豬偽狂犬病病毒gE基因核酸探針的制備

劉志杰

（山東青島即墨市畜牧獸醫(yī)局，山東即墨 266200）

豬偽狂犬病病毒gE基因核酸探針的制備

劉志杰

（山東青島即墨市畜牧獸醫(yī)局，山東即墨 266200）

豬偽狂犬病是由偽狂犬病病毒引起的一種以發(fā)熱、呼吸和神經(jīng)系統(tǒng)疾病為特征的重要傳染病，國內(nèi)到目前為止，已經(jīng)有20多個省市報道有偽狂犬病流行，并分離出MinA、陜A、AKW、DQ-8401、S、鄂A、京A等多株豬偽狂犬病病毒（PRV）。OIE推薦使用基因缺失疫苗，我國農(nóng)業(yè)部已決定只生產(chǎn)和使用基因缺失疫苗，目前已經(jīng)商業(yè)化基因缺失疫苗普遍缺失了gE基因，本文報道了利用缺失的gE基因制備核酸探針的研究。

1 材料與方法

1.1 病毒與細(xì)胞

PRV-S國內(nèi)分離株；PPV、PCV、PRRSV、CSFV、Vero細(xì)胞、大腸桿菌DH5α；PRV Bartha-k61株疫苗。

1.2 主要試劑

pMD-18T-Vector線狀克隆載體、Taq DNA聚合酶和DNA純化回收試劑盒、TRIZOL試劑盒、Dig標(biāo)記及檢測試劑盒。

1.3 引物

PS5’－ACG ACG ATG ACC TCA ACG G－3'，PR5'－AGG TAG TCG CCG ATG CCC －3'。

1.4 病毒增殖

PRV -S株及PRV Bartha-k61株以Vero細(xì)胞培養(yǎng)。

1.5 DNA的提取

按Trizol試劑盒說明書進行。

1.6 PCR擴增

以PRV病毒DNA為模板進行擴增，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.7 PCR產(chǎn)物的克隆

應(yīng)用DNA快速純化回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進行純化后克隆，測序。

1.8 探針的標(biāo)記

以純化回收的PRVgE基因片段為模板進行標(biāo)記。

1.9 標(biāo)記探針敏感性的測定

按照DNA探針標(biāo)記及檢測試劑盒說明檢測所制備探針的敏感性。

1.10 標(biāo)記探針特異性的測定

將PRV-S株 DNA、PRV Bartha-k61株疫苗毒DNA、PPV DNA、PCV DNA、PRRSV cDNA、CSFV cDNA點樣于NC膜上同核酸探針雜交，加底物顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 PRV-S株gE基因的PCR擴增

以PRV-S株DNA為模板，對其gE基因進行PCR擴增，結(jié)果出現(xiàn)一條特異性條帶，長度與預(yù)期的304bp相符，結(jié)果見圖1：

圖1 豬偽狂犬病毒gE基因的PCR擴增1：gE基因的擴增產(chǎn)物；M：DL2000 DNA Marker

2.2 PCR產(chǎn)物的克隆與測序

將PCR擴增產(chǎn)物克隆后測序。測序結(jié)果證明PCR擴增片斷與PRV-S株gE基因同源性為100%。

2.3 核酸探針敏感性試驗

將上述PCR擴增的DNA片段分別按1∶10、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400、1∶12800、1∶25600、1∶51200、1∶102400進行稀釋后進行斑點雜交試驗。試驗可見當(dāng)PCR產(chǎn)物稀釋6400倍時仍可見到陽性雜交信號，說明本探針至少可檢測到4pg的DNA片段。結(jié)果見圖2。

圖2 核酸探針敏感性檢測

2.4 核酸探針特異性試驗

在同一條NC膜上同時點上PRV-S株DNA、PRV Bartha-k61株疫苗毒DNA、PPV DNA、PCV DNA、PRRSV cDNA、CSFV cDNA，進行探針的雜交試驗。結(jié)果見圖3。本探針不與PRV Bartha-k61株疫苗毒DNA、PPV DNA、PCV DNA、PRRSV cDNA、CSFV cDNA，而只與PRV-S株DNA有很好的反應(yīng)性，說明該核酸探針具有良好的特異性。

圖3 核酸探針特異性檢測

3 討論

核酸探針技術(shù)是近年來迅速發(fā)展起來的一種新型分子生物學(xué)技術(shù)，利用PRV DNA作為探針，曾檢出過10 pg，l～5 pg的PRV DNA。

在實施根除偽狂犬病計劃的近20年來，疫苗扮演了重要的角色。在各種疫苗中基因缺失疫苗是應(yīng)用最廣泛的，常見的缺失基因有g(shù)E、gI、TK等。gEˉ可作為標(biāo)志基因，區(qū)別PRV野毒株和gE基因缺失株。與一定的檢測方法結(jié)合，便能用免疫接種和捕殺陽性動物相結(jié)合的方法來根除PRV。本研究就是通過PCR擴增了一段304 bp的豬偽狂犬病毒gE基因片段，將其作為核酸探針來對PRV野毒株進行檢測。經(jīng)試驗證明該探針只與同源DNA出現(xiàn)陽性雜交信號，而與PRV Bartha-k61株疫苗毒DNA、PPV DNA、PCV DNA、PRRSV cDNA、CSFV cDNA的雜交結(jié)果均為陰性，具有良好的特異性。敏感性檢測結(jié)果表明，該探針最低可檢出4 pg的同源DNA，具有很高的靈敏度。故該探針可用于檢測偽狂犬病野毒感染。