姜海波，王 軍，蘇建華，房銘銘，楊 楠，楊家偉，萬 芬，肖 杭，唐金榮

（1．南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江蘇南京 210029；2．南京醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院神經(jīng)毒理系，江蘇南京 211100；3．江蘇大學(xué)附屬金壇市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江蘇金壇 213200；4．江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江蘇南京 210028）

延胡索乙素對小鼠坐骨神經(jīng)CCI模型背根神經(jīng)節(jié)Cav1．2表達(dá)的影響

姜海波1，王 軍2，蘇建華3，房銘銘4，楊 楠1，楊家偉1，萬 芬1，肖 杭2，唐金榮1

（1．南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江蘇南京 210029；2．南京醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院神經(jīng)毒理系，江蘇南京 211100；3．江蘇大學(xué)附屬金壇市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江蘇金壇 213200；4．江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江蘇南京 210028）

中國圖書分類號(hào)：R-332；R284．1；R322．85；R441．1；R745．022

摘要：目的 探討延胡索乙素對小鼠坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷（CCI）所致神經(jīng)病理性疼痛的鎮(zhèn)痛作用以及對背根神經(jīng)節(jié)Cav1．2表達(dá)的影響。方法 ♂C57BL／6小鼠40只，隨機(jī)分為5組，分別為假手術(shù)組（S組）、CCI組（C組）、延胡索乙素組（L組）。建立穩(wěn)定的小鼠坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷致神經(jīng)病理性疼痛模型。按照神經(jīng)病理性疼痛的誘發(fā)和持續(xù)時(shí)間，又將L組分為誘導(dǎo)期組、誘導(dǎo)維持期組、長程低劑量組。誘導(dǎo)期組于疼痛誘導(dǎo)期（0～5 d）、誘導(dǎo)維持期組于疼痛誘導(dǎo)期及維持期（0～5 d、14～19 d）腹腔給予延胡索乙素45 mg·kg－1，每日1次；長程低劑量組從術(shù)后即刻開始腹腔給予延胡索乙素15 mg·kg－1，每日1次，給予19 d。監(jiān)測小鼠行為學(xué)變化，檢測小鼠機(jī)械痛閾和熱痛閾，Western blot及免疫組織化學(xué)方法測定背根神經(jīng)節(jié)中Cav1．2表達(dá)。結(jié)果 脊髓背根神經(jīng)節(jié)Cav1．2在C組表達(dá)水平最低，S組表達(dá)水平最高，在誘導(dǎo)期組、誘導(dǎo)維持期組及長程低劑量組表達(dá)明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。與C組比較，誘導(dǎo)期組、誘導(dǎo)維持期組高劑量以及長程低劑量組長程低劑量給予延胡索乙素可以明顯緩解神經(jīng)病理性疼痛誘導(dǎo)的機(jī)械痛敏和熱痛敏（P＜0.05，P＜0.01）。高劑量延胡索乙素可以緩解誘導(dǎo)期、維持期的機(jī)械痛敏及維持期的熱痛敏（P＜0.05），低劑量延胡索乙素對誘導(dǎo)期機(jī)械痛敏和熱痛敏均無明顯作用（P＞0.05）。結(jié)論 小鼠CCI模型疼痛的誘導(dǎo)期、誘導(dǎo)維持期應(yīng)用高劑量以及長程應(yīng)用低劑量延胡索乙素可明顯緩解坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷所致神經(jīng)病理性疼痛，其可能機(jī)制之一是延胡索乙素通過上調(diào)脊髓背根經(jīng)節(jié)Cav1．2亞基的表達(dá)來發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。

關(guān)鍵詞：延胡索乙素；Cav1．2；坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷；神經(jīng)病理性疼痛；背根神經(jīng)節(jié)；小鼠

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015－10－16 9：52 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20151016．0952．046．html

延胡索乙素（tetrahydropalmatine，THP）是中藥延胡索的主要活性成分，研究證實(shí)它可緩解頭痛、胸痛、關(guān)節(jié)痛以及外傷導(dǎo)致的疼痛［1］，但對于延胡索乙素治療神經(jīng)病理性疼痛則鮮有報(bào)道［2－3］，涉及到的機(jī)制包括延胡索乙素激活多巴胺D1受體以及抑制脂肪酸酰胺水解酶（FAAH）水平。然而，延胡索乙素是否通過調(diào)節(jié)Cav1．2水平來緩解神經(jīng)病理性疼痛，目前尚未見報(bào)道。近年來研究發(fā)現(xiàn)電壓門控鈣通道（voltage-gated calcium channels，VGCC）與神經(jīng)病理性疼痛密切相關(guān)，L型VGCC，尤其是Cav1．2亞基參與了神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展［4－5］。另外有研究發(fā)現(xiàn)，在豚鼠單個(gè)心肌細(xì)胞中，延胡索乙素可有效阻滯L型鈣電流［6－7］，表明延胡索乙素和L型VGCC密切相關(guān)。延胡索乙素是否通過影響L型VGCC Cav1.2亞基來緩解神經(jīng)病理性疼痛是本實(shí)驗(yàn)研究的主要任務(wù)。

本實(shí)驗(yàn)主要通過觀察坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷模型（chronic constriction injury，CCI）下，延胡索乙素對小鼠背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglia，DRG）Cav1.2表達(dá)的影響，探討延胡索乙素對小鼠神經(jīng)病理性疼痛的影響及其可能的機(jī)制。

1　材料與方法

1．1動(dòng)物分組 ♂C57BL／6小鼠，清潔級(jí)，40只，7 ～8周齡，體質(zhì)量22～27 g，由南京大學(xué)模式動(dòng)物中心提供（批號(hào)：J000664）。將小鼠隨機(jī)分為5組：假手術(shù)組（S組）、坐骨神經(jīng)結(jié)扎組（C組）、延胡索乙素組（L組）。按照神經(jīng)病理性疼痛誘發(fā)和持續(xù)的時(shí)間，又將L組分為誘導(dǎo)期組（induction）、誘導(dǎo)維持期組（induction with maintenance）、長程低劑量組（long-term low-dose）。S組小鼠分離坐骨神經(jīng)但不結(jié)扎，C組和L組建立CCI模型。

1．2實(shí)驗(yàn)材料 左旋延胡索乙素（dl-THP）

（A007452，上海將來實(shí)業(yè)股份有限公司），兔抗Cav1．2抗體（ACC-003，以色列Alomone公司），正常兔血清（AR1010，Boster公司），免疫組化試劑盒DAB顯色液（K5007，丹麥DAKO公司），Von Frey（美國Stoelting公司），冷熱測痛儀（YIS-21A，濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司）。

1．3CCI模型的建立 按照Bennett等［8］所述的方法制備小鼠CCI模型。用1%戊巴比妥（10 mg· kg－1，ip）麻醉小鼠并固定于手術(shù)臺(tái)上，剪毛消毒后切開小鼠右下肢股中部皮膚，鈍性分離肌肉暴露坐骨神經(jīng)，在接近其分叉處用4-0絲線結(jié)扎3道，間隔約1 mm，結(jié)扎強(qiáng)度以引起小腿肌肉輕度顫動(dòng)、減慢，但不阻斷通過表層血管的循環(huán)為宜。生理鹽水沖洗創(chuàng)面，逐層縫合切口，左側(cè)作為自身對照，術(shù)畢分籠，常規(guī)飼養(yǎng)。

1．4給藥方法 參考Choi等［9］和徐叔云教授主編的《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》［10］以及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定給藥方法及給藥劑量。誘導(dǎo)期組于疼痛誘導(dǎo)期（0～5 d）、誘導(dǎo)維持期組于疼痛誘導(dǎo)期及維持期（0～5 d、14～19 d）給予延胡索乙素（45 mg·kg－1，ip），每日1次；長程低劑量組從術(shù)后即刻開始至實(shí)驗(yàn)終止給予延胡索乙素（15 mg·kg－1，ip），每日1次。

1．5測定小鼠機(jī)械痛閾和熱痛閾 各組小鼠分別于術(shù)前1 d，術(shù)后5、14、19 d測定機(jī)械痛閾和熱痛閾。機(jī)械痛閾用機(jī)械刺激回縮閾（MWT）表示，熱痛閾用熱刺激縮足反應(yīng)潛伏期（PWL）表示。

1．5．1機(jī)械痛閾測定 測定前，將小鼠放入一置于金屬篩網(wǎng)上的19×15×12（cm3）塑料箱內(nèi)適應(yīng)15 min，測定時(shí)用Von Frey垂直刺激小鼠右足底中部皮膚，以強(qiáng)度漸升的順序進(jìn)行刺激，纖維絲的壓力值依次為0.07、0.16、0.4、0.6、1.0、1.4、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、15.0 g。刺激持續(xù)時(shí)間≤4秒，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)重復(fù)5次，每次間隔時(shí)間5 min，小鼠出現(xiàn)抬足或舔足行為為陽性反應(yīng)，如超過10.0 g仍未出現(xiàn)機(jī)械刺激引起的陽性反應(yīng)，則記為10.0 g。5次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中有3次出現(xiàn)上述反應(yīng)，則認(rèn)為該點(diǎn)為機(jī)械刺激回縮閾（mechanical withdrawal threshold，MWT）［11］。

1．5．2熱痛閾的測定 將冷熱測痛儀預(yù)熱在（55 ±0.3）℃范圍，將小鼠置于熱板上，以出現(xiàn)抬足或舔足行為為陽性反應(yīng)，此時(shí)測痛儀上的值為熱刺激縮足反應(yīng)潛伏期（thermal paw withdrawal latency，PWL）。刺激持續(xù)時(shí)間不超過30 s，每次間隔時(shí)間15 min，重復(fù)3次，取其平均值［12］。

1．6組織取材及固定 小鼠于術(shù)后d 19給藥2 h后，以（10 mg·kg－1，ip）水合氯醛麻醉致死。沿背部正中線剪開背部皮膚，剪斷與脊柱相連的肋骨，取出腰段脊柱。沿椎管將脊柱剪成兩半，挑出同側(cè)L4 －6脊髓節(jié)段背根神經(jīng)節(jié)。每組隨機(jī)選取5只小鼠背根神經(jīng)節(jié)放入－80℃冰箱，用于Western blot分析，3只小鼠取背根神經(jīng)節(jié)用4%多聚甲醛固定12 h，常規(guī)石蠟包埋，制成厚5 μm石蠟切片，用于免疫組織化學(xué)染色。

1．7Western blot檢測Cav1．2蛋白的表達(dá) 取背根神經(jīng)節(jié)，加入RIPA裂解液和cocktail蛋白酶抑制劑的混合液（體積比500∶1），超聲勻漿后低溫高速離心（5℃，12 000 r·min－1，15 min），取上清液，BCA試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測定。取20 μg蛋白上樣電泳（8%分離膠，5%濃縮膠），電泳（濃縮膠電壓60 V，分離膠電壓90 V）后轉(zhuǎn)印至PVDF膜（200 mA，3 h），5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入Cav1．2一抗（1 ∶200）或β-actin（1∶5 000），4℃冰箱孵育過夜。次日洗膜，加入二抗（1∶50 000），室溫孵育2 h。采用ECL化學(xué)發(fā)光法顯色曝光。

1．8免疫組織化學(xué)檢測Cav1．2的表達(dá)及結(jié)果判定 采用即用型Envision快速酶免疫組化二步法進(jìn)行背根神經(jīng)節(jié)Cav1．2檢測。切片常規(guī)脫蠟至水后，置于盛滿EDTA抗原修復(fù)緩沖液（pH 9.0）的修復(fù)盒中，于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)，自然冷卻后PBS沖洗3次，每次5 min；3%過氧化氫室溫避光孵育25 min，滅活過氧化物酶活性；滴加3%BSA室溫封閉30 min后，滴加適當(dāng)稀釋的一抗（1∶200），4℃冰箱孵育過夜；PBS沖洗3次，滴加辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記的二抗，4℃冰箱孵育50 min；PBS洗3次后滴加DAB溶液，顯微鏡控制顯色；蘇木精復(fù)染，自來水沖洗，1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，氨水返藍(lán)，自來水沖洗；梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。陰性對照實(shí)驗(yàn)中，用0.01 mol·L－1PBS（pH＝7．4）代替一抗，結(jié)果為陰性。每只小鼠隨機(jī)選取背根神經(jīng)節(jié)切片3張，在400倍的視野下，每張切片隨機(jī)選取2個(gè)視野進(jìn)行觀察，以胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒分布計(jì)為陽性細(xì)胞。由兩名操作者分別用Image-Pro Plus 6．0圖像分析軟件觀察并計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)及陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)，結(jié)果取平均值，計(jì)算陽性細(xì)胞百分率。

1．9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均用SPSS 19.0軟件完成統(tǒng)計(jì)分析，正態(tài)分布的資料用±s表示，組間比較用單因素方差分析；非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)（機(jī)械痛閾、熱痛閾）以中位數(shù)（四分位數(shù)間距，interquartile range，IQR）表示，組間差異比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2．1動(dòng)物模型行為學(xué)表現(xiàn) 造模后，C組小鼠出現(xiàn)跛行、舔舐傷口、避免傷側(cè)肢體負(fù)重、懸足等行為學(xué)變化，且機(jī)械痛閾和熱痛閾于術(shù)后d 5～19均明顯降低。S組無上述變化，L組出現(xiàn)上述輕微表現(xiàn)。

2．2機(jī)械痛閾、熱痛閾的變化 各組小鼠術(shù)前基礎(chǔ)機(jī)械痛閾、熱痛閾差異無顯著性，S組小鼠術(shù)前與術(shù)后差異無顯著性。與術(shù)前比較，C組與L組小鼠機(jī)械痛閾、熱痛閾均明顯降低（P＜0.05），且C組術(shù)后d 14閾值降至最低，以后逐漸恢復(fù)，至術(shù)后d 19仍明顯低于術(shù)前。與C組比較：L組術(shù)后d 5，誘導(dǎo)期組、誘導(dǎo)維持期組機(jī)械痛閾明顯增高（P＜0.01），熱痛閾無明顯改變（P＞0.05）；長程低劑量組機(jī)械痛閾、熱痛閾均無明顯改變（P＞0.05）。與C組相比較：L組術(shù)后d 14，誘導(dǎo)期組、誘導(dǎo)維持期組以及長程低劑量組機(jī)械痛閾明顯增高（P＜0.01），誘導(dǎo)期組及誘導(dǎo)維持期組的熱痛閾未見明顯改變（P＞0.05），長程低劑量組熱痛閾明顯增高（P＜0.01）。與C組比較：術(shù)后d 19，誘導(dǎo)維持期組（P＜0.01）與長程低劑量組（P＜0.01）機(jī)械痛閾、熱痛閾均明顯增高；誘導(dǎo)期組機(jī)械痛閾明顯增高（P＜0.05），熱痛閾沒有明顯改變（P＞0.05）；且與誘導(dǎo)期組相比，長程低劑量組機(jī)械痛閾、熱痛閾明顯增高，差別具有顯著性（P＜0.01）（Tab 1）。

2．3Western blot免疫印跡 在預(yù)期的240 ku、43 ku處檢測出Cav1.2、β-actin相應(yīng)的蛋白條帶（Fig 1A）。半定量分析發(fā)現(xiàn)，Cav1．2在S組表達(dá)最高，C組表達(dá)最低，在誘導(dǎo)期組（P＜0.05）、誘導(dǎo)維持期組（P＜0.01）給予延胡索乙素45 mg·kg－1以及長程低劑量給予延胡索乙素15 mg·kg－1（P＜0.01）明顯上調(diào)了Cav1.2水平（Fig 1B）。

2．4免疫組化背根神經(jīng)節(jié)中Cav1．2的表達(dá)變化免疫組化結(jié)果顯示，背根神經(jīng)節(jié)中Cav1．2陽性細(xì)胞胞質(zhì)有棕黃色顆粒，少部分胞核、胞膜著色（Fig 2A）。Cav1.2陽性細(xì)胞在對照組（32.78%± 16.58%）表達(dá)最高，在CCI組（10.29%±6.17%）表達(dá)最低。誘導(dǎo)期組（20.09%±9.25%）、誘導(dǎo)維持期組（25.00%±6.20%）以及長程低劑量組（27.79.%±12.23%）Cav1.2陽性細(xì)胞表達(dá)率明顯高于C組（P＜0.01）（Fig 2B）。

Fig 1 Expression of Cav1．2 in DRG after CCI（±s）

Tab 1 Comparison of MWT，PWL of mice at different time points after CCI［M（Q）］

3　討論

本實(shí)驗(yàn)中，C組和L組小鼠均出現(xiàn)跛行、舔爪、足懸空等疼痛行為學(xué)表現(xiàn)，C組小鼠機(jī)械痛閾和熱痛閾術(shù)后d 5～19均明顯降低，表明小鼠神經(jīng)病理性疼痛模型制備成功。本實(shí)驗(yàn)Western blot以及免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，脊髓背根神經(jīng)節(jié)Cav1.2在C組表

達(dá)水平最低，S組表達(dá)水平最高，在誘導(dǎo)期組、誘導(dǎo)維持期組及長程低劑量組表達(dá)明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），與行為學(xué)檢測結(jié)果延胡索乙素可以明顯緩解神經(jīng)病理性疼痛誘發(fā)的機(jī)械痛敏和熱痛敏同步，這提示了延胡索乙素可能是通過上調(diào)脊髓背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元Cav1.2亞基來發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高劑量延胡索乙素可以緩解誘導(dǎo)期、維持期的機(jī)械痛敏以及維持期的熱痛敏，低劑量延胡索乙素對誘導(dǎo)期的機(jī)械痛敏和熱痛敏均無明顯作用，這與Choi等［9］報(bào)道的結(jié)果相符。本研究還發(fā)現(xiàn)，和誘導(dǎo)期應(yīng)用高劑量延胡索乙素相比，長程低劑量延胡索乙素可以更有效緩解神經(jīng)病理性疼痛誘導(dǎo)的機(jī)械痛敏和熱痛敏（P＜0.01），且Cav1.2表達(dá)水平也明顯高于誘導(dǎo)期應(yīng)用高劑量延胡索乙素（P＜0.05），提示了長程低劑量應(yīng)用延胡索乙素優(yōu)于誘導(dǎo)期應(yīng)用高劑量延胡索乙素。

Fig 2 Expression of Cav1．2 in dorsal root ganglia in different groups（±s）

延胡索乙素作為鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜藥與Cav1.2的相互作用機(jī)制目前尚不明確。本實(shí)驗(yàn)中，脊髓背根神經(jīng)節(jié)Cav1.2在C組表達(dá)水平最低，這與Kim等［13］的報(bào)道一致。Kim等認(rèn)為，損傷的背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元Cav1.2表達(dá)下調(diào)的原因可能與周圍神經(jīng)損傷后，背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞體的神經(jīng)肽Y（NPY）增加以及背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元交感芽生所致的去甲腎上腺素的釋放有關(guān)。而有研究［14－15］發(fā)現(xiàn)，延胡索乙素可作為單胺耗竭劑降低中樞及外周組織去甲腎上腺素濃度。此外，延胡索在緩解創(chuàng)傷性應(yīng)激引起的焦慮和抑郁的同時(shí)，抑制了下丘腦NPY的降低［16］。因此，可以推斷延胡索乙素與去甲腎上腺素及NPY有密切關(guān)系。延胡索乙素可能通過與NPY相互作用或者通過與NPY及去甲腎上腺素共同作用，調(diào)節(jié)Cav1.2的表達(dá)來緩解神經(jīng)病理性疼痛。

本實(shí)驗(yàn)首次探究了延胡索乙素可以通過上調(diào)L型電壓門控鈣通道Cav1.2亞基的水平來發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，為延胡索乙素臨床治療神經(jīng)病理性疼痛提出了一個(gè)新的可能機(jī)制。同時(shí)，根據(jù)神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生及維持情況，通過設(shè)置不同的組別來探討延胡索乙素治療神經(jīng)病理性疼痛的可能最佳方式，為應(yīng)用延胡索乙素治療神經(jīng)病理性疼痛提供了臨床參考。

參考文獻(xiàn)：

［1］ Cao F L，Shang G W，Wang Y，et al．Antinociceptive effects of intragastric DL-tetrahydropalmatine on visceral and somatic persi-stent nociception and pain hypersensitivity in rats［J］．Pharmacol Biochem Behav，2011，100（1）：199－204．

［2］ Guo Z，Man Y，Wang X，et al．Levo-tetrahydropalmatine attenu-ates oxaliplatin-induced mechanical hyperalgesia in mice［J］．Sci Rep，2014，4：3905．

［3］ 王殊秀，冷玉芳，高向梅，邢艷紅．延胡索乙素對大鼠慢性神經(jīng)病理性疼痛的影響［J］．臨床麻醉學(xué)雜志，2012，28（7）：705－7．

［3］ Wang S X，Leng Y F，Gao X M，Xing Y H．Analgesic effect of levo-tetrahydropalmatine in a rat model of neuropathic pain［J］．J Clin Anesthesiol，2012，28（7）：705－7．

［4］ Fossat P，Dobremez E，Bouali-Benazzouz R，et al．Knockdown of L calcium channel subtypes：differential effects in neuropathic pain［J］．J Neurosci，2010，30（3）：1073－85．

［5］ Favereaux A，Thoumine O，Bouali-Benazzouz R，et al．Bidirecti-onal integrative regulation of Cav1．2 calcium channel by micro-RNA miR-103：role in pain［J］．EMBO J，2011，30（18）：3830 －41．

［6］ Huang K，Dai G Z，Li X H，et al．Blocking L-calcium current by

l-tetrahydropalmatine in single ventricular myocyte of guinea pigs ［J］．Acta Pharmacol Sin，1999，20（10）：907－11．

［7］ 徐 春，孫明智，高金池，等．左旋四氫巴馬汀對豚鼠單個(gè)心室肌細(xì)胞Ca2＋通道的阻滯作用［J］．中國藥理學(xué)通報(bào)，1996，12（6）：570－1．

［7］ Xu C，Sun M Z，Gao J C，et al．Blocking calcium channel by l-tetrahydropalmatine in single ventricular myocyte of guinea pigs ［J］．Chin Pharmacal Bull，1996，12（6）：570－1．

［8］ Bennett G J，Xie Y K．A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man［J］．Pain，1988，33（1）：87－107．

［9］ Choi J G，Kang S Y，Kim J M，et al．Antinociceptive effect of Cyperirhizoma and Corydalis tuber extracts on neuropathic pain in rats［J］．Korean J Physiol Pharmacol，2012，16（6）：387－92．

［10］徐叔云，卞如濂，陳 修，主編．藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)［M］．3版．北京：人民衛(wèi)生出版社，2001：202－4．

［10］Xu S Y，Bian R L，Chen X．Experimental methodology of pharma-cology［M］．third edition．Beijing：People′s Medical Publishing House，2001：202－4．

［11］Yalcin I，Choucair-Jaafar N，Benbouzid M，et al．beta（2）-adre-noceptors are critical for antidepressant treatment of neuropathic pain［J］．Ann Neurol，2009，65（2）：218－25．

［12］Zhao X，Xu Y，Zhao Q，et al．Curcumin exerts antinociceptive effects in a mouse model of neuropathic pain：descending mono-amine system and opioid receptors are differentially involved［J］．Neuropharmacology，2012，62（2）：843－54．

［13］Kim D S，Yoon C H，Lee S J，et al．Changes in voltage-gated cal-cium channel alpha（1）gene expression in rat dorsal root ganglia following peripheral nerve injury［J］．Brain Res Mol Brain Res，2001，96（1－2）：151－6．

［14］Liu G Q，Algeri S，Garattini S．D-L-tetrahydropalmatine as mono-amine depletor［J］．Arch Int Pharmacodyn Ther，1982，258（1）：39－50．

［15］吳建華，金國章．（－）SPD和（－）THP對藍(lán)斑核去甲腎上腺素能神經(jīng)元自發(fā)放電的影響［J］．生理學(xué)報(bào)，1995，47（6）：601－4．

［15］Wu J H，Jin G Z．Effects of（－）SPD and（－）THP on the fir-ing of noradrenergic neurons in locus coeruleus［J］．Acta Physiol Sin，1995，47（6）：601－4．

［16］Lee B，Sur B，Yeom M，et al．L-tetrahydropalmatine ameliorates development of anxiety and depression-related symptoms induced by single prolonged stress in rats［J］．Biomol Ther（Seoul），2014，22（3）：213－22．

Effect of tetrahydropalmatine on expression of Cav1.2 in dorsal root ganglion neurons in mice with sciatic nerve chronic constriction injury

JIANG Hai-bo1，WANG Jun2，SU Jian-hua3，F(xiàn)ANG Ming-ming4，YANG Nan1，YANG Jia-wei1，WAN Fen1，XIAO Hang2，TANG Jin-rong1
（1．Dept of Neurology，the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China；2．Dept of Neurotoxicology，Nanjing Medical University，Nanjing 211100，China；3．Dept of Neurology，the Affiliated Jintan Hospital of Medical College of Jiangsu University，Jintan Jiangsu 213200，China；4．Dept of Neurology，Jiangsu Hospital of Traditional Chinese and Western Medicine，Nanjing 210028，China）

Abstract：Aim To investigate the analgesic effect of tetrahydropalmatine on Cav1．2 expression in the dorsal root ganglion（DRG）of mice with sciatic nerve chronic constriction injury（CCI）-induced neuropathic pain．Methods Forty male C57BL／6 mice were randomly divided into 5 groups（n＝5）：sham group（group S），CCI group（group C）and L-THP group（group L）．Steady mice models of neuropathic pain were es-tablished by inducing CCI of sciatic nerve．According to development of neuropathic pain in mice，L group was divided into induction period，induction with ma-intenance period and long-term low-dose group．The mice were intraperitoneally administered with 45 mg· kg－1tetrahydropalmatine in induction（day 0～5），in-duction with maintenance（day 0～5，14～19）period of neuropathic pain state．From the instant after opera-tion，15 mg·kg－1tetrahydropalmatine was injected into the long-term low-dose group once per day for 19 days．Then，the behavior changes of mice were moni-tored．Moreover，the threshold of mechanical and ther-mal stimuli was tested．In addition，the expression of Cav1．2 protein was detected by Western blot and im-munohistochemical staining．Results The lowest ex-pression of Cav1．2 was observed in group C and the highest expression level of Cav1．2 was found in group S．Cav1.2 expression was significantly up-regulated in induction period group，induction with maintenance period group and long-term low-dose group（P＜0.05，P＜0.01）．Compared with group C，high dose of tet-rahydropalmatine in induction period group，induction

with maintenance period group and long-term low-dose group showed reduced mechanical allodynia and ther-mal hyperalgesia induced by nerve injury（P＜0.05，P＜0.01）．Meanwhile，high dose of tetrahydropalma-tine significantly relieved the mechanical allodynia in induction period group，induction with maintenance period group and thermal hyperalgesia in maintenance period group（P＜0.05）．However，there was no ob-vious effect on mechanical allodynia and thermal hyper-algesia induced by nerve injury（P＞0.05）in long-term low-dose group．Conclusions High dose of tet- rahydropalmatine in induction period group，induction with maintenance period group and low-dose among the whole experiment process obviously relieves the neuro-pathic pain induced by nerve injury．The analgesic effect of tetrahydropalmatine on neuropathic pain may be due to the increased expression of Cav1．2 protein in DRG neurons．

Key words：tetrahydropalmatine；Cav1.2；sciatic nerve chronic constriction injury；neuropathic pain；dorsal root ganglion；mice

作者簡介：姜海波（1984－），女，碩士，研究方向：周圍神經(jīng)病，E-mail：jianghaibo30＠126．com；唐金榮（1964－），男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：周圍神經(jīng)病，通訊作者，E-mail：zdgaoyang＠m(xù)edmail．com．cn

基金項(xiàng)目：江蘇省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No BK 2001116）；江蘇省常州市衛(wèi)生局項(xiàng)目（No 2004-182-01）

收稿日期：2015－07－31，修回日期：2015－09－07

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001－1978（2015）11－1598－06

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．11．023