T-cadherin蛋白與基因在混合細(xì)胞型霍奇金淋巴瘤中表達(dá)和臨床意義＊

任明強，譚天海，蘇 俊

（遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院：1.血液科；2.病理科，貴州遵義563003）

混合細(xì)胞型霍奇金淋巴瘤是一種國內(nèi)最常見的經(jīng)典型霍奇金淋巴瘤，約占經(jīng)典型霍奇金淋巴瘤的30%，主要在兒童和老年人中發(fā)?。?］。已有報道年齡、性別、TNM 分期、白細(xì)胞計數(shù)、淋巴細(xì)胞計數(shù)和結(jié)外累及是影響混合細(xì)胞型霍奇金淋巴瘤預(yù)后因素［2］。但是混合細(xì)胞型霍奇金淋巴瘤的診斷和預(yù)后分子標(biāo)記物依舊存在較大爭議，缺乏特異相關(guān)的預(yù)后指標(biāo)指導(dǎo)治療。T-cadherin屬于細(xì)胞黏附分子cadherin超家族的成員之一，因缺失cadherin分子中跨膜區(qū)被截短而得名（又稱CDH13或H-cadherin），研究發(fā)現(xiàn)T-cadherin在肺癌、肝癌、宮頸癌和結(jié)直腸癌等中存在顯著低表達(dá)或表達(dá)缺失，并影響腫瘤患者預(yù)后［3］。然而國內(nèi)外尚缺乏T-cadherin對混合細(xì)胞型霍奇金淋巴瘤的相關(guān)研究。因此，本研究采用免疫組織化學(xué)法和RTPCR 檢測T-cadherin在混合細(xì)胞型霍奇金淋巴瘤患者淋巴結(jié)和骨髓細(xì)胞中的表達(dá)情況，探討T-cadherin能否成為混合細(xì)胞型霍奇金淋巴瘤發(fā)生、發(fā)展的分子標(biāo)記物，為指導(dǎo)混合細(xì)胞型霍奇金淋巴瘤診斷和預(yù)后提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2002年2月至2010年2月遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院住院患者，其中混合細(xì)胞型霍奇金淋巴瘤45例為實驗組，其中男29例，女16例，年齡18～72歲，中位年齡43歲，TNM 分期Ⅰ、Ⅱ期共14例和Ⅲ、Ⅳ期共31例，均為淋巴結(jié)內(nèi)原發(fā)病變。另取同時期淋巴結(jié)反應(yīng)性增生的初治患者20例為對照組，男11例，女9例，年齡21～69歲，中位年齡41歲。診斷標(biāo)準(zhǔn)符合《張之南血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》（第3版），所有患者均活檢淋巴結(jié)組織，并對標(biāo)本制作石蠟冰凍切片保存；同時45例患者采集骨髓細(xì)胞用于RT-PCR檢測。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)法 將石蠟標(biāo)本包埋并制作2μm 連續(xù)病理切片，按照免疫組化染色說明書中的方法進(jìn)行染色。DAB試劑盒和SP染色試劑盒均從重慶生物制品有限公司購買，兔抗人T-cadherin單克隆抗體購自上海Aviva Systems Biology公司。由兩位病理醫(yī)生進(jìn)行雙盲閱片，結(jié)果取平均值。免疫組織化學(xué)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：采用半定量對T-cadherin進(jìn)行分析，按陽性細(xì)胞的染色強度記分等級為0分（陰性）、1分（弱陽性）、2分（中度陽性）和3分（強陽性）；按染色陽性細(xì)胞百分比記分等級為0分（＜10%細(xì)胞陽性）、1分（10%～25%細(xì)胞陽性）、2分（26%～50%細(xì)胞 陽 性）、3分（51%～75%細(xì) 胞 陽 性）、4 分（＞75%細(xì)胞陽性）；將染色強度和染色百分比相乘得到的分?jǐn)?shù)即為最后染色水平分級：0～3分定義為陰性，4～12分定義為陽性。

1.2.2 RT-PCR法 根據(jù)Genbank中報道的人T-cadherin的基因序列，用Primer Pre-mier5.0軟件設(shè)計T-cadherin基因的引物序列。上游引物為5′-ACCCAGCAGGTTGGCTGAA-3′，下游引物為5′-CCTCCAGGGTTATCAGCAAAGTC-3′，長度174bp。以GAPDH 為內(nèi)參照，設(shè)計特異性序列引物，上游引物為5′-TGGAAATCAATGGGAAGCAGG-3′，下游引物為5′-ATAGGTGAATCAGCAGATGGAGC-3′，長度190bp。引物均由大連寶生物工程公司合成。45例患者取相應(yīng)骨髓5mL，用肝素抗凝后，使用淋巴細(xì)胞分離液分離骨髓單個核細(xì)胞，并計數(shù)（5～10）×106細(xì)胞與Trizol總RNA 提取液1mL 混勻，凍存于-20 ℃環(huán)境中。采用Trizol法一步提取骨髓單個核細(xì)胞的總RNA。產(chǎn)物用20μL 的DEPC 水溶解。RNA 完整度檢測用電泳法，RNA 含量和純度的計算則用紫外分光光度計測量。提取1μL的總RNA 來構(gòu)成10μL反應(yīng)體系，并參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書以進(jìn)行cDNA 合成。將cDNA 用于進(jìn)一步常規(guī)PCR 擴增。條件為：94 ℃預(yù)變性1min，94 ℃30s，58 ℃30s，71 ℃40s，共30個循環(huán)，最后72 ℃延伸5min。

1.3 研究內(nèi)容 分析混合細(xì)胞型霍奇金淋巴瘤和淋巴結(jié)反應(yīng)性增生患者中T-cadherin表達(dá)情況，混合細(xì)胞型霍奇金淋巴瘤患者臨床病理特征年齡、性別、WBC、PLT、Hb、LDH、TNM 分期和結(jié)外累及與T-cadherin表達(dá)強度的關(guān)系；將年齡、性別、WBC、PLT、Hb、LDH、TNM 分期、結(jié)外累及和T-cadherin陽性表達(dá)納入混合細(xì)胞型霍奇金淋巴瘤患者結(jié)外累及多因素Logistic回歸分析；并對混合細(xì)胞型霍奇金淋巴瘤患者進(jìn)行5年隨訪，分析T-cadherin陽性表達(dá)和遠(yuǎn)期預(yù)后的關(guān)系?；旌霞?xì)胞型霍奇金淋巴瘤一線方案選ABVD 經(jīng)4～6個療程后判斷療效。第1年每3月進(jìn)行1次隨訪，第2年以后每6個月進(jìn)行1次隨訪，以2、3和5年的總生存率為遠(yuǎn)期預(yù)后評價指標(biāo)，并繪制兩組患者的生存曲線，比較兩組患者的遠(yuǎn)期預(yù)后療效。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，對計數(shù)資料采用χ2檢驗，多因素Logistic回歸分析混合細(xì)胞型霍奇金淋巴瘤患者結(jié)外累及與臨床病理特征的關(guān)系。兩組生存資料采取Kaplan-Meier方法繪制生存曲線，采用Log-rank檢驗分析組間差異。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 T-cadherin在混合細(xì)胞型霍奇金淋巴瘤和淋巴結(jié)反應(yīng)性增生患者中的表達(dá) T-cadherin的表達(dá)主要定位于細(xì)胞膜上，其在混合細(xì)胞型霍奇金淋巴瘤和淋巴結(jié)反應(yīng)性增生患者中的陰性表達(dá)分別為68.9%和10.0%，陽性表達(dá)分別為31.1%和90.0%，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1、表1。

表1 T-cadherin在混合細(xì)胞型霍奇金淋巴瘤和淋巴結(jié) 反應(yīng)性增生患者中的表達(dá)［n（%）］

圖1 T-cadherin在混合細(xì)胞型霍奇金淋巴瘤與淋巴結(jié)反應(yīng)性增生中的表達(dá)（SP×400）

2.2 T-cadherin mRNA 在混合細(xì)胞型霍奇金淋巴瘤和淋巴結(jié)反應(yīng)性增生的相對表達(dá)量 T-cadherin mRNA 在混合細(xì)胞型霍奇金淋巴瘤中表達(dá)顯著減少，相對表達(dá)量為0.36±0.03，而在淋巴結(jié)反應(yīng)性增生中大量表達(dá)，相對表達(dá)量為0.87±0.07，二者間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝31.33，P＜0.05）。這一結(jié)果和免疫組化蛋白表達(dá)趨勢結(jié)果相一致。

2.3 T-cadherin表達(dá)與混合細(xì)胞型霍奇金淋巴瘤臨床特征的關(guān)系 混合細(xì)胞型霍奇金淋巴瘤中T-cadherin 表達(dá)與患者TNM 分期和結(jié)外累及有關(guān)（P＜0.05），與患者年齡、性別、WBC、PLT、Hb、LDH 和IPS評分無相關(guān)性（P＞0.05），見表2。

表2 T-cadherin表達(dá)與混合細(xì)胞型霍奇金淋巴 瘤臨床特征的關(guān)系（n）

續(xù)表2 T-cadherin表達(dá)與混合細(xì)胞型霍奇金淋巴 瘤臨床特征的關(guān)系（n）

2.4 混合細(xì)胞型霍奇金淋巴瘤患者結(jié)外累及與臨床病理特征的關(guān)系 在混合細(xì)胞型霍奇金淋巴瘤患者中，結(jié)外累及與年齡、性別、WBC、PLT、Hb和LDH 無關(guān)（P＞0.05），與TNM 分期和T-cadherin陰性表達(dá)有關(guān)（P＝0.012、0.008）。多因素Logistic回歸分析顯示，影響混合細(xì)胞型霍奇金淋巴瘤患者結(jié)外累及OR由大到小依次為T-cadherin陰性表達(dá)、TNM 分期、性別、年齡、PLT、WBC、Hb和LDH，見表3。

表3 結(jié)外累及與臨床病理特征的多因素 Logistic回歸分析

2.5 混合細(xì)胞型霍奇金淋巴瘤患者T-cadherin表達(dá)與生存預(yù)后的關(guān)系 經(jīng)過Log-rank檢驗顯示，混合細(xì)胞型霍奇金淋巴瘤患者T-cadherin陰性表達(dá)和T-cadherin陽性表達(dá)的2年生存率分別是83.9%和92.9%（P＞0.05）；3年生存率分別是71.0%和85.7%（P＞0.05）；5年生存率分別是41.9%和78.6%（P＝0.024），見表4。同時繪制Kaplan-Meier圖，顯示T-cadherin陰性表達(dá)5年生存率明顯低于T-cadherin陽性表達(dá)（P＝0.038），見圖3。

表4 T-cadherin表達(dá)與混合細(xì)胞型霍奇金淋巴 瘤患者生存率［n（%）］

圖3 T-cadherin表達(dá)與混合細(xì)胞型霍奇金淋巴瘤患者生存曲線

3 討 論

混合細(xì)胞型霍奇金淋巴瘤是一種以R-S細(xì)胞為主，并伴有嗜酸細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞等多種細(xì)胞常見的經(jīng)典型霍奇金淋巴瘤，活檢可見以瘤細(xì)胞CD30、CD15、PAX-5 染色陽性及IgH、TCR 基因重排為特征［4-5］?；旌霞?xì)胞型霍奇金淋巴瘤存在播散傾向，生存期相對短、易復(fù)發(fā)等特點，部分患者預(yù)后差。目前，霍奇金淋巴瘤治療及預(yù)后相關(guān)因素是研究熱點，不同的研究中提出了不同的臨床預(yù)后因素，霍奇金淋巴瘤的預(yù)后因素仍未統(tǒng)一［6］。

T-cadherin屬于細(xì)胞黏附分子cadherin超家族，主要通過調(diào)節(jié)鈣介導(dǎo)的細(xì)胞黏附、細(xì)胞極性及形態(tài)形成、細(xì)胞聚集和遷移、細(xì)胞識別和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［7］。T-cadherin表達(dá)缺失使細(xì)胞間黏附力減弱，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，與腫瘤發(fā)展及轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)［8］。目前，T-cadherin在多種腫瘤（胃癌、鼻咽癌、結(jié)直腸癌、肝癌、宮頸癌、乳腺癌等）中呈低表達(dá)，并且是不良預(yù)后指標(biāo)［9-11］。而cadherin超家族中，E-cadherin對維持上皮細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)完整性有著重要作用，N-cadherin則會促進(jìn)癌細(xì)胞從癌組織脫落并使其與正常內(nèi)皮或基質(zhì)黏附。目前暫缺混合細(xì)胞型霍奇金淋巴瘤中T-cadherin表達(dá)研究的報道，混合細(xì)胞型霍奇金淋巴瘤預(yù)后與多種因素有關(guān)，但多數(shù)標(biāo)志與患者預(yù)后的關(guān)系仍不十分清楚［12］。在本研究中發(fā)現(xiàn)在混合細(xì)胞型霍奇金淋巴瘤中T-cadherin呈顯著低表達(dá)，結(jié)果顯示T-cadherin在混合細(xì)胞型霍奇金淋巴瘤中的陽性表達(dá)顯著低于淋巴結(jié)反應(yīng)性增生（P＜0.05），在國內(nèi)多項研究發(fā)現(xiàn)T-cadherin在鼻咽癌、胃癌等腫瘤中陽性表達(dá)也顯著降低［13］。同時采用RT-PCR 檢測結(jié)果顯示T-cadherin mRNA 在混合細(xì)胞型霍奇金淋巴瘤中相對表達(dá)量顯著低于淋巴結(jié)反應(yīng)性增生（P＜0.05），這一結(jié)果和免疫組織化學(xué)結(jié)果類似。進(jìn)一步分析T-cadherin表達(dá)與臨床預(yù)后等相關(guān)因素間關(guān)系，表明混合細(xì)胞型霍奇金淋巴瘤患者T-cadherin表達(dá)與年齡、性別、WBC、PLT、Hb、LDH 和IPS評分無相關(guān)性（P＞0.05），與TNM 分期和結(jié)外累及相關(guān)（P＜0.05），表明低表達(dá)T-cadherin的混合細(xì)胞型霍奇金淋巴瘤侵襲性強、危險度高、病情易進(jìn)展。結(jié)外累及作為獨立重要預(yù)后因素，在多因素Logistic回歸分析中，顯示TNM 分期和Tcadherin陰性表達(dá)是混合細(xì)胞型霍奇金淋巴瘤患者結(jié)外累及的獨立危險因素，表現(xiàn)T-cadherin陰性表達(dá)與結(jié)外累及密切關(guān)系，提示T-cadherin為判斷混合細(xì)胞型霍奇金淋巴瘤預(yù)后有重要價值。分析其作用機制，主要是T-cadherin基因啟動子甲基化導(dǎo)致T-cadherin 蛋白表達(dá)顯著降低或缺失；同時，Twist、ZEB1、Snail等多種轉(zhuǎn)錄因子可直接抑制T-cadherin 轉(zhuǎn)錄；PI3K／AKT、Ras／Raf等多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可活化核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子以抑制T-cadherin表達(dá)［14］；T-cadherin蛋白的缺失使得腫瘤間黏附力減弱，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移［15］。此外，隨訪5年顯示混合細(xì)胞型霍奇金淋巴瘤患者T-cadherin陰性表達(dá)生存率明顯低于T-cadherin陽性表達(dá)患者，并隨著時間的推移兩組間生存率的差異逐漸增加，這可能和T-cadherin隨著腫瘤的進(jìn)展而呈進(jìn)行性丟失有關(guān)。

由此可以推斷T-cadherin表達(dá)減少在混合細(xì)胞型霍奇金淋巴瘤中與臨床預(yù)后密切相關(guān)，T-cadherin可能成為混合細(xì)胞型霍奇金淋巴瘤預(yù)后相關(guān)的重要分子標(biāo)記物，為進(jìn)一步指導(dǎo)混合細(xì)胞型霍奇金淋巴瘤臨床治療提供初步理論依據(jù)。

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