糖尿病認(rèn)知功能障礙大鼠模型的建立及其認(rèn)知功能障礙觀察＊

汪 峰，何 玉，劉 宓，常 嘯，任智晶，潘 衛(wèi)，李 興

（貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院 550004）

糖尿病對(duì)于人體健康危害極大，隨著病程的發(fā)展，部分患者會(huì)出現(xiàn)認(rèn)知功能和行為缺陷等障礙，嚴(yán)重影響其生活質(zhì)量。鐘遠(yuǎn)等［1］研究顯示，慢性高血糖是認(rèn)知功能損害的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。Leibson等［2］研究顯示，糖尿病患者中老年性癡呆的發(fā)病率明顯高于正常老年人。Cukierman等［3］的研究顯示，糖尿病患者認(rèn)知功能明顯低于非糖尿病患者，其認(rèn)知功能損傷的概率是非糖尿病患者的1.5倍，未來(lái)發(fā)生癡呆的概率是后者的1.6倍。但是目前人們對(duì)于糖尿病認(rèn)知功能障礙的發(fā)病機(jī)制尚不是十分清楚，臨床上也無(wú)規(guī)范、特異的方法來(lái)診斷該病。因此建立一個(gè)良好的糖尿病伴認(rèn)知功能障礙的動(dòng)物模型，對(duì)于進(jìn)一步研究糖尿病認(rèn)知功能損害很有意義。

本研究通過(guò)大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)形成糖尿病大鼠模型，觀察糖尿病大鼠認(rèn)知功能的變化，并確立糖尿病認(rèn)知功能障礙大鼠模型建立的時(shí)間，為糖尿病并發(fā)認(rèn)知功能障礙的研究提供一種較好的工具。

1 材料與方法

1.1 材料及主要試劑 健康清潔級(jí)SD 大鼠，雄性，體質(zhì)量180～220g（貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心）；血糖儀及血糖試紙（美國(guó)雅培公司）；STZ（美國(guó)Sigma公司）。

1.2 方法

1.2.1 腹腔注射STZ 誘導(dǎo)SD 大鼠形成糖尿病 研究選擇72只雄性SD 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，經(jīng)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)挑選無(wú)認(rèn)知功能障礙的大鼠，同時(shí)采集尾部靜脈血測(cè)定大鼠空腹血糖，血糖值在3.0～5.0mmol／L。將大鼠分為6組：3 個(gè)對(duì)照組（第6、9、12 周組）和3 個(gè)模型組（第6、9、12周組），每組12 只。模型組大鼠在禁食12h后腹腔注射0.1 mol／L 枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液（pH 4.2）溶解的STZ（按50mg／kg劑量）1 mL，對(duì)照組大鼠則注射等量的0.1mol／L 枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液（復(fù)制糖尿病大鼠模型成功的標(biāo)準(zhǔn)為：注射STZ 溶液72h后空腹血糖大于或等于16.7mmol／L［4-5］，且連續(xù)3 周其空腹血糖保持在16.7mmol／L 以上［6］）。

1.2.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)知功能 分別在成模后的第6、9、12周采用Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠的認(rèn)知功能。通過(guò)定位航行和空間探索實(shí)驗(yàn)來(lái)分析SD 大鼠的認(rèn)知功能。

1.2.3 動(dòng)脈灌注法取材及光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察 通過(guò)動(dòng)脈灌注的方法留取大鼠海馬組織，固定后制作組織切片并進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察；用專用電鏡固定液繼續(xù)固定后制作超薄組織切片并染色，透射電子顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。

1.2.4 其他樣本的留取 血清樣本：采用股動(dòng)脈放血法收集血液4～5mL，并及時(shí)分離血清后置-80 ℃保存待用。組織樣本：斷頭取腦，分別分離大鼠海馬組織及腦血管（基底動(dòng)脈）并置-80 ℃保存待用。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料采用±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)和單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠的空腹血糖結(jié)果 與同時(shí)間段的對(duì)照組大鼠比較，模型組大鼠的空腹血糖水平均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠空腹血糖結(jié)果（±s，mmol／L）

表1 各組大鼠空腹血糖結(jié)果（±s，mmol／L）

a：P＜0.01，與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較。

組別 n 造模前造模后6 周 9 周 12周對(duì)照組36 3.64±0.52 4.04±0.63 4.27±0.44 4.23±1.02模型組 36 3.81±0.50 18.6±1.29a 19.0±1.36a 22.1±2.53 a

2.2 大鼠體質(zhì)量和大腦質(zhì)量以及兩者之間的比值 與同時(shí)間段的對(duì)照組大鼠比較，模型組大鼠的大腦質(zhì)量明顯減輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；模型組大鼠的體質(zhì)量較同時(shí)間的對(duì)照組明顯減輕，大腦質(zhì)量與體質(zhì)量的比值明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表2。

2.3 大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與同時(shí)間段的對(duì)照組大鼠比較，模型組大鼠的逃避潛伏期和首次穿越時(shí)間均明顯增加，穿越次數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表3。

表2 各組大鼠的體質(zhì)量和大腦質(zhì)量以及兩者之間的比值結(jié)果（±s，n＝36）

表2 各組大鼠的體質(zhì)量和大腦質(zhì)量以及兩者之間的比值結(jié)果（±s，n＝36）

a：P＜0.05，b：P＜0.01，與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較。

項(xiàng)目6周對(duì)照組 模型組9周對(duì)照組 模型組12周對(duì)照組 模型組大腦質(zhì)量（g） 1.352±0.05 1.304±0.03a 1.401±0.06 1.258±0.04b 1.447±0.07 1.167±0.04 b體質(zhì)量（g） 314.2±19.2 220.5±22.7a 367.4±22.9 196.6±26.9b 408.9±23.3 178.0±32.2b大腦質(zhì)量／體質(zhì)量 0.004 3±0.000 2 0.006 0±0.000 5a 0.003 8±0.000 2 0.006 5±0.000 8b 0.003 5±0.000 2 0.006 7±0.001 0 b

表3 各組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s，n＝36）

表3 各組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s，n＝36）

a：P＜0.01，與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較。

項(xiàng)目6周對(duì)照組 模型組9周對(duì)照組 模型組12周對(duì)照組 模型組逃避潛伏期（s） 10.16±4.86 16.06±8.58a 9.92±4.54 19.27±10.13a 10.26±6.50 24.02±11.82 a首次穿越時(shí)間（s） 7.40±3.08 13.84±6.40a 7.28±3.45 15.43±8.09a 8.02±5.14 21.93±13.19a穿越次數(shù)（n） 4.46±2.48 2.88±1.95a 4.71±2.48 2.63±1.66a 4.79±2.53 2.56±1.32 a

圖3 各組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞電子顯微鏡下超微結(jié)構(gòu)

2.4 大鼠海馬組織透射電鏡觀察結(jié)果 各時(shí)間段對(duì)照組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞的細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則，核內(nèi)染色質(zhì)豐富，分布均勻，核仁明顯，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器豐富，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分布規(guī)則，網(wǎng)腔均勻一致，線粒體數(shù)量較多，排列密集；模型組大鼠從成模后第6 周開(kāi)始至第12 周，其海馬神經(jīng)元細(xì)胞逐漸出現(xiàn)細(xì)胞體積變小，核膜皺縮，核內(nèi)染色質(zhì)分布不均，顆?；蓧K并邊集，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)網(wǎng)腔擴(kuò)張，分布不規(guī)則，線粒體腫脹，呈不規(guī)則形，雙層膜結(jié)構(gòu)不清，并且這些形態(tài)學(xué)改變隨著糖尿病病程的延長(zhǎng)日趨明顯，見(jiàn)圖3。

2.5 大鼠海馬組織切片HE 染色觀察結(jié)果 各時(shí)間段對(duì)照組大鼠海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元細(xì)胞（主要是錐體細(xì)胞）形態(tài)均較正常，大多呈圓形或橢圓形，細(xì)胞核大而圓，細(xì)胞質(zhì)淡染、呈嗜堿性，且排列規(guī)則有序；成模后第6周及第9周的模型組大鼠海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)與對(duì)照組相比并未見(jiàn)明顯異常，但成模后第12周模型組大鼠海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)了較明顯的異常，主要表現(xiàn)為神經(jīng)元數(shù)量有所減少，細(xì)胞腫脹，細(xì)胞核碎裂或者消失，細(xì)胞排列紊亂疏松，見(jiàn)圖4。

圖4 對(duì)照組與模型組大鼠海馬CA1區(qū)的組織學(xué)改變（HE×400）

3 討 論

隨著糖尿病的發(fā)生，許多糖尿病患者的認(rèn)知能力會(huì)出現(xiàn)不同程度下降，尤其在老年人中正在成為一個(gè)不容忽視的醫(yī)學(xué)和社會(huì)問(wèn)題。Dalai等［7］研究顯示，糖尿病時(shí)血管內(nèi)皮功能和血小板凝集功能障礙加重，導(dǎo)致血管內(nèi)皮增殖和血漿粘稠度增加，從而出現(xiàn)腔隙性腦梗死及腦血栓等并發(fā)癥。而糖尿病的慢性毒性作用會(huì)導(dǎo)致微血管受損，數(shù)目減少，基底膜增厚，血腦屏障完整性受到破壞，影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸和血流不暢，進(jìn)而導(dǎo)致腦組織受損［8］。糖尿病患者由于糖代謝紊亂，會(huì)導(dǎo)致腦血管改變，進(jìn)而損害中樞神經(jīng)系統(tǒng)，使得大腦在結(jié)構(gòu)、神經(jīng)生理及神經(jīng)精神等方面發(fā)生病理改變，最終可能形成以獲得性認(rèn)知功能和行為缺陷為特征的糖尿病慢性并發(fā)癥，即糖尿病腦?。?-10］。因此，建立穩(wěn)定可靠的糖尿病認(rèn)知功能障礙的動(dòng)物模型，對(duì)于該病的進(jìn)一步研究顯得十分重要和必要。自1960年開(kāi)始有研究人員利用STZ誘發(fā)動(dòng)物制作糖尿病模型以來(lái)［11］，STZ已成為當(dāng)前廣泛采用的糖尿病動(dòng)物模型化學(xué)誘導(dǎo)劑。但STZ誘導(dǎo)糖尿病動(dòng)物模型的成功率受諸多因素影響，包括給藥的劑量、給藥方法、STZ的溶劑以及大鼠的品種等，因此造模的成功率也有所不同。一般認(rèn)為，一次性大劑量（50～90 mg／kg）的STZ腹腔或靜脈注射可直接破壞胰島β細(xì)胞導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生，其具有簡(jiǎn)便、用藥量小、藥物毒性較低、胰島β細(xì)胞損傷特異性高等諸多優(yōu)點(diǎn)。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)采用50mg／kg的STZ劑量及pH 4.2、0.1mol／L 枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液進(jìn)行溶解對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射的成模率高、死亡率低［12］。

盡管目前有關(guān)糖尿病腦病的發(fā)病機(jī)制并不十分清楚，直接建立糖尿病腦病動(dòng)物模型還存在著諸多困難，但已有研究表明，神經(jīng)細(xì)胞的變性和凋亡導(dǎo)致中樞神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)目減少是癡呆以及其他中樞神經(jīng)變性性疾病發(fā)生認(rèn)知功能障礙的重要病理基礎(chǔ)［13］。因此，在此認(rèn)識(shí)的基礎(chǔ)上，本研究首先采用STZ（按50mg／kg的劑量）誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型，在成模后的不同時(shí)間段進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)顯示，模型組大鼠的逃避潛伏期、首次穿越時(shí)間均明顯比對(duì)照組延長(zhǎng)或增加，而穿越次數(shù)則明顯比對(duì)照組減少，說(shuō)明所復(fù)制的糖尿病大鼠已經(jīng)發(fā)生了不同程度的學(xué)習(xí)記憶功能障礙，且隨著病程的延長(zhǎng)其學(xué)習(xí)記憶功能障礙也表現(xiàn)得越來(lái)越明顯和嚴(yán)重；不同時(shí)間段各組大鼠的海馬組織分別用透射電子顯微鏡以及HE 染色后用普通光學(xué)顯微鏡觀察其形態(tài)學(xué)上的變化顯示，隨著模型組大鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙程度的增加，與同時(shí)間段的對(duì)照組比較，其海馬神經(jīng)元在形態(tài)學(xué)上的改變?cè)絹?lái)越明顯，且數(shù)量也在減少，這說(shuō)明海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的加快與其認(rèn)知功能障礙程度的加重息息相關(guān)，存在著因果關(guān)系。王憲玲等［14］在對(duì)自發(fā)性2型糖尿病小鼠進(jìn)行研究時(shí)也得出了類似的結(jié)果。此外，通過(guò)對(duì)模型組大鼠大腦質(zhì)量的分析可以看出，隨著糖尿病病程的延長(zhǎng)，特別是從成模后第六周開(kāi)始，與同時(shí)間段的對(duì)照組大鼠相比較，其大腦質(zhì)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），這與Bao等［15］的研究結(jié)果相似。我們的研究結(jié)果表明，通過(guò)以上方法來(lái)建立糖尿病并發(fā)認(rèn)知功能障礙大鼠模型的方法是科學(xué)和合理的。

本研究通過(guò)對(duì)模型組大鼠的動(dòng)態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠從第6周開(kāi)始出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙，并隨著糖尿病病程的延長(zhǎng)呈進(jìn)行性加重。采用透射電子顯微鏡及HE 染色等手段對(duì)其海馬組織進(jìn)行觀察，海馬神經(jīng)元細(xì)胞從發(fā)病后第6周開(kāi)始出現(xiàn)凋亡前的形態(tài)學(xué)改變，并隨著糖尿病病程的延長(zhǎng)而日趨明顯。但成模后第6周及第9周的模型組大鼠海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)與對(duì)照組相比并未見(jiàn)明顯異常，而成模后第12周的模型組大鼠海馬CA1 區(qū)的神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)則出現(xiàn)了較明顯的異常，主要表現(xiàn)為神經(jīng)元數(shù)量有所減少，細(xì)胞腫脹，細(xì)胞核碎裂或者消失，細(xì)胞排列紊亂疏松。

以上結(jié)果表明，利用STZ誘導(dǎo)SD 大鼠形成糖尿病后，隨著病情的發(fā)展，糖尿病大鼠逐漸出現(xiàn)了認(rèn)知功能障礙。至第12周，其大腦海馬神經(jīng)元在形態(tài)學(xué)上發(fā)生了明顯變化，并出現(xiàn)了相應(yīng)的行為學(xué)改變，因此可以將該時(shí)間段作為糖尿病并發(fā)認(rèn)知功能障礙大鼠模型的建立時(shí)間。

［1］ 鐘遠(yuǎn)，賈偉平.中老年2型糖尿病早期認(rèn)知功能改變的臨床研究［J］.實(shí)用診斷與治療雜志，2005，19（8）：128.

［2］ Leibson CH，Rocca WA，Hanson VA，et al.Risk of dementia among persons with diabetes mellitus：apopulation-based cohort study［J］.Am J Epidemiol，1997，145（4）：301-308.

［3］ Cukierman T，Gerstein HC，Williamson JD.Cognitive decline and dementia in diabetes.systematic overview of prospective observational studies［J］.Diabetologia，2005，48（12）：2460-2469.

［4］ 張芳林，李果，劉優(yōu)萍.2型糖尿病大鼠模型的建立及其糖代謝特征分析［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2002（1）：18-22.

［6］ 汪峰，楊國(guó)珍，劉宓，等.鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型穩(wěn)定性觀察［J］.貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012（1）：40-42.

［7］ Dalai PM，Parab PV.Cerebrovascular disease in type 2diabetes mellitus［J］.Neurol India，2002，50（4）：380-385.

［8］ Muranyi M，F(xiàn)ujioka M，He Q，et al.Diabetea activates cell death pathway after transient focal cerebral i-hetnia［J］.Diabete，2003，52（2）：481-486.

［9］ Fazeli SA.Neuroprotection in Diabetic Encephalopathy［J］.Neurodegener Dis，2009，6（5／6）：213-218.

［11］ Rakieten N，Rackietan ML，Nadkarni MR.Studies on the diabetogenic action of streptozotocin（NSC-37917）［J］.Cancer Chemother Rep，1963，29：91-98.

［12］ 趙芳，蔣朝暉，楊國(guó)珍，等.不同劑量鏈脲佐菌素建立1型糖尿病大鼠模型［J］.貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，35（1）：22-25.

［13］ Savitz SI，Rosenbaum DM.Apoptosis in neurological disease［J］.Neurosurgery，1998，42（3）：555-574.

［14］ 王憲玲，賈建平.自發(fā)性2型糖尿病小鼠發(fā)病早期認(rèn)知功能的研究［J］.首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，28（1）：75-77.

［15］ Bao Y，Jiang L，Shi YQ，et al.Increased expression of phosphorylated Smad2and Smad3in the hippocampus of streptozotocin-induced diabetic rats［J］.Exp Clin Endocrinol Diabetes，2010，118（1）：47-50.