乳酸恩諾沙星對(duì)溫和氣單胞菌的體外抗菌后效應(yīng)

李 莉，曹延超，謝旭陽，陳 穎，戴文婷，孔祥會(huì)

(河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453007)

乳酸恩諾沙星對(duì)溫和氣單胞菌的體外抗菌后效應(yīng)

李 莉，曹延超，謝旭陽，陳 穎，戴文婷，孔祥會(huì)

(河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453007)

為研究乳酸恩諾沙星對(duì)溫和氣單胞菌(A.sobria)的體外藥效學(xué)，采用二倍稀釋法測定了乳酸恩諾沙星對(duì)溫和氣單胞菌的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)，在此基礎(chǔ)上探究在溫和氣單胞菌的不同生長時(shí)期加入乳酸恩諾沙星后對(duì)其生長的影響，研究乳酸恩諾沙星不同藥物濃度(2×MIC、4×MIC、8×MIC)作用對(duì)溫和氣單胞菌的殺菌動(dòng)力學(xué)和抗菌后效應(yīng)(PAE)。結(jié)果顯示，乳酸恩諾沙星對(duì)溫和氣單胞菌的MIC和MBC分別為0.39 μg/mL和1.56 μg/mL，乳酸恩諾沙星對(duì)溫和氣單胞菌有較強(qiáng)的殺菌作用，其PAE與藥物濃度呈正相關(guān)。

溫和氣單胞菌；乳酸恩諾沙星；生長曲線；殺菌曲線；抗菌后效應(yīng)

溫和氣單胞菌(A.sobria)是我國淡水和海水水產(chǎn)品的一種常見致病菌，可以引起多種水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物感染發(fā)病，可單獨(dú)引發(fā)感染或與嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)、豚鼠氣單胞菌(A.caviae)及其他病原菌混合感染，具有發(fā)病率高、傳染性強(qiáng)、死亡快的特點(diǎn)。有報(bào)道該菌可導(dǎo)致羅非魚(Tilapia)的出血性敗血病,中華鱉(Trionyxsinensis)的肝水腫病,鯉((Cyprinuscarpio)的體表潰爛病, 幼鱉的白點(diǎn)病[1]等。另外，此菌可以通過病魚經(jīng)消化道感染人類，導(dǎo)致人類食物中毒，造成腹瀉、敗血癥等疾病[2]，屬于人獸魚共染的病原細(xì)菌。

恩諾沙星(enrofloxacin)是第一個(gè)畜禽專用的氟喹諾酮類廣譜抗菌藥物[3]。廣泛應(yīng)用于包括水生動(dòng)物在內(nèi)的各種動(dòng)物細(xì)菌性疾病的預(yù)防和治療，幾乎對(duì)水生動(dòng)物所有病原菌均具有較強(qiáng)的抗菌活性，對(duì)赤鰭病、爛尾病、爛鰓病、腸炎病等水產(chǎn)類動(dòng)物疾病具有良好的療效[4]。乳酸恩諾沙星為恩諾沙星的乳酸鹽，其水溶性好于鹽酸恩諾沙星，口服吸收快，體內(nèi)分布廣，對(duì)革蘭陰性菌有很強(qiáng)的殺滅作用，對(duì)革蘭陽性菌也有良好的抗菌作用。為了解乳酸恩諾沙星的體外抗菌活性，達(dá)到有效的控制魚類細(xì)菌性疾病，本研究選擇魚類病原菌A.sobria，測定了乳酸恩諾沙星對(duì)A.sobria的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)、最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration，MBC)和抗菌后效應(yīng)(post antibiotic effect，PAE)，以期為指導(dǎo)生產(chǎn)上科學(xué)使用氟喹諾酮類藥物提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株 供試A.sobria由河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院水產(chǎn)動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究室提供，分離自患病斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)。

1.1.2 試驗(yàn)藥品 供試藥品乳酸恩諾沙星(含量98%)為浙江朗博藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；試驗(yàn)所用胰蛋白胨、大豆蛋白胨、氯化鈉、瓊脂粉等為北京奧博星公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 乳酸恩諾沙星母液的制備 精密稱取20.0 mg乳酸恩諾沙星，加入少量0.1 mol/L NaOH溶液，待完全溶解后，加水定容至10 mL，即為2 000 μg/mL的母液，經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌后分裝，使用前配制。

1.2.2 培養(yǎng)基的配制 TSB培養(yǎng)基的配制方法: 稱取胰蛋白胨15.0 g，大豆蛋白胨5.0 g，氯化鈉5.0 g，加適量水后，調(diào)節(jié)pH至7.2，加水定容至1 000 mL，121 ℃高壓滅菌20 min；TSA培養(yǎng)基則是在TSB培養(yǎng)基中加入15 g/L的瓊脂粉配制而成。1.2.3 細(xì)菌培養(yǎng) 將保存的A.sobria菌種進(jìn)行活化，取10 μL菌液接種到1 000 μL的TSB培養(yǎng)基中，28 ℃搖床培養(yǎng)過夜后，劃線接種于TSA培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)24 h。挑取典型的單菌落接種于1 000 μL TSB培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)12 h后轉(zhuǎn)接到100 mL TSB培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，調(diào)整菌液濃度使活菌數(shù)達(dá)到108CFU/mL作為后續(xù)試驗(yàn)用菌懸液。

1.2.4 最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)測定 使用杭州天和微生物試劑有限公司生產(chǎn)的恩諾沙星藥敏紙片，采用K-B紙片瓊脂擴(kuò)散法，以大腸埃希菌ATCC 25922為質(zhì)控，按照CLSI標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)及結(jié)果判定[5]。在藥物敏感定性檢測的基礎(chǔ)上，參考戴自英等試管二倍稀釋法[6-8]進(jìn)行MIC的測定。將乳酸恩諾沙星藥物母液稀釋2倍(1 000 μg/mL)之后加入到第1支試管，再進(jìn)行2倍稀釋加入到第2支試管，以此類推直至稀釋到1 000 μg/mL～0.25 μg/mL的13個(gè)濃度梯度。

取15支無菌帶塞試管分別編號(hào)1號(hào)～15號(hào)，每支試管裝有TSB培養(yǎng)基4.0 mL，1號(hào)～13號(hào)試管加入不同濃度的藥液0.5 mL, 14號(hào)試管加0.5 mL無菌水，15號(hào)試管加1 mL的TSB培養(yǎng)基，將1號(hào)～14號(hào)試管各加入0.5 mL濃度為108CFU/mL的菌液，使細(xì)菌的終濃度約為107CFU/mL，而培養(yǎng)基中的藥液濃度達(dá)到100 μg/mL～0.025 μg/mL，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察無明顯細(xì)菌生長的試管對(duì)應(yīng)的最低藥物濃度即為MIC。培養(yǎng)48 h，取MIC上無明顯細(xì)菌生長的各個(gè)藥液濃度的菌液0.1 mL均勻涂布于TSA培養(yǎng)基，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，菌落數(shù)小于5個(gè)的作為該藥物的最小殺菌濃度(MBC)[6]，測定重復(fù)5次。

1.2.5 乳酸恩諾沙星對(duì)A.sobria生長的影響 取處于對(duì)數(shù)生長期的菌懸液進(jìn)行接種，按照5%的接種量將菌懸液接種于100 mL液體培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)。分別于0 h～13 h期間每間隔1 h取樣1次，分光光度計(jì)測定OD600 nm值。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制A.sobria的生長曲線。

在檢測A.sobria生長曲線的基礎(chǔ)上，研究乳酸恩諾沙星對(duì)A.sobria生長的影響。設(shè)置3個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組，每組按5%的接種量接種A.sobria，其中對(duì)照組于0 h加入1 mL無菌水，試驗(yàn)組分別在接種后培養(yǎng)的第0、1、5 h加入乳酸恩諾沙星藥液，使乳酸恩諾沙星的最終濃度達(dá)到MIC值[3,7]。28 ℃、150 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)，分別于0 h～13 h每間隔1 h取樣，分光光度計(jì)測定OD600 nm值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600 nm值為縱坐標(biāo)繪制生長曲線。

1.2.6 乳酸恩諾沙星對(duì)A.sobria的殺菌動(dòng)力學(xué)①配制乳酸諾氟沙星20×MIC、40×MIC、80×MIC的藥物濃度。取盛有4 mL無菌TSB的試管4支，編號(hào)為A、B、C、D，其中A、B、C中分別加入濃度為20×MIC、40×MIC、80×MIC乳酸恩諾沙星藥液0.5 mL，D組為4.5 mL無菌TSB的對(duì)照組，然后，向4支試管中分別加入0.5 mL處于對(duì)數(shù)生長期的菌懸液，使得藥物終濃度分別達(dá)到2×MIC、4×MIC、8×MIC ，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行。28 ℃、150 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)，分別在0、3、6、9、12 h取0.1 mL的培養(yǎng)液，用無菌生理鹽水對(duì)菌懸液進(jìn)行10倍系列稀釋，取稀釋度104～106的稀釋液各0.1 mL置于TSA平板均勻涂布，每個(gè)稀釋度3個(gè)平板，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，對(duì)細(xì)菌數(shù)在30～300間的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，取其平均值，計(jì)算活菌數(shù)(CFU/mL)。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，每毫升菌液中活菌數(shù)(CFU/mL)的對(duì)數(shù)(lg)為縱坐標(biāo)，建立乳酸恩諾沙星對(duì)A.sobria的殺菌動(dòng)力學(xué)曲線[9]。

1.2.7 乳酸恩諾沙星對(duì)A.sobria的體外抗菌后效應(yīng)(PAE) 參考蘇振霞等[9]的方法稍加改進(jìn)，設(shè)置試驗(yàn)管T和對(duì)照管C。取5只無菌的試管分別編號(hào)為T1、T2、T3、C1、C2，其中T1、T2、T3為試驗(yàn)組，C1、C2為對(duì)照組。試驗(yàn)組每支試管加入4 mL無菌TSB，分別加入0.5 mL的20×MIC、40×MIC、80×MIC乳酸恩諾沙星藥液，對(duì)照組為4.5 mL無菌TSB，再向各試管中加0.5 mL 濃度為108CFU/mL的菌懸液，使T1、T2、T3試管中藥物的終濃度分別為2×MIC、4×MIC、8×MIC。置于28 ℃、150 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)。

培養(yǎng)2 h后，采用100倍稀釋除藥法，取上述各試驗(yàn)管及對(duì)照管中的菌液0.1 mL分別加入到5支裝有9.9 mL、28 ℃預(yù)溫的TSB試管中，C2中加入適量的乳酸恩諾沙星藥液，使藥物終濃度為0.08×MIC，作為殘留藥物造成PAE的對(duì)照組。以上各管混勻后立即進(jìn)行28 ℃、150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)，此時(shí)計(jì)作0h，分別在0、2、4和6 h取0.1 mL菌液適當(dāng)稀釋后，涂布TSA平板，進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，重復(fù) 3 次，取平均值。將各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)菌濃度值(CFU/mL)取對(duì)數(shù)(lg CFU/mL)后作為為縱坐標(biāo)，以時(shí)間(h)為橫坐標(biāo)作圖，建立對(duì)照管及試驗(yàn)管細(xì)菌重建后恢復(fù)生長的動(dòng)力學(xué)曲線。

由細(xì)菌生長動(dòng)力學(xué)曲線計(jì)算T、C，其中，T和C分別為試驗(yàn)管和對(duì)照管細(xì)菌濃度CFU/mL高于重建后零時(shí)10倍所需時(shí)間(h)，按照PAE=T-C的公式計(jì)算PAE值[10-11]。

2 結(jié)果

2.1 乳酸恩諾沙星對(duì)A. sobria的MIC和MBC

使用K-B紙片瓊脂擴(kuò)散法檢測結(jié)果顯示，恩諾沙星對(duì)A.sobria敏感(抑菌圈直徑40 mm)，采用二倍稀釋法測得乳酸恩諾沙星對(duì)A.sobria的MIC為0.39 μg/mL，MBC為1.56 μg/mL，計(jì)算出MBC/MIC為4。

2.2 乳酸恩諾沙星對(duì)A. sobria生長的影響

在28 ℃、150 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)條件下，A.sobria的生長曲線如圖1所示，1 h之前是短暫的延滯期，1 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，大約11 h后進(jìn)入穩(wěn)定期。

圖1 A. sobria的生長曲線Fig.1 The growth curve of A. sobria

在接種A.sobria培養(yǎng)后0、1、5 h 3個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)分別向試驗(yàn)組加入乳酸恩諾沙星藥液，使培養(yǎng)液中最終藥物濃度為1×MIC，藥物處理后A.sobria的生長曲線如圖2所示。結(jié)果表明，在不同生長時(shí)期進(jìn)行藥物處理具有不同的影響，在0 h接種同時(shí)加入乳酸恩諾沙星，藥物對(duì)A.sobria的生長有明顯的抑制作用，對(duì)照組在11 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，而0 h藥物處理組在培養(yǎng)4 h左右進(jìn)入穩(wěn)定期；培養(yǎng)1 h后的藥物處理組，細(xì)菌增長速率低于對(duì)照組，在加入藥液2 h后生長減慢，進(jìn)入穩(wěn)定期；培養(yǎng)5 h后加入恩諾沙星的處理組，在加入藥物1 h之后，細(xì)菌增長速率較對(duì)照組降低，在添加藥物4 h后進(jìn)入穩(wěn)定期。圖2顯示，在A.sobria生長的延滯期加入乳酸恩諾沙星，藥物對(duì)該菌的生長有強(qiáng)抑制作用。而在對(duì)數(shù)生長期加入藥物，其抑制作用較延滯期低。

圖2 不同時(shí)間加入乳酸恩諾沙星后A. sobria的生長曲線Fig.2 The growth curve of A. sobria with addition of enrofloxacin at different time

2.3 乳酸恩諾沙星對(duì)A. sobria的體外殺菌作用

乳酸恩諾沙星以2×MIC、4×MIC、8×MIC作用后，對(duì)A.sobria的體外殺菌作用如圖3所示。從圖3可以看出，細(xì)菌與藥物接觸后，數(shù)量開始減少，在3 h～12 h內(nèi)顯示出隨藥物濃度的增加，殺菌效果增強(qiáng)的濃度依賴性規(guī)律。

圖3 乳酸恩諾沙星對(duì)A. sobria的殺菌動(dòng)力曲線Fig.3 The killing curve of enrofloxacin against A. sobria in different concentration

2.4 乳酸恩諾沙星對(duì)A. sobria的抗菌后效應(yīng)

乳酸恩諾沙星以2×MIC、4×MIC、8×MIC的藥物濃度對(duì)A.sobria接觸2 h后，體外抗菌后效應(yīng)結(jié)果見表1，除去藥物后細(xì)菌的恢復(fù)生長情況見圖4。

由表1可知，隨著藥物濃度的升高，PAE值增大，呈現(xiàn)濃度依賴性。由圖4可以看出藥物殘留對(duì)照C2與空白對(duì)照C1的生長曲線幾乎相同，而C1和C2的活菌數(shù)高于2×MIC、4×MIC和8×MIC實(shí)驗(yàn)組，試驗(yàn)組細(xì)菌數(shù)隨著藥物濃度的的增加而減少。在相同試驗(yàn)條件下，高濃度藥物組對(duì)A.sobria的抑制效果高于低濃度組。

表1 恩諾沙星對(duì)A. sobria的體外抗菌后效應(yīng)值Table 1 Postantibiotic effects value of enrofloxacin against A. sobria at different concentrations

圖4 恩諾沙星作用于A. sobria后抗菌后效應(yīng)期的細(xì)菌生長曲線Fig.4 The growth curve of A. sobria in the postantibiotic effect phase of enrofloxacin

3 討論

3.1 乳酸恩諾沙星對(duì)A. sobria的敏感性

乳酸恩諾沙星對(duì)A.sobria的MIC、MBC的相關(guān)報(bào)道較少。王志強(qiáng)等[3]研究氟喹諾酮類藥物對(duì)A.sobria的體外藥效時(shí)的結(jié)果顯示，鹽酸恩諾沙星對(duì)A.sobria的MIC為0.025 mg/L，MBC/MIC為2。樊海平等[10]研究鹽酸恩諾沙星的藥物效應(yīng)時(shí)，得出其對(duì)A.sobria的MIC、MBC均為0.048 8 mg/L。樊海平等總結(jié)了國內(nèi)外關(guān)于恩諾沙星對(duì)水產(chǎn)致病菌的體外抑菌試驗(yàn)，認(rèn)為恩諾沙星對(duì)敏感病原微生物如氣單胞菌等的MIC小于0.1 mg/L 。而本試驗(yàn)結(jié)果乳酸恩諾沙星對(duì)A.sobria的MIC和MBC與上述文獻(xiàn)報(bào)道相比數(shù)值偏大，可能由于試驗(yàn)所用菌株為臨床分離株，在生產(chǎn)中長期使用抗菌藥物控制疾病，導(dǎo)致病原菌對(duì)抗菌藥物的敏感性下降而使MIC 和 MBC 值升高。此外，不同研究者得到的研究結(jié)果的差別，也可能與所使用的藥物來源、菌株來源、培養(yǎng)基成分差異，試驗(yàn)中菌液的使用濃度不同等因素有關(guān)[11]。

乳酸恩諾沙星對(duì)A.sobria有較好的抑菌殺菌效果，作用效果在細(xì)菌生長的不同時(shí)期有差異。在延滯期加入乳酸恩諾沙星，對(duì)A.sobria的生長具有較強(qiáng)抑制作用，而在對(duì)數(shù)生長期加入藥物，其抑制作用較延滯期相對(duì)較弱。因此在防治由A.sobria引發(fā)的疾病時(shí)，及早用藥對(duì)疾病的控制和治療非常重要。

本研究結(jié)果顯示乳酸諾氟沙星的殺菌效果隨藥物濃度的增加而增強(qiáng)，表現(xiàn)較強(qiáng)的濃度依賴性，結(jié)果與馬寅等[12]、徐麗娟等[13]等研究的藥物對(duì)細(xì)菌殺菌曲線的規(guī)律是一致的。過低濃度的藥物對(duì)病原菌沒有抑菌或殺菌作用，長期使用還會(huì)引起細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性[14]。因此，生產(chǎn)中應(yīng)注意乳酸恩諾沙星的使用濃度，避免長期低劑量使用抗菌藥物進(jìn)行魚病防治。

3.2 乳酸恩諾沙星的體外PAE

PAE又稱抗菌后效應(yīng)，是指細(xì)菌和抗菌藥物短暫接觸，當(dāng)抗菌藥物被清除或下降至MIC以下時(shí)，在一定時(shí)間內(nèi)細(xì)菌生長仍受到持續(xù)抑制的效應(yīng)[9]。PAE已成為評(píng)價(jià)抗菌藥物藥效學(xué)的重要參數(shù)。本研究中乳酸恩諾沙星對(duì)A.sobria的PAE，顯示出隨藥物濃度增加PAE值增大的濃度依賴性的規(guī)律，和徐麗娟等[13]研究恩諾沙星對(duì)A.hydrophila的PAE的結(jié)果相一致。獸醫(yī)臨床對(duì)氟喹諾酮類藥物的研究結(jié)果也顯示，氟喹諾酮類藥物抑、殺菌作用在很大范圍內(nèi)呈劑量依賴關(guān)系[13]。藥物體外PAE的試驗(yàn)結(jié)果可能與多種因素有關(guān)：①菌種及其接種量：同一種藥物在體外的PAE因菌種的不同而不同，而在一定的藥物濃度下，接種量越大，殘存的細(xì)菌越多，恢復(fù)生長就相對(duì)較快，PAE縮短；②藥物濃度：PAE值隨藥物濃度增加而增大；③藥物與細(xì)菌的接觸時(shí)間：接觸時(shí)間越長，PAE越大；④其他因素：藥物的聯(lián)合作用、pH、溫度、培養(yǎng)基等也會(huì)對(duì)藥物的體外PAE產(chǎn)生影響。

按照傳統(tǒng)觀念，抗菌藥物需維持1×MIC以上濃度，方能發(fā)揮療效，當(dāng)血藥濃度低于1×MIC 時(shí)應(yīng)再次給藥[15]。本研究中乳酸恩諾沙星的PAE結(jié)果顯示，乳酸恩諾沙星和A.sobria同培養(yǎng)2 h后除去藥物，其抑菌作用并沒有消失。由于PAE的存在，即使乳酸恩諾沙星濃度低于MIC，仍可以持續(xù)發(fā)揮抗菌作用。目前，恩諾沙星在水產(chǎn)上的應(yīng)用越來越廣，為防止藥物濫用所造成的藥物殘留，減少藥物對(duì)養(yǎng)殖水環(huán)境的污染以及耐藥菌的出現(xiàn)，在制定給藥方案時(shí)，可考慮以血藥濃度高于1×MIC 的時(shí)間與 PAE 的時(shí)間之和作為給藥間隔，或者減少給藥次數(shù)，在滿足療效的基礎(chǔ)上，降低臨床上可能出現(xiàn)的毒副作用，達(dá)到高效、安全的治療目的。

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Postantibiotic Effects of EnrofloxacininVitroAgainstAeromonassobria

LI Li,CAO Yan-chao,XIE Xu-yang,CHEN Ying,DAI Wen-ting,KONG Xiang-hui

(CollegeofFisheries,HenanNormalUniversity,Xinxiang,Henan,453007,China)

In order to research the pharmacodynamics of enrofloxacin onAeromonassobriainvitro. The minimal inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) of enrofloxacin againstA.sobriawere determined by two-fold broth macrodilution method. Then the effect of enrofloxacin on growth curves ofA.sobriain different periods,and the kinetics of sterilization and postantibiotic effects(PAE) of enrofloxacin in different concentrations (2×MIC，4×MIC，8×MIC) onA.sobriawas studied. Results showed that the MIC and MBC of enrofloxacin againstA.sobriawere 0.39 μg/mL and 1.56 μg/mL, respectively. The enrofloxacin has a strong bactericidal effect againstA.sobria, the PAE and drug concentration of it were positively correlated.

A.sobria；enrofloxacin；growth curve；bactericidal curve；PAE

2014-05-13

河南省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(092102110030，122102110216，132102110045)

李 莉(1969-)，女，河南鞏義人，副教授，博士，主要從事水產(chǎn)動(dòng)物醫(yī)學(xué)相關(guān)研究。

S948;S859.796

:A

:1007-5038(2015)01-0057-05