苗　蕊，賈曉鵬,李　斌,郭　婧,孫云朝,馮棟棟

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精索靜脈曲張對(duì)大鼠睪丸內(nèi)分泌功能的影響

苗蕊，賈曉鵬,李斌,郭婧,孫云朝,馮棟棟

[作者單位]050082 石家莊，解放軍白求恩國(guó)際和平醫(yī)院婦產(chǎn)科(苗蕊、郭婧)；050051 石家莊，河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院泌尿外科(賈曉鵬)；063000 河北 唐山，唐山工人醫(yī)院泌尿外科(李斌)；050011 石家莊，河北省中醫(yī)院外科(孫云朝)；255000 山東 淄博，淄博市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院泌尿外科(馮棟棟)

[摘要]目的探討精索靜脈曲張(VC)對(duì)大鼠睪丸支持細(xì)胞分泌功能的影響。方法選擇SD雄性大鼠40只，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組20只。實(shí)驗(yàn)組建立VC模型，對(duì)照組不縮窄精索靜脈。造模后12周，檢測(cè)兩組睪丸組織內(nèi)雄激素結(jié)合蛋白、抑制素B和睪酮濃度。結(jié)果兩組睪丸組織雄激素結(jié)合蛋白表達(dá)情況比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);實(shí)驗(yàn)組抑制素B及睪酮水平均低于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論VC可使睪丸支持細(xì)胞抑制素B和睪酮分泌減少，影響精子發(fā)育、成熟，導(dǎo)致男性不育。

[關(guān)鍵詞]精索靜脈曲張；不育,男性；雄激素結(jié)合蛋白質(zhì)；抑制素類；睪酮;大鼠,Sprayue-Dawley

精索靜脈曲張(varicocele， VC)是男性常見疾病，男性不育癥患者中VC占19%～41%[1]。VC導(dǎo)致不育的原因眾多，迄今為止，相關(guān)領(lǐng)域的研究主要是對(duì)血清抑制素B及睪酮水平的測(cè)定，而對(duì)于其在睪丸組織中表達(dá)情況的研究較少，且對(duì)于雄激素結(jié)合蛋白的研究也較少見報(bào)道。筆者通過研究VC對(duì)大鼠睪丸支持細(xì)胞雄激素結(jié)合蛋白、抑制素B及睪丸組織內(nèi)睪酮分泌水平的影響，旨在探討男性不育的發(fā)生機(jī)制。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型制備

1.1.1動(dòng)物選擇及分組:選擇SD雄性大鼠40只，購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，鼠齡(50±10)d，體重240～280 g。將大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組20只。所有大鼠在相同條件下自由飲食、水飼養(yǎng)3個(gè)月。

1.1.2模型制備方法：參考Turner[2]的方法。實(shí)驗(yàn)組給予10%水合氯醛麻醉，打開腹腔后分離出左腎靜脈，于左腎靜脈與下腔靜脈間放置一直徑0.8 mm的注射器針頭，在交叉處用3-0絲線將針頭與左腎靜脈一并結(jié)扎，可縮窄左腎靜脈直徑，然后抽出注射器針頭，用生理鹽水沖洗腹腔后縫合切口。對(duì)照組不縮窄左腎靜脈，其余步驟同實(shí)驗(yàn)組。兩組均于術(shù)后腹腔注射青霉素20萬單位/d，連續(xù)3 d。以精索靜脈最大直徑>1 mm,左右腎重量無明顯差別為模型建立成功。

1.2標(biāo)本采集和檢測(cè)

1.2.1標(biāo)本采集和切片制備：參考馮棟棟[3]的方法。操作步驟：造模后12周，10%水合氯醛腹腔麻醉后打開腹腔，暴露雙側(cè)腎臟，將左側(cè)睪丸上推入腹腔，觀察睪丸大小，將睪丸和附睪一并剪下，剪除附睪及筋膜等附屬組織，用冷鹽水洗凈，濾紙吸干。將睪丸平均切成兩半，一半剪除白膜后稱重，放入玻璃勻漿器中，按1∶2(重量∶體積)比例加入磷酸緩沖液后研磨，4℃過夜，次日以3000 r/min離心15 min,取上層液置Eppendof管于-20℃保存待測(cè)。另一半睪丸組織置于10%中性甲醛溶液中固定24 h,切成1～2 mm薄片，梯度乙醇脫水，二甲苯透明30 min,石蠟包埋。切片厚4 μm于60℃溫箱中烘干。

1.2.2標(biāo)本檢測(cè)

1.2.2.1睪丸組織內(nèi)雄激素結(jié)合蛋白及抑制素B的檢測(cè)及結(jié)果判定：參考馮棟棟[3]報(bào)道的方法。步驟：將4 μm厚的切片置于載玻片上60℃過夜。切片浸于二甲苯5 min×2次，100%、95%、90%、85%、75%乙醇5 min×2次;1%甲醇過氧化氫溶液，室溫10 min,蒸餾水洗1次，0.1 mol PBS洗3次×5 min；切片上滴加抗原修復(fù)液，室溫10 min,0.1 mol PBS洗3次×5 min；切片上滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 min。去掉多余液體，不洗；切片上滴加第一抗體4℃過夜，0.1 mol PBS洗3次×5 min；切片上滴加生物素化第二抗體(IgG)，37℃ 20 min，0.1 mol PBS洗3次×5 min；切片上滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液(S-A/HRP)，37℃ 20 min，0.1 mol PBS洗3次×5 min；使用DAB顯色試劑盒1 ml蒸餾水加顯色劑A、B、C，混勻加至標(biāo)本顯色6 min，充分水洗；蘇木素復(fù)染細(xì)胞核1 min，充分水洗、1%鹽酸乙醇分化、1%胺水反藍(lán)、充分水洗、經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明5 min 2次，中性樹脂封片。隨機(jī)選取5個(gè)視野圖像，雄激素結(jié)合蛋白陽性表達(dá)的生精上皮作為陽性對(duì)照，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。根據(jù)陽性細(xì)胞密度評(píng)分：0分為無陽性細(xì)胞；1分為1%～10%；2分為10%～50%；3分為50%～80%；4分為80%～100%。陽性細(xì)胞著色強(qiáng)度評(píng)分：0分為陰性；1分為輕度著色(淺棕黃色)；2分為中度著色(棕黃色)；3分為強(qiáng)染色(深棕黃色)。著色密度和強(qiáng)度乘積為最終評(píng)分[4]。

1.2.2.2睪丸組織內(nèi)睪酮測(cè)定:使用BECKMAN COULTER DXⅠ 800 全自動(dòng)免疫分析儀測(cè)定。步驟同睪丸組織內(nèi)雄激素結(jié)合蛋白及抑制素B檢測(cè)方法。

2結(jié)果

2.1雄激素結(jié)合蛋白術(shù)后12周，大鼠左側(cè)睪丸組織雄激素結(jié)合蛋白免疫組化評(píng)分中位數(shù)和四分位數(shù)間距實(shí)驗(yàn)組分別為6.00和4.25分，對(duì)照組分別為6.00和4.50分，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。大鼠睪丸組織內(nèi)雄激素結(jié)合蛋白表達(dá)情況見圖1。

圖1　大鼠睪丸組織內(nèi)雄激素結(jié)合蛋白表達(dá)情況(DAB×400)

2.2抑制素B術(shù)后12周，大鼠左側(cè)睪丸抑制素B免疫組化評(píng)分中位數(shù)和四分位數(shù)間距實(shí)驗(yàn)組分別為5.00和2.00分，對(duì)照組分別為7.50和4.50分，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。大鼠睪丸組織抑制素B表達(dá)情況見圖2。

2.3睪酮水平術(shù)后12周，大鼠左側(cè)睪丸組織勻漿提取液睪酮濃度實(shí)驗(yàn)組為(94.79±3.31)nmol/L，對(duì)照組為(109.10±6.37)nmol/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2　大鼠睪丸組織抑制素B表達(dá)情況(DAB×400)

A.實(shí)驗(yàn)組高表達(dá);B.實(shí)驗(yàn)組低表達(dá);C.對(duì)照組高表達(dá);D.對(duì)照組低表達(dá)

3討論

夫妻雙方同居>1年未采用任何避孕措施，且由于男方因素導(dǎo)致女方不孕者，稱不育[5]。VC對(duì)于支持細(xì)胞的功能損害是導(dǎo)致不育的重要環(huán)節(jié)[6]。VC發(fā)病原因一般分為兩種，原發(fā)性和繼發(fā)性，其中，原發(fā)性VC可由于靜脈內(nèi)壓力過高引起，包括左側(cè)精索靜脈呈直角匯入左腎靜脈，腸系膜上動(dòng)脈與腹主動(dòng)脈壓迫左側(cè)精索靜脈，左側(cè)精索靜脈內(nèi)瓣膜缺失、關(guān)閉不全等，精索內(nèi)靜脈周圍結(jié)締組織薄弱及靜脈瓣膜功能障礙、關(guān)閉不全，精索靜脈管壁組織結(jié)構(gòu)異常，精索靜脈解剖變異，提睪肌發(fā)育不全等解剖學(xué)因素或發(fā)育不良引起[7]。繼發(fā)性VC原因最常見的為腹膜后腫瘤、異位血管壓迫、腎臟積水或腫瘤等。無論VC屬于何種類型，均可導(dǎo)致陰囊潮濕、墜脹、睪丸疼痛且向下腹部、腹股溝區(qū)或腰部放射，尤以長(zhǎng)時(shí)間站立或勞累后癥狀更明顯，反之，休息或平臥后上述癥狀均可得到不同程度的緩解。

VC導(dǎo)致不育的原因目前尚不明確，但其機(jī)制的研究仍在不斷進(jìn)行，目前比較流行的學(xué)說包括：一氧化氮機(jī)制、睪丸微循環(huán)障礙機(jī)制、腎臟及腎上腺代謝產(chǎn)物反流機(jī)制、凋亡機(jī)制等，均能從不同角度解釋VC導(dǎo)致睪丸生精障礙及精子活力減低等現(xiàn)象。近年來，在VC導(dǎo)致男性不育方面的研究取得重要進(jìn)展的是生精細(xì)胞凋亡異常。在生精過程中，25%～75%生精細(xì)胞發(fā)生凋亡。生精功能障礙與凋亡異常密切相關(guān)?；颊叩牟G丸間質(zhì)細(xì)胞、生精細(xì)胞凋亡指數(shù)與梗阻性無精癥患者比較明顯升高，在VC導(dǎo)致不育中，生精障礙的嚴(yán)重程度與其凋亡指數(shù)呈正相關(guān)，而生精細(xì)胞凋亡與生精細(xì)胞損害程度有關(guān)。

支持細(xì)胞對(duì)生精細(xì)胞的作用除維持局部免疫、營(yíng)養(yǎng)支持外，還能維持生精細(xì)胞發(fā)育。其中分泌的雄激素結(jié)合蛋白與抑制素B對(duì)于睪丸生精功能維持和調(diào)節(jié)有顯著作用[8]。睪丸支持細(xì)胞側(cè)面和近腔面凹陷分為基底室和近腔室[9]。近腔室位于精原細(xì)胞上方，通向生精小管管腔，內(nèi)有精母細(xì)胞和精子細(xì)胞。基底室靠近基底膜，內(nèi)有精原細(xì)胞[10]。

雄激素結(jié)合蛋白是一種分子量為85 KD的異二聚體糖蛋白，與雄激素共同參與性功能的維持作用。有研究表明，VC大鼠睪丸組織中雄激素結(jié)合蛋白含量較對(duì)照組低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[11]。一些研究表明，大鼠睪丸組織中支持細(xì)胞和雄激素結(jié)合蛋白缺乏，即使精子數(shù)量不減少，但仍可導(dǎo)致大鼠不育，提示雄激素結(jié)合蛋白表達(dá)異常對(duì)精子的數(shù)量和質(zhì)量有重要影響[8]。本研究結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組術(shù)后12周，睪丸組織中雄激素結(jié)合蛋白表達(dá)減少，但與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能的原因?yàn)閂C導(dǎo)致睪丸局部損傷因子增加對(duì)支持細(xì)胞的直接損害作用及上述代償機(jī)制的共同作用，并且與VC嚴(yán)重程度及病程有關(guān)。

抑制素分為兩種類型，即：抑制素A和抑制素B，其中后者為作用的主要形式。在男性中抑制素由睪丸支持細(xì)胞分泌，主要作用是通過對(duì)下丘腦-垂體-性腺軸的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，從而間接影響睪丸間質(zhì)細(xì)胞對(duì)睪酮的分泌，抑制促卵泡激素(FSH)分泌，還能促進(jìn)cAMP途徑對(duì)間質(zhì)細(xì)胞的功能[12]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，術(shù)后12周，實(shí)驗(yàn)組睪丸組織內(nèi)抑制素B表達(dá)較對(duì)照組降低，提示VC時(shí)睪丸支持細(xì)胞抑制素B表達(dá)減少，導(dǎo)致精子發(fā)育、成熟障礙，使睪丸生精功能降低。

在男性中睪酮是由睪丸間質(zhì)細(xì)胞合成分泌，生精小管內(nèi)高濃度的睪酮對(duì)生精功能的維持具有重要作用[13]。睪酮對(duì)生精細(xì)胞的直接作用是通過膜效應(yīng)刺激生精細(xì)胞的發(fā)育，并且抑制Fas的表達(dá)而促進(jìn)生成精子[14]。本研究結(jié)果顯示，VC大鼠實(shí)驗(yàn)組術(shù)后12周時(shí)睪丸組織中睪酮水平低于對(duì)照組，提示VC可通過內(nèi)分泌調(diào)節(jié)導(dǎo)致睪丸中內(nèi)源性睪酮減少，影響精子發(fā)育成熟，最終引起不育。

綜上所述，VC導(dǎo)致睪丸支持細(xì)胞內(nèi)抑制素B及內(nèi)源性睪酮減少，影響精子生成、發(fā)育，可能是其導(dǎo)致男性不育的主要機(jī)制。

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(收稿時(shí)間：2014-12-27修回時(shí)間：2015-01-30)

論著·

Effect of Varicocele on Testicular Endocrine Function in Rats

MIAO Rui1, JIA Xiao-peng2, LI bin3, GUO Jing1, SUN Yun-chao4, FENG Dong-dong5(1. Department of Obstetrics and Gynecology， Bethune International Peace Hospital of PLA， Shijiazhuang 050082， China； 2. Department of Urinary Surgery， the Third Hospital of Hebei Medical University， Shijiazhuang 050051， China； 3. Department of Urinary Surgery， the Worker's Hospital of Tangshan, Tangshan, Hebei 063000, China； 4. Department of Surgery, Hebei Provincial Hospital of Chinese Traditional Medicine, Shijiazhuang 050011, China; 5. Department of Urinary Surgery， Hospital of Integrated Chinese Traditional and Western Medicine of Zibo City, Zibo, Shandong 255000, China)

[Abstract]ObjectiveTo study the effect of varicocele (VC) on secretary function of the sertoli cells in rats. MethodsA total of 40 Sprague-Dawley male rats were randomly divided into experiment group (n=20) and control group (n=20). The experiment group established VC models, while the control group did not receive spermatic vein coarctation. The levels of androgen binding protein, inhibin B and testosterone concentration in testicular tissues were detected in the two groups 12 weeks after the model establishment. ResultsThe difference in androgen binding protein expression was not statistically significant in the two groups (P>0.05); the levels of inhibin B and testosterone concentration in experiment group were more reduced than those in control group (P<0.05). ConclusionVC can reduce secretion levels of inhibin B and testosterone concentration of testicular support cells, and then interfere with mature and development of the spermatozoa, which may induce male sterility.

[Key words]Varicocele; Infertility, male; Androgen-binding protein; Inhibins; Testosterone; Rats, Sprayue-Dawley

[DOI]10.3969/j.issn.2095-140X.2015.05.009

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼][中國(guó)圖書資料分類號(hào)]R697.24A

[文章編號(hào)]2095-140X(2015)05-0029-04

[基金項(xiàng)目]河北省人口和計(jì)劃生育委員2012年科研計(jì)劃課題(2012-A09)