻率的基礎(chǔ)上，采用適當(dāng)?shù)暮Y選方法獲得所需要的突變菌株，以供科學(xué)實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)實(shí)踐使用[20-21]。

誘變劑的種類很多，主要使用的有物理誘變劑和化學(xué)誘變劑。目前，以紫外線、亞硝基胍、亞硝酸、硫酸二乙酯、快中子等理化因子作為誘變劑，利用低溫、溴化乙錠、膽鹽、制霉菌素、克霉唑、檸檬酸鈉、琥珀酸鈉、丁酸、己酸、三丁酸甘油酯等作為正突變篩選劑的誘變策略，已成功應(yīng)用于擴(kuò)展黑曲霉、青霉、假單胞菌、酵母等多種產(chǎn)脂肪酶菌株的誘變篩選。采用上述誘變和篩選方法,一般可以將脂肪酶產(chǎn)量提高1～10倍，最高可達(dá)40倍[22-23]。

3.2.3構(gòu)建脂肪酶基因工程菌

利用基因工程改造菌株主要有隨機(jī)突變與定點(diǎn)突變兩種方式。隨機(jī)突變即通過(guò)誘導(dǎo)不同突變產(chǎn)生大量突變菌株，再根據(jù)不同目的利用有效的篩選方法得到產(chǎn)酶量大幅提高的突變株。定點(diǎn)突變是篩選具有某一相關(guān)特性的變異株，再?gòu)钠渲泻Y選或誘導(dǎo)出高產(chǎn)菌株，從而可大大提高篩選品質(zhì)和效率，且一定程度上克服了誘變育種的盲目性。目前，利用分子生物學(xué)手段篩選脂肪酶高產(chǎn)菌株己受到研究人員的重視[24]。通常情況下利用常規(guī)育種方法難以滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要，通過(guò)基因工程手段克隆脂肪酶基因，并研究其基因表達(dá)調(diào)控，可以大幅提高脂肪酶的產(chǎn)量。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)和曲霉表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最為廣泛的三種異源表達(dá)系統(tǒng)，許多脂肪酶基因均在這些表達(dá)系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)了大量表達(dá)[25]。此外，通過(guò)改造脂肪酶基因及分泌蛋白基因以提高脂肪酶產(chǎn)量、活性和穩(wěn)定性也有許多成功的報(bào)道[26]。微生物脂肪酶的高效生產(chǎn)僅僅靠脂肪酶基因的高效表達(dá)還是不夠的，還需要酶蛋白質(zhì)的有效折疊和分泌，基因工程技術(shù)和新生產(chǎn)技術(shù)的聯(lián)合使用改善了工業(yè)用酶的性能，提高了產(chǎn)品質(zhì)量，降低了生產(chǎn)成本，同時(shí)也減少了對(duì)環(huán)境的影響。

4　脂肪酶的分離與純化

酶的分離純化是指將酶從細(xì)胞，或者其他酶原料中提取出來(lái)，并且與雜質(zhì)分開(kāi)，從而獲得符合目的要求的酶制品的過(guò)程。主要包括細(xì)胞的破碎，目標(biāo)酶的提取，提取物的離心分離、過(guò)濾與膜分離，沉淀分離，層析分離，電泳分離，萃取分離，濃縮，干燥，結(jié)晶等[27]。

大部分微生物脂肪酶均為胞外酶，發(fā)酵后通過(guò)離心或抽濾除去菌體，得到的含酶上清液通過(guò)硫酸銨沉淀或有機(jī)溶劑萃取濃縮，除去部分雜蛋白質(zhì)和糖類，然后再用層析法進(jìn)一步純化。除了少部分基因工程菌能夠高效表達(dá)功能性脂肪酶，絕大部分野生型菌株都要聯(lián)合兩種以上的層析方法純化才能獲得預(yù)期純度的蛋白質(zhì)[20，28]。目前，脂肪酶的分離純化技術(shù)主要包括膜處理技術(shù)、層析技術(shù)、免疫純化

技術(shù)、雙水相萃取、反膠團(tuán)萃取技術(shù)及納米機(jī)破碎法等。

4.1膜處理技術(shù)

膜的錯(cuò)流過(guò)濾可以從培養(yǎng)基中分離失去生物活性的細(xì)胞，應(yīng)用于脂肪酶的純化，能夠濃縮含有脂肪酶的上清液。目前，具有毛細(xì)作用的超濾膜主要研究聚丙烯腈（PAN）和聚砜（PS）兩種，以往的研究發(fā)現(xiàn)，透過(guò)這兩種膜的脂肪酶流量明顯減少，這種影響在親水的PAN膜上尤為明顯，可純化15倍；而在PS膜上卻并不十分顯著，僅可純化3倍；因此，PS膜更適宜用于濃縮酶，而PAN膜則常用于分餾酶。在PAN膜上，15%的蛋白質(zhì)可以被吸收，這些蛋白質(zhì)具有30%的活性；而在PS膜有30%的蛋白質(zhì)能夠被吸收，這些蛋白質(zhì)具有40%的活性。經(jīng)過(guò)超濾膜處理的蛋白質(zhì)損失為15%～30%，酶活損失為30%～40%[29]。

4.2層析技術(shù)

傳統(tǒng)分離方法的層析技術(shù)包括離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析、疏水層析。脂肪酶產(chǎn)生菌株中只有少數(shù)基因工程菌能夠?qū)⒐δ苄灾久父咝П磉_(dá)，大部分微生物脂肪酶產(chǎn)生的菌株是野生型菌株，產(chǎn)生的酶成分復(fù)雜，單一純化方法很難得到較高純度的酶蛋白。由此看來(lái)，兩種或多種層析方法聯(lián)合進(jìn)行，并進(jìn)行多步純化是必要的。

4.3免疫純化技術(shù)

免疫純化是一種極具親核力和高選擇性的高效純化方法，這種方法經(jīng)一步反應(yīng)將酶純化1 000 ～ 10 000倍[30]。高效的抗體可以分離性質(zhì)十分相似的抗原，而且克服了許多其他方法無(wú)法解決的難題。但是免疫純化法費(fèi)用昂貴。

4.4雙水相萃取技術(shù)

雙水相（Aqueous Two phase System，ATPS）是指不同種類聚合物溶液混合或者聚合物水溶液和鹽溶液混合且當(dāng)聚合物和鹽濃度達(dá)到一定值，混合液靜置后分層產(chǎn)生兩液相或多液相系統(tǒng)[31]。

4.5反膠團(tuán)萃取技術(shù)

近年來(lái)，在非水相提取方面發(fā)展的一項(xiàng)新技術(shù)為反膠團(tuán)提取生化物質(zhì)。AOT(二(2-乙基己烷)丁二酸磺酸鈉)/異辛烷反膠團(tuán)從發(fā)酵液中萃取脂肪酶[30，32-34]。

5　脂肪酶在皮革脫脂中的應(yīng)用

脂肪酶最早的應(yīng)用是利用它來(lái)分解油脂以釋出短鏈脂肪酸，以增加或改進(jìn)食品的風(fēng)味，促進(jìn)干酯熟化，也可以生產(chǎn)代可可脂；利用脂肪酶可催化水解脂類生產(chǎn)脂肪酸和甘油，也可催化酯化反應(yīng)獲得一些特殊的脂類物質(zhì)；隨著非水相酶學(xué)的深入研究大大拓展了脂肪酶的應(yīng)用領(lǐng)域，利用其在有機(jī)相中所催化的反應(yīng)已合成許多高價(jià)值產(chǎn)品[35-36]。

脫脂是處理動(dòng)物生皮中一個(gè)基本的步驟。脂肪酶可以去除皮中的油脂。酸性和堿性的脂肪酶都可以用來(lái)脫脂。脂肪酶水解甘油三磷酸(甘油三磷酸是動(dòng)物皮中的主要儲(chǔ)存物)為甘油和游離的脂肪酸。加入堿穩(wěn)定的蛋白酶可以更加有效地去除細(xì)胞膜和皮脂腺上的脂肪化合物。脫灰和軟化也可使用脂肪酶。經(jīng)過(guò)鹽漬的皮革可以用酸性脂肪酶來(lái)處理[37]。使用脂肪酶的優(yōu)點(diǎn)在于可以使皮革顏色均勻、表皮清潔。

堿性脂肪酶用于浸水和浸灰時(shí)，與蛋白酶聯(lián)合使用效果更好。使用脂肪酶脫脂在大多數(shù)情況下沒(méi)有必要再使用表面活化劑，這有助于產(chǎn)品的防水性和低霧化。酸性脂肪酶可以用于鹽漬的原皮或藍(lán)濕皮處理。在制革工業(yè)中，傳統(tǒng)的動(dòng)物皮處理使用石灰和硫化鈉的混合物來(lái)脫毛，這種方法操作麻煩并且容易產(chǎn)生污染。皮上的殘余脂肪和蛋白通過(guò)化學(xué)過(guò)程如浸灰等來(lái)去除效果不好[38]。為此，使用脂肪酶和蛋白酶混合軟化己經(jīng)成為慣例[39]。酶可以松散并且去除皮革上的毛，然后通過(guò)過(guò)濾除去。這樣最終產(chǎn)品要比傳統(tǒng)方法生產(chǎn)的皮革質(zhì)量高很多。

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基金資助：國(guó)家星火計(jì)劃（2013GA740002）

Progress in Preparation of Lipase and its Application in Leather Industry

ZHOU Xiu-jun, ZHOU Li-fang, ZHOU Jian-min, SUI Xi-long
(Weihai Tianzhi Fur Products Co., Ltd. Wendeng 264400 ,China)

Abstract:Application of lipase prepared from microorganisms in leather industry exhibits outstanding advantages. This review introduces the strain selection methods such as observation for transparent circle and colouring circle, breed methods including domestication, mutation and genetic engineering, and separation and purification techniques, e.g. membrane treatment, chromatography, immune purification, aqueous two-phase extraction, and reverse micelle extraction technologies. The obtained leather with lipase treatment possesses more uniform color, cleaner grain, better waterproof property and lower fogging value.

Key words:lipase; strain selection; mutation breeding of strain; separation purification

作者簡(jiǎn)介：第一周秀軍（1970 -），男，山東文登人，本科，主要從事毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖和毛皮加工工作，E-mail：zhouxiujun888@sina.com。

收稿日期：2015-09-27

中圖分類號(hào)：TS 529.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1671-1602（2015）20-0016-05