宋堅，何舟，程龍，龐云龍，寧軍號，常亞青

(大連海洋大學水產(chǎn)與生命學院，農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧 大連 116023)

飼料添加苜蓿草粉對刺參幼參生長、體成分及免疫酶的影響

宋堅，何舟，程龍，龐云龍，寧軍號，常亞青*

(大連海洋大學水產(chǎn)與生命學院，農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧 大連 116023)

摘要：為了探究紫花苜蓿草粉的適宜添加比例，研究了苜蓿草粉的添加水平依次為0(對照)，5%(A1)，10%(A2)，15%(A3)和20%(A4) 的5種飼料對刺參幼參(3.16±0.66) g生長、體成分和免疫酶活性的影響。結果顯示，刺參特定生長率(SGR)的最大值(0.73%)和餌料系數(shù)(FCR)的最小值都出現(xiàn)在A2組。A2組刺參的粗蛋白含量最高(52.10%)，顯著高于A1與A4組(P<0.05)。A4組刺參的過氧化氫酶(CAT)活力值最高(142.28 U/mL)，顯著高于A0、A1與A2組(P<0.05)；A3組刺參的超氧化物歧化酶(SOD)活力值最高(136.58 U/mL)，顯著高于A0組(P<0.05)； A3組刺參的溶菌酶(LZM)含量最高(1.92 μg/mL)，顯著高于A0、A1與A2組(P<0.05)。結果表明，當苜蓿草粉的添加比例為10%左右時，實驗刺參的養(yǎng)殖效果最佳。

關鍵詞：紫花苜蓿；刺參；生長；體成分；免疫酶

刺參又名仿刺參(Apostichopusjaponicus)，屬于棘皮動物門(Echinodermata)、海參綱(Holothuroidea)、仿刺參屬(Apostichopus)，是溫帶海洋中常見的無脊椎動物之一。刺參具有很高的營養(yǎng)和藥用價值，其經(jīng)濟價值可稱之為“參”中之冠，位列海產(chǎn)八珍之首[1-2]。在中國、日本和韓國，海參很早就被開發(fā)為重要的漁業(yè)資源。紫花苜蓿(Medicagosativa)是一種多年生豆科牧草，具有產(chǎn)量高、營養(yǎng)豐富等特點，素有“牧草之王”之稱。將草粉按適宜比例加入飼料中，會對動物的生長性能、免疫機能及其產(chǎn)品品質(zhì)等產(chǎn)生眾多有益影響[4-6]。

目前，我國在刺參幼參階段，其餌料主要包括海泥、人工配合飼料和大型海藻磨碎液。由于各種原因，鼠尾藻(Sargassumthunbergii)等大型藻類的價格不斷上漲，飼料開始成為限制刺參苗種與養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素。因此，尋求充足廉價的替代品已成為當務之急[7-9]。例如，現(xiàn)在不少研究者或單位采用滸苔(Enteromorphaprolifera)[7,10]、海帶(Laminariajaponica)[7,11]和陸生植物淀粉[9,12]等進行了替代性研究。

到目前為止，關于苜蓿應用于牲畜家禽方面的研究很多[13-16]。但在水生生物方面，僅在團頭魴[17]、草魚[18]和鯉魚[19-20]等魚類中有少量報道，刺參方面僅李旭等[21]以苜蓿草粉為主成分進行了飼喂刺參的試驗，但苜蓿草粉的使用效果及其最適添加量尚未確定。鑒于紫花苜蓿營養(yǎng)豐富且來源廣泛易得，本研究通過探討含不同比例紫花苜蓿草粉的飼料對刺參幼參生長、體成分以及免疫酶影響，以確定對刺參的生長具有促進作用的苜蓿草粉的適宜添加比例，并為刺參營養(yǎng)學和為生產(chǎn)海參專用配合飼料提供資料參考。

1材料與方法

1.1　試驗材料

實驗用刺參： 2013年9月購自遼寧省大連市鶴圣豐海產(chǎn)品養(yǎng)殖場，大小為(3.16±0.66) g。試驗前，用弗苯尼考溶液消毒，于1 t水槽中馴化暫養(yǎng)2周。

實驗用基礎飼料：苜蓿草粉購自沈陽輝山乳業(yè)苜蓿草種植基地，海泥粉和幼參配合飼料購自大連海洋大學海珍苗種培育基地。

1.2　試驗設計和方法

1.2.1試驗分組與飼養(yǎng)管理采用單因子隨機化完全區(qū)組設計，設5個處理。每組設3個平行重復，每個水槽(50.5 cm×40.0 cm×38.0 cm)中飼養(yǎng)20頭刺參。試驗前將各基礎原料成分過100目篩網(wǎng)，顆粒大小約0.15 mm，充分混合后配置成5種不同比例的飼料。飼料成分配比及主要營養(yǎng)成分見表1。將飼料制成長0.5 cm、直徑3 mm左右的顆粒，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?，投喂時將其均勻地撒入水槽中。

實驗用海水經(jīng)過砂濾器過濾，鹽度為28‰～30‰，pH值為8.1左右，水溫變化范圍為13～18℃，光照和黑暗時間為12 h∶12 h。實驗期間持續(xù)曝氣，每天更換1/3～1/2的新鮮海水。每天16:00 投喂，投喂的干飼料量為刺參體重的8%左右，視刺參的攝食、體增重及水溫變化等情況而及時調(diào)整，稍過量投喂。次日14:00收集殘餌，計算攝食量。每10 d清底一次并用高錳酸鉀消毒處理。正試期60 d。

表1　不同處理組的飼料配方及營養(yǎng)成分

注：飼料的粗蛋白、粗脂肪和灰分含量基于飼料的干重所得。

Note：Contents of protein, lipid and ash were shown with their percentage in dry diet.

1.2.2刺參特定生長率與餌料系數(shù)的測定試驗開始前及結束時測定刺參體重(body mass)，測定方法參照Dong等[22]。殘餌烘干24 h后，稱量和記錄各試驗組的攝食量(g)。按以下公式計算各試驗組刺參的特定生長率(special growth rate，SGR)、日攝食率(ingestion rate，IR)和餌料系數(shù)(feed conversion ratio，F(xiàn)CR)：

SGR=(lnW2-lnW1)/T×100%

IR=C/[T×](W1+W2)/2

FCR=C/(W2-W1)

式中，W1為刺參初始體重，W2為刺參最終體重，T為飼養(yǎng)天數(shù)，C為攝食量。

1.2.3樣品的采集及樣品生化組成的測定試驗結束時，從各試驗組隨機選取15頭刺參，將體壁表面的水吸干后稱量體重。用注射器抽取刺參體腔液，裝入2 mL離心管內(nèi)，液氮冷凍后放入-80℃冰箱內(nèi)保存，待測酶活。然后，將其置于冰盤內(nèi)，用剪刀沿刺參腹部剪開，取出消化道、呼吸樹等組織，用液氮迅速將體壁冷凍，置于-80℃冰箱中保存，待測。

飼料營養(yǎng)成分和刺參體成分的測定采用AOAC(1995)的方法。分別用凱氏定氮法、索氏抽提法和馬福爐高溫灼燒法測定粗蛋白、粗脂肪和粗灰分含量(國標GB 9695.7-88)。將刺參體壁樣品置于烘箱中，于105℃條件下烘干24 h以測定水分含量(國標GB 9695.15-88)[23]。

1.2.4刺參體腔液免疫酶酶活性的測定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過氧化氫酶(catalase, CAT)活力和溶菌酶(lysozyme, LZM)含量均采用南京建成生物技術公司生產(chǎn)的試劑盒，利用Epoch酶標儀(美國Biotek公司生產(chǎn))進行測定。其原理、測定方法及酶活力單位定義均參照試劑盒說明書。

1.3　數(shù)據(jù)處理與分析

對所測得的數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示。利用SPSS 19.0和Excel 2007軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)進行單因子方差分析(one-way ANOVA)，并進行Duncan組間多重比較。如果P<0.05，則認為統(tǒng)計學上差異性顯著。

2結果與分析

2.1　不同飼料對刺參生長的影響

實驗結束時，飼糧中添加苜蓿草粉對刺參的SGR、FCR和IR有顯著影響(P<0.05)(表2)。其中，A2組刺參的SGR達到了最大，顯著高于A0與A4組(P<0.05)；不同試驗組的FCR也各不相同，A2組的FCR最小，顯著低于A0和A4組(P<0.05)；A4組的IR值最低，顯著低于A1、A2與A3組(P<0.05)。

表2　不同飼料對刺參特定生長率(SGR)、餌料系數(shù)(FCR)和日攝食率(IR)的影響

注：同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note：The different letters in the same column indicate statistically significant differences atP<0.05.

2.2　不同飼料對刺參體成分的影響

本實驗中，粗蛋白、粗脂肪和粗灰分含量是以刺參干重為基礎測定的。飼糧中添加苜蓿草粉對刺參體壁的粗脂肪、粗灰分和水分含量沒有顯著影響(P>0.05)，但適宜的草粉添加量提高了粗蛋白的含量。從表3可以看出，A2組刺參的粗蛋白含量達到了52.10%，顯著高于A1組(P<0.05)；A4組刺參的粗灰分含量最低，但各組間刺參的粗脂肪和粗灰分含量差異均不顯著。

表3　不同飼料對刺參體成分的影響

注：同行不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note: The different letters in the same line indicate statistically significant differences atP<0.05.

2.3　不同飼料對刺參體腔液免疫酶的影響

在飼糧中添加苜蓿草粉對刺參體腔液中的SOD、CAT活力及LZM含量影響顯著(P<0.05)。其中，A4組的CAT值最高(142.28 U/mL)，顯著高于A0、A1與A2組(P<0.05)(圖1)；A3組的SOD活力值最高(136.58 U/mL)，顯著高于A0組(P<0.05)(圖1)；A3組的LZM含量最高(1.92 μg/mL)，顯著高于A0、A1和A2組(P<0.05)(圖2)。

圖1　刺參體腔液CAT、SOD活力Fig.1　The change of activities of CAT and SOD in different treatments 　　　不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05) The different letters indicate significant differences at P<0.05.下同The same below.

圖2　刺參體腔液LZM含量 Fig.2　The content of LZM in different treatments

3討論

3.1　不同飼料對刺參生長的影響

朱偉等[24]研究表明實驗刺參的最佳蛋白質(zhì)和脂肪需要量分別為18.21%～24.18%和5%。Sun等[25]報道餌料中蛋白含量在21.49%時刺參生長較好。本研究中，A2組飼料中的粗蛋白和粗脂肪含量分別為18.12%和2.26%。與前者研究結果相比，其蛋白含量有些偏低，這也許是本試驗中刺參的生長速度較慢的原因之一。另外，造成刺參生長較慢的原因可能還與顆粒飼料有關。與傳統(tǒng)的投喂方式相比，顆粒可能不利于刺參的攝食。

一些海洋食草動物對營養(yǎng)含量越低的餌料攝食的頻率越大。攝食模式顯示：采食者會通過優(yōu)化其攝入的能量或限制某些過度營養(yǎng)化的營養(yǎng)素，以便保證自身的健康生長[26]。因此，高補償性攝食可能是導致A0組刺參IR值高的主要原因。這與Liu等[27]的研究結果相同，其認為當混合餌料中海藻的比例降低時，刺參的IR值增長顯著。而A4組刺參的IR值最低，這可能是因為苜蓿中粗纖維含量較高，而刺參的消化道容積有限，并且刺參對粗纖維的消化能力較弱，提高草粉用量增加了飼料中的粗纖維含量，從而降低了刺參的攝食量[19]。另一方面，歐陽克蕙等[28]的研究表明，苜蓿草中的苜蓿黃酮能夠顯著降低崇仁麻雞母雛生長后期的平均日采食量，提高了日增重和飼料報酬。攝食量的減小可能與苜蓿黃酮有關，對于刺參的影響有待于進一步研究驗證。

3.2　不同飼料對刺參體成分的影響

纖維物質(zhì)是一把“雙刃劍”。首先，其可以刺激動物的胃腸蠕動，促進消化酶的分泌，進而提高動物對蛋白質(zhì)的吸收效率等。然而，其對飼料中蛋白質(zhì)的消化和吸收還有一定的阻礙作用。過高的纖維素含量會加快蛋白質(zhì)在消化道中的排空速度，這勢必會縮短蛋白質(zhì)在腸道中被消化吸收的作用時間和幾率等[17]。本試驗中，10%的苜蓿草粉添加比例對刺參來說較為適宜。其不僅能刺激消化酶的產(chǎn)生，以促進對各種營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收。同時蛋白質(zhì)的排空速度也較為適宜，提高了蛋白質(zhì)的沉積率。此時刺參體壁的粗蛋白含量達到最大值。而隨著草粉添加比例的增大，可能由于過高的纖維含量加快了粗蛋白質(zhì)的排空速度，故刺參體壁粗蛋白質(zhì)含量有所下降。這與胡喜峰等[17]的研究結果相似，其認為在一定范圍內(nèi)，在團頭魴飼糧中添加苜蓿草粉有助于提高其魚肉品質(zhì)，提高了團頭魴的商品性能。

從表3可知，與對照組相比添加苜蓿草粉對刺參體壁的粗灰分含量影響不顯著。但A2和A4試驗組粗灰分含量相對于對照組有降低趨勢，這可能是由于這兩組刺參的蛋白質(zhì)、粗脂肪含量較高，相應地使粗灰分所占份額有所降低。同樣，A2和A4試驗組刺參體壁的水分含量也相應地稍有降低。

3.3　不同飼料對刺參體腔液免疫酶的影響

棘皮動物的防御反應是由細胞免疫和體液免疫共同完成的，酶活力的高低表明了機體的免疫狀態(tài)[29]。CAT和SOD是機體抗氧化、清除自由基的主要酶類，它們能與過氧化氫體結合，將細胞代謝產(chǎn)生的H2O2分解為H2O和O2，防止羥基自由基的形成。因此，動態(tài)CAT和SOD的變化能反映出機體內(nèi)自由基的代謝及組織氧化損傷情況，這對判斷機體的健康狀況及免疫防御能力具有重要價值。SOD屬于金屬蛋白酶，能阻斷脂質(zhì)過氧化作用，也是抗氧化系統(tǒng)中關鍵性酶[29]。本實驗結果顯示，隨著苜蓿草粉比例的增加，各組刺參的CAT活力值呈現(xiàn)出了逐漸增大的規(guī)律性；而SOD活力值呈先增大后減小的趨勢，當添加比例達到15%時達到最大。說明添加15%的苜蓿草粉可以提高刺參體腔液的SOD活性，增強刺參的免疫機能。

LZM是一種堿性蛋白酶，廣泛存在于生物體各組織和體液中，其作用機制主要在于它能有效地水解構成肽聚糖的N-乙酰胞壁酸的1碳和N-乙酰葡糖胺的4碳間的β-1,4-糖苷鍵，從而使細菌因肽聚糖細胞壁“散架”而死亡，從而擔負起機體防御的功能，其是無脊椎動物非特異性免疫的主要成分之一[30]。本實驗結果顯示，當苜蓿草粉的添加比例為15%時，LZM的含量最高。

4結論

綜上所述，添加10%左右苜蓿草粉的飼料，刺參的餌料系數(shù)最低，同時特定生長率最高。添加比例低于或高于10%，刺參的餌料系數(shù)都會增加，特定生長率也會降低。10%左右的添加量提高了刺參的攝食率，從而提高了刺參的特定生長率，降低了餌料系數(shù)，同時添加10%左右苜蓿草粉后刺參體成分中的粗蛋白含量明顯增加，表明適當比例的苜蓿草粉能夠促進刺參的生長，而且可提高刺參的商品性能，其可作為刺參飼料輔助性成分原料。研究為刺參營養(yǎng)學和為生產(chǎn)刺參專用的配合飼料提供了資料參考。

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Effects of alfalfa meal on growth, body composition and immune enzymes inApostichopusjaponicus

SONG Jian, HE Zhou, CHENG Long, PANG Yunlong, NING Junhao, CHANG Yaqing*

CollegeofFisheriesandLifeScience,DalianOceanUniversity,KeyLaboratoryofMaricultureandStockEnhancementinNorthChina’sSea,MinistryofAgriculture,Dalian116023,China

Abstract:To determine the appropriate proportion of Medicago sativa in the diet of Japanese sea cucumber (Apostichopus japonicus), the effects of five diets containing zero (A0), 5% (A1), 10% (A2), 15% (A3) and 20% (A4) M. sativa meal on growth, body composition and immune enzyme activity in A. japonicus (3.16±0.66 g) were assessed. The A2diet produced the highest growth rate (0.73%), feed conversion ratio (FCR) and crude protein content (52.10%), significantly higher (P<0.05) than the A1and A4diets. The activity of catalase in sea cucumbers from group A4(142.28 U/mL) was significantly higher than those in groups A0, A1and A2(P<0.05). Superoxide dismutase (SOD) activity in A3(136.58 U/mL) was significantly higher than the A0group (P<0.05). Additionally, lysozyme (LZM) content in the A3group (1.92 μg/mL) was significantly higher than those in groups A0, A1and A2(P<0.05). The results suggest that the optimum proportion of M. sativa in A. japonicus diets is 10%.

Key words:Medicago sativa; Apostichopus japonicus; growth; body composition; immune enzymes

*通訊作者

Corresponding author. E-mail：yqchang@dlou.edu.cn

作者簡介：宋堅(1971-)，男，山東青島人，副研究員。E-mail：dlmel@163.com

基金項目：遼寧省農(nóng)業(yè)攻關計劃重大項目(2011203003)資助。

*收稿日期：2013-12-23；改回日期：2014-03-13

DOI：10.11686/cyxb20150224

http://cyxb.lzu.edu.cn

宋堅， 何舟， 程龍， 龐云龍， 寧軍號， 常亞青. 飼料添加苜蓿草粉對刺參幼參生長、體成分及免疫酶的影響. 草業(yè)學報， 2015， 24(2)： 208-214.

Song J, He Z, Cheng L, Pang Y L, Ning J H, Chang Y Q. Effects of alfalfa meal on growth, body composition and immune enzymes inApostichopusjaponicus. Acta Prataculturae Sinica， 2015， 24(2)： 208-214.