毛旭文，張 莉，杜冠華，高曉黎

（1．新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆烏魯木齊 830011，2．中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所國家藥物篩選中心，北京 100050）

孕馬尿提取物中4種化學(xué)成分的雌激素活性研究

毛旭文1，張 莉2，杜冠華2，高曉黎1

（1．新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆烏魯木齊 830011，2．中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所國家藥物篩選中心，北京 100050）

中國圖書分類號(hào)：R-332；R329.24；R347.913；R392.11

摘要：目的 研究孕馬尿提取物中4種化學(xué)成分的雌激素活性。方法 研究4種成分3β-羥基-5α-16-孕甾烷-20-酮（3β-hydroxy-5α-pregn-16-en-20-one，HP）、5β-孕甾烷-3β，16α，20α-醇（5β-pregnane-3β，16α，20α-triol，PT）、3β，16α-脫氫-5α-孕甾烷-20-酮（3β，16α-dihydroxy-5α-pregnan-20-one，DHP）、3β-羥基-5α-雄甾烷-17-酮（3β-hydroxy-5α-androstan-17-one，HA）對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的細(xì)胞增殖效應(yīng)（E-screen實(shí)驗(yàn)）；利用Luciferase報(bào)告基因與雌激素反應(yīng)元件重組，與轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒pRL-cmv、雌激素受體ERα或ERβ質(zhì)粒共同瞬時(shí)轉(zhuǎn)染中國倉鼠卵巢細(xì)胞CHO，構(gòu)建雌激素活性篩選模型，檢測四種成分的雌激素活性。結(jié)果 E-screen實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HP、PT、DHP、HA在1～50 μmol·L－1內(nèi)均能誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞增殖，顯示出雌激素活性。與雌二醇（17α-estro-diol，E2）的增殖效應(yīng)（proliferative effect，PE）、相對(duì)增殖效應(yīng)（relative proliferative effect，RPE）和EC50相比，HP、PT、DHP、HA的雌激素活性均小于E2的雌激素活性。Luciferase報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，HP、PT、DHP、HA在1～50 μmol·L－1內(nèi)均能誘導(dǎo)Luciferase表達(dá)，顯示雌激素活性。與E2的EC50值相比，HP、PT、DHP、HA的雌激素活性均弱于E2的雌激素活性。結(jié)論 HP、PT、DHP、HA均具有雌激素活性，與E2的雌激素活性相比，四種化合物均發(fā)揮弱雌激素效應(yīng)。

關(guān)鍵詞：雌激素活性；MCF-7；E-screen；報(bào)告基因；雌激素受體α；雌激素受體β

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015－8－10 14：37 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150810．1437．024．html

孕馬尿提取物（pregnant mare′s urine extract，PMUE）主要是一些雌激素的混合物，臨床上主要用于緩解因雌激素不足引起的女性更年期綜合征［1］，預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥［2］、冠心?。?］以及老年癡呆癥［4］。孕馬尿中至少含有200種以上的化學(xué)成分［5］，本課題組確定了PMUE中除主成分以外的4種成分，分別為：3β-羥基-5α-16-孕甾烷-20-酮（3β-hydroxy-5α-pregn-16-en-20-one，HP）、5β-孕甾烷-3β，16α，20α-醇（5β-pregnane-3β，16α，20α-triol，PT）、3β，16α-脫氫-5α-孕甾烷-20-酮（3β，16α-dihydroxy-5α-pregnan-20-one，DHP）、3β-羥基-5α-雄甾烷-17-酮（3β-hydroxy-5α-androstan-17-one，HA），見Fig 1。本實(shí)驗(yàn)利用兩種體外方法評(píng)價(jià)4種成分的雌激素活性，首先考察4種成分對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的增殖作用（Escreen實(shí)驗(yàn)），其次利用雌激素反應(yīng)元件與熒光素酶報(bào)告基因的重組質(zhì)粒（pGM-ERE-Lucif-erase）及雌激素受體（ERα或ERβ）質(zhì)粒瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染中國倉鼠卵巢細(xì)胞CHO，建立雌激素活性篩選系統(tǒng)，探討四種成分的雌激素活性。

Fig 1 Structures of four kinds of chemical composition

1　材料與方法

1．1材料 人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、中國倉鼠卵巢細(xì)胞株CHO由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所國家藥物篩選中心贈(zèng)送。pCMV-ERα和pCMV-ERβ質(zhì)粒購買于北京義翹神州生物有限公司；pGM-ERE-Luc質(zhì)粒購買于上海吉滿生物有限公司；pRL-CMV質(zhì)粒購買于美國Promega公司。17β-雌二醇購買于中國食品藥品檢定研究院；HP、PT、DHP、HA均購買于Sigma-Aldrich公司，貨號(hào)分別為：198886、196347、

362379、198110；孕馬尿提取物為本實(shí)驗(yàn)室自制。RPMI 1640、DMEM無酚紅培養(yǎng)基（石家莊宏偉生物技術(shù)有限公司）；胰蛋白酶（吉諾生物技術(shù)有限公司）；活性炭／葡聚糖法去除激素的胎牛血清（char-coal dextran treated FBS，CD-FBS）為自制；DMSO（北京百順化學(xué)科技有限公司）；MTT購買于Sigma-Aldrich公司；全波長多功能酶標(biāo)儀（Perkin Elmer，美國）；雙熒光素檢測系統(tǒng)試劑盒（碧云天生物有限公司）；感受態(tài)大腸桿菌（TaKaRa公司）；質(zhì)粒提取試劑盒（Omega公司）；Fugen-6轉(zhuǎn)染試劑購買于美國Promega公司等。

1．2實(shí)驗(yàn)分組 （1）溶劑對(duì)照組；（2）陽性對(duì)照組：E2（10－5、10－4、10－3、10－2、10－1μmol·L－1）；（3）實(shí)驗(yàn)藥物組：HP、PT、DHP、HA均為1、5、10、20、30、40、50 μmol·L－1；PMUE（10－5、10－4、10－3、10－2、10－1mg·L－1）。

1．3細(xì)胞培養(yǎng) MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)在含10%CD-FBS的無酚紅RPMI 1640的培養(yǎng)體系中，CHO細(xì)胞培養(yǎng)在含10%CD-FBS的無酚紅DEME的培養(yǎng)體系中，培養(yǎng)體系中加入100 IU·L－1青霉素和100 mg·L－1鏈霉素，置于37℃、5%CO2飽和濕度孵育箱中培養(yǎng)，每2天更換1次培養(yǎng)基，培養(yǎng)至細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1．4MCF-7細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（E-screen Assay） 取對(duì)數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞，以4×107個(gè)·L－1濃度接種于96孔板，每孔90 μL。37℃孵育24 h后，給予不同濃度的待測物，每孔10 μL，繼續(xù)孵育6 d。6 d后，用MTT法檢測細(xì)胞增殖率。E-screen實(shí)驗(yàn)用增殖效應(yīng)（proliferative effect，PE）和相對(duì)增殖效應(yīng)（relative proliferative effect，RPE）評(píng)價(jià)待測物的雌激素活性的強(qiáng)度。

1．5Luciferase報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 取對(duì)數(shù)生長期的CHO細(xì)胞，以1×108·L－1濃度接種于24孔板，每孔1 mL。轉(zhuǎn)染前4 h，用PBS漂洗細(xì)胞2次，加入不含CD-FBS的無酚紅DMEM培養(yǎng)基。將5 μL pGM-ERE-Luc、5 μL pRL-CMV、5 μL pCMV-ERα或pC-MV-ERβ質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑混合，室溫靜置15 min，將混合物加入到CHO細(xì)胞培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。轉(zhuǎn)染24 h后，取出24孔板棄去培養(yǎng)基，PBS漂洗細(xì)胞2次，加入含10%CD-FBS的無酚紅DMEM培養(yǎng)基，分別給予不同濃度待測物，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。48 h后，棄去培養(yǎng)液，按照雙熒光素檢測系統(tǒng)試劑盒的操作說明，用全波長多功能酶標(biāo)儀測定化學(xué)發(fā)光值。Luciferase報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)的評(píng)價(jià)指標(biāo)為相對(duì)雌激素活性（relative estrogenic activity，REA），REA是Luciferase化學(xué)發(fā)光值與pRL-CMV的化學(xué)發(fā)光值的比值。

1．6比較E-screen實(shí)驗(yàn)與Luciferase報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 以estradiol equivalent quantity（EEQ）為評(píng)價(jià)指標(biāo)比較兩種實(shí)驗(yàn)檢測雌激素活性的一致性與差異性。

EEQ／%＝EC50（E2）／EC50（sample）×100%

2　結(jié)果

2．1E-screen實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)雌激素活性 與空白溶劑對(duì)照組比較，HP、PT、DHP、HA和PMUE在受試濃度下均可以明顯誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞增殖（P＜0.01），并呈現(xiàn)出劑量依賴性，結(jié)果顯示，HP、PT、DHP、HA和PMUE均具有雌激素的活性。見Tab 1，F(xiàn)ig 2。

Tab 1 PE%，RPE%and EC50values of four test compounds according to the E-screen assay（±s，n＝3）

Tab 1 PE%，RPE%and EC50values of four test compounds according to the E-screen assay（±s，n＝3）

**P＜0.01 vs E2group．

Compound　PE　RPE／%　EC50／μmol·L－1E2　6．58±0．23　100　（5．68±0．22）×10－5HP　3．88±0．05　51．73±3．14　3．67±0．04**PT　3．69±0．06　48．39±2．21　3．69±0．03**DHP　3．75±0．03　49．37±2．22　3．34±0．10**HA　2．27±0．04　22．71±1．31　4．98±0．07**PMUE　6．53±0．15　99．38±5．23（8．56±0．93）×10－5mg·L－1

2．2Luciferase報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)評(píng)價(jià)雌激素活性與空白溶劑對(duì)照組相比，HP、PT、DHP、HA和PMUE均能誘導(dǎo)由ERα或ERβ介導(dǎo)的熒光素酶表達(dá)（P＜0.01或P＜0.05），并呈現(xiàn)出劑量依賴性，顯示出雌激素活性。見Fig 3～6，Tab 2。

2．3比較E-screen實(shí)驗(yàn)與Luciferase報(bào)告基因檢測實(shí)驗(yàn) 兩種實(shí)驗(yàn)均檢測到HP、PT、DHP、HA具有雌激素的活性，對(duì)比兩種實(shí)驗(yàn)的EEQ沒有明顯的差異（P＞0.05），說明E-screen實(shí)驗(yàn)與Luciferase報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果差異無顯著性。E-screen實(shí)驗(yàn)中EEQ均稍微高于Luciferase報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)的Mean EEQ，可能由于二者的作用對(duì)象與作用時(shí)間不同，導(dǎo)致兩種實(shí)驗(yàn)的檢測靈敏度不同。E-screen實(shí)驗(yàn)的作用對(duì)象是細(xì)胞，作用時(shí)間為144 h，而Luciferase報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

的作用對(duì)象是受體，作用時(shí)間為48 h。見Tab 3。

Tab 2 EC50values of four analytes according to the Luciferease report gene assay（±s，n＝3）

Tab 2 EC50values of four analytes according to the Luciferease report gene assay（±s，n＝3）

**P＜0.01 vs E2group．

Compound ERα EC50／μmol·L－1ERβ EC50／μmol·L－1E2　?。?．47±0．12）×10－5　　（4．74±0．05）×10－5HP　3．16±0．04　2．48±0．14**PT　2．59±0．06　2．44±0．09**DHP　2．67±0．11　2．92±0．11**HA　5．85±0．12　6．29±0．15**PMUE?。?．16±0．67）×10－5mg·L－1（5．93±0．42）×10－5mg·L－1

3　討論

Tab 3 Estrogenic activities of four test samples in MCF-7 cells（E-screen assay）and in Luciferease report gene cells（Luciferease report gene assay）（±s，n＝3）

Tab 3 Estrogenic activities of four test samples in MCF-7 cells（E-screen assay）and in Luciferease report gene cells（Luciferease report gene assay）（±s，n＝3）

Compound　E-screen assay EEQ／% Luciferease report gene assay ERα EEQ／%　ERβEEQ／%Mean EEQ／% HP?。?．6±0．41）×10－3　　（0．8±0．06）×10－3　?。?．7±0．38）×10－3　　（1．2±0．22）×10－3PT?。?．6±0．73）×10－3　　（1．0±0．18）×10－3　?。?．9±0．56）×10－3　　（1．4±0．35）×10－3DHP?。?．8±0．38）×10－3　　（0．9±0．05）×10－3　?。?．6±0．35）×10－3　　（1．3±0．20）×10－3HA?。?．2±0．34）×10－3　?。?．4±0．03）×10－3　?。?．8±0．01）×10－3　　（0．6±0．02）×10－3PMUE　16．69±0．75　9．39±0．26　21．77±0．69　15．58±0．47

Fig 2 Proliferative effects induced by test samples in MCF-7 cells（E-screen test）（±s，n＝3）

E-screen實(shí)驗(yàn)是由Soto等［6］最早提出，采用MCF-7細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)化合物的雌激素活性，稱為雌激素篩檢（E-screen）實(shí)驗(yàn)，是一種常用的體外檢測外源雌激素的方法。E-screen實(shí)驗(yàn)檢測化合物的雌激素活性，酚紅對(duì)MCF-7細(xì)胞有誘導(dǎo)細(xì)胞增殖作用，同時(shí)血清中的內(nèi)源性雌激素對(duì)MCF-7細(xì)胞也有明顯的誘導(dǎo)細(xì)胞增殖作用。采用活性炭／葡聚糖處理的FBS與無酚紅RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞，避免酚紅和內(nèi)源性雌激素對(duì)E-screen實(shí)驗(yàn)干擾。四種化合物與MCF-7細(xì)胞作用后，與空白溶劑對(duì)照組比較，HP、PT、DHP、HA均可以明顯誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞增殖（P＜0.01），增殖效應(yīng)與受試濃度呈現(xiàn)出劑量依賴性，HP、PT、DHP、HA均在20 μmol·L－1誘導(dǎo)MCF-7達(dá)到最大增殖效應(yīng)。與E2的EC50相比，HP、PT、DHP、HA的EC50相差105倍（P＜0.01），HP、PT、DHP、HA的PE也遠(yuǎn)小于E2的PE值（P＜0.01），HP、PT、DHP、HA的RPE小于100%，說明四種物質(zhì)顯示出的雌激素效應(yīng)小于E2的雌激素效應(yīng)。PMUE 的EC50與E2的EC50相比沒有差異（P＞0.05），其PE值與E2的PE沒有差異（P＞0.05），PMUE的RPE接近100%，說明PMUE的雌激素效應(yīng)與E2的雌激素效應(yīng)相同。HP、PT、DHP、HA的EC50與PMUE的EC50相

差105倍，其PE值均小于PMUE的PE值（P＜0.01），其RPE值均小于PMUE的RPE值（P＜0.01），說明PMUE顯示出雌激素效應(yīng)強(qiáng)于HP、PT、DHP、HA的雌激素效應(yīng)，這是因?yàn)镻MUE中含有雌二醇、雌酮、馬烯雌酮等多種雌激素，且這些成分都是PMUE的主要成分。根據(jù)RPE值判斷四種化合物發(fā)揮雌激素的活性由強(qiáng)到弱順序?yàn)椋篐P＞DHP＞PT＞HA。

Fig 3 ERα-mediated ERE-driven transcriptional activation in CHO cells（±s，n＝3）

Fig 4 Transcriptional efficiency of ERα，ERE-Luciferase（±s，n＝3）

本實(shí)驗(yàn)將雌激素反應(yīng)元件pGM-ERE-Luc、轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒pRL-CMV、雌激素受體pCMV-ERα或pC-MV-ERβ質(zhì)粒瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞建立雌激素受體細(xì)胞篩選系統(tǒng)，利用此系統(tǒng)檢測HP、DHP、PT、HA是否與ERα或ERβ結(jié)合并發(fā)揮雌激素活性。結(jié)果顯示，在10－5～10－2μmol·L－1的范圍內(nèi)，隨著E2濃度增大，熒光素酶的表達(dá)值升高，濃度增大到10－2μmol ·L－1，熒光素酶的表達(dá)值最高，當(dāng)E2增大到10－1μmol·L－1時(shí)，熒光素酶的表達(dá)值下降。HP、PT、DHP、HA在1～20 μmol·L－1的濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，熒光素酶的表達(dá)值升高，但是，當(dāng)濃度增大到20 μmol·L－1時(shí)，熒光素酶的表達(dá)值最高，當(dāng)濃度增大到30 μmol·L－1時(shí)，熒光素酶的表達(dá)值反而減小。以上現(xiàn)象可能由于雌激素受體達(dá)到飽和，待測物樣品濃度繼續(xù)增加，熒光素酶的表達(dá)值反而減小。E2與ERα結(jié)合的REA值比與ERβ結(jié)合的REA值

高4倍左右，說明E2與ERα結(jié)合的親和力高于與ERβ結(jié)合的親和力。通過比較REA值，HP、PT、DHP、HA、PMUE與ERβ結(jié)合后的REA與ERα結(jié)合后的REA無差異（P＞0.05），說明HP、PT、DHP、HA 與ERβ結(jié)合的親和力與ERα結(jié)合的親和力相同。與E2的EC50相比，HP、PT、DHP、HA的EC50與雌二醇相差105倍（P＜0.01），說明4種物質(zhì)顯示出的雌激素效應(yīng)比雌二醇的雌激素效應(yīng)弱。PMUE的EC50與E2相比差異無顯著性（P＞0.05），說明PMUE顯示出的雌激素效應(yīng)與E2的雌激素效應(yīng)相同。HP、PT、DHP、HA的EC50與PMUE的EC50相差105倍，說明PMUE顯示出雌激素效應(yīng)強(qiáng)于HP、PT、DHP、HA的雌激素效應(yīng)，因?yàn)镻MUE中含有多種活性較強(qiáng)的雌激素。

Fig 5 ERβ-mediated ERE-driven transcriptional activation in CHO cells（±s，n＝3）

Fig 6 Transcriptional efficiency of ERβ，ERE-Luciferase（±s，n＝3）

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［6－10］，E2在10－5～10－1μmol· L－1范圍內(nèi)顯示雌激素效應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)在此濃度范圍內(nèi)考察了HP、PT、DHP、HA及PMUE的雌激素活性，發(fā)現(xiàn)在10－5～10－1μmol·L－1內(nèi)，HP、PT、DHP、HA并未顯示雌激素活性，而PMUE在10－5～10－1μmol· L－1范圍內(nèi)顯示雌激素效應(yīng)。增大濃度至1～50 μmol ·L－1，發(fā)現(xiàn)HP、PT、DHP、HA可以誘導(dǎo)luciferase表達(dá)，顯示雌激素效應(yīng)并呈劑量依賴性，因此實(shí)驗(yàn)組的劑量設(shè)置在1～50 μmol·L－1。

本實(shí)驗(yàn)利用兩種體外檢測方法：E-screen實(shí)驗(yàn)和luciferase報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)評(píng)價(jià)HP、PT、DHP、HA的雌

激素活性，兩種方法均能檢測出HP、PT、DHP、HA具有雌激素活性，但是與E2的雌激素活性相比，HP、PT、DHP、HA均發(fā)揮弱雌激素活性。有機(jī)體是一個(gè)復(fù)雜的體系，體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果最終需要與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，在未來的研究中，本課題組還要通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來考察HP、PT、DHP、HA的雌激素活性，才能使結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠。

（致謝：本文實(shí)驗(yàn)是由新疆醫(yī)科大學(xué)與中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所國家藥物篩選中心合作提供實(shí)驗(yàn)條件，本人對(duì)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所國家藥物篩選中心的全體研究人員表示衷心的感謝。）

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Estrogenic activities of four components from pregnant mare’s urine extract

MAO Xu-wen1，ZHANG Li2，DU Guan-hua2，GAO Xiao-li1
（1．Dept of Pharmacy，Xinjiang Medical University，Urimuqi 830011，China；2．Beijing Key Laboratory of Drug Target Identification and Drug Screening，Institute of Materia Medica，Chinese Academy of Medical Sciences＆Peking Union Medical College，Beijing 100050，China）

Abstract：Aim To investigate the estrogenic activities of four components from pregnant mare’s urine extract．Methods The estrogenic activities of four components were assessed using two in vitro tests：the MCF-7 cell proliferation assay（E-screen test）and the luciferase transfected CHO cell gene reporter assay．In the lucifer-ase reporter gene assay，the reporter gene plasmids PGM-ERE-Luc and ERα or ERβ and a control plasmid （pRL-cmv）were transiently co-transfected into CHO cells to establish an ERα-or ERβ-cell screening system which was used to measure estrogenic activity of four compounds．Results MCF-7 cells treated with HP，DHP，PT and HA significantly proliferated，thereby of-fering in vitro evidence for the estrogenic activities of HP，DHP，PT and HA，and they showed dose-depend-ent activities．Compared EC50of PE and RPE with that of E2，HP，DHP，PT and HA exerted relatively weak estrogenic activities．The in vitro ER-mediated reporter gene assay revealed that HP，DHP，PT and HA dis-played estrogenic activities mediated by ERβ or ERα．Compared with the EC50of E2，HP，DHP，PT and HA exhibited lower estrogenic potencies．Conclusion HP，DHP，PT and HA possess weaker estrogenic activities than E2．

Key words：estrogenic activities；MCF-7；E-screen Assay；reporter gene；estrogen receptor α；estrogen re-ceptor β

作者簡介：毛旭文（1986－），女，博士，研究方向：新疆地方資源藥物研發(fā)，E-mail：358178217＠qq．com；高曉黎（1962－），女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：新疆地方資源藥物研發(fā)，通訊作者，E-mail：xli＿g＠sina．com

基金項(xiàng)目：國家十二五“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)（No 2011ZXO9203）；新疆維吾爾自治區(qū)重大科技專項(xiàng)（No 201130101）

收稿日期：2015－05－23，修回日期：2015－06－25

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001－1978（2015）09－1304－06

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．09．024