劉軒豪，蒯 健，傅麗華，賈建波

(淮陰工學(xué)院 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江蘇 淮安 223003)

橙色粘球菌微生態(tài)制劑的制備和應(yīng)用

劉軒豪，蒯 健，傅麗華，賈建波*

(淮陰工學(xué)院 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江蘇 淮安 223003)

將橙色粘球菌JCH-04的發(fā)酵液通過(guò)微孔濾膜濃縮制成微生態(tài)制劑，通過(guò)抑菌試驗(yàn)，結(jié)果表明該品對(duì)水中常見的6種病原微生物具有較強(qiáng)的抑制作用。通過(guò)對(duì)草魚灌服該制劑測(cè)試其安全性，結(jié)果表明橙色粘球菌JCH-04菌株對(duì)草魚安全無(wú)毒，且產(chǎn)生的多種消化酶：淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶，均具有較高的活性，說(shuō)明該菌株可以作為在水產(chǎn)品養(yǎng)殖中具有安全性和潛在應(yīng)用價(jià)值的外源益生菌使用。

橙色粘球菌；微生態(tài)制劑；益生菌

0 引言

粘細(xì)菌(Myxobacteria)是一類具有復(fù)雜多細(xì)胞行為的原核生物，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、攝食、運(yùn)動(dòng)和分化發(fā)育等方面表現(xiàn)出顯著的社會(huì)性特征。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，粘細(xì)菌作為一類重要天然產(chǎn)物的生產(chǎn)者，可產(chǎn)生異常豐富的次級(jí)代謝產(chǎn)物，是重要的、具有巨大藥物開發(fā)潛力的藥源菌類群[1-2]。

粘細(xì)菌作為微生態(tài)制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)方面的應(yīng)用，其最重要的特性就是粘細(xì)菌作為一種捕食性微生物，能夠吞噬大腸桿菌及其它一些革蘭氏陰性菌，它分泌的胞外活性物質(zhì)對(duì)真菌和細(xì)菌具有較強(qiáng)的抗性[3-4]，因此具有以菌治菌的生物防治作用；粘細(xì)菌還能產(chǎn)生消化酶將蛋白質(zhì)、核酸、酯類等大分子物質(zhì)分解，有利于飼料消化率的提高；粘細(xì)菌及其酶，從菌來(lái)說(shuō)，未發(fā)現(xiàn)其有害作用，從酶來(lái)說(shuō)，化學(xué)成分是蛋白質(zhì)，故不會(huì)產(chǎn)生對(duì)環(huán)境的污染和對(duì)人體健康的危害[5-6]。利用粘細(xì)菌作為飼料添加劑，將在防病抗病、提高水產(chǎn)品養(yǎng)殖生產(chǎn)力方面發(fā)揮巨大的潛能，并有利于綠色環(huán)保型水產(chǎn)品的生產(chǎn)[7]。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

橙色粘球菌(Myxococcus fulvus) JCH-04，保藏號(hào)為CGMCC No.2893。

1.2 實(shí)驗(yàn)用病原微生物指示菌株

大腸桿菌(Escherichia coli)，次副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)，霍亂弧菌(Vibri cholera)，嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)，銅綠假單胞菌(Pseudomons aeruginosa)，水生黃桿菌(Flavobacterium aquatile)。

1.3 培養(yǎng)基

CY培養(yǎng)基為：酪素水解蛋白胨3g，酵母膏1g，氯化鈣1g，去離子水定溶至1000mL，pH 7.4；

發(fā)酵培養(yǎng)基為：可溶性淀粉10g ，黃豆粉15g，葡萄糖2.5g，酵母膏0.5g , CaCl21g， MgSO4·7H2O 0.5g，去離子水定溶至1000mL，pH 7.4；

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(MH )：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，去離子水定溶至1000mL，pH 7.2～7.4。

1.4 微生態(tài)制劑的制備

(1) 菌株提取

取一株橙色粘球菌(Myxococcus fulvus) JCH-04，保藏號(hào)為CGMCC No.2893，菌株在CY培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)3天，在發(fā)酵培養(yǎng)基中30℃、180rpm搖瓶培養(yǎng)5天。

(2) 菌株活化

從斜面挑取一環(huán)菌種接種于CY液體培養(yǎng)基中試管30℃培養(yǎng)3天，再將接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基試管中30℃培養(yǎng)3天，接種量為106CFU/mL，反復(fù)3次。

(3) 菌株擴(kuò)培

將步驟(2)的液體菌種接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基三角瓶中30℃、180rpm搖瓶培養(yǎng)5天，接種量為106CFU/mL。

(4) 菌株收集濃縮

在無(wú)菌條件下，將步驟(3)的搖瓶培養(yǎng)菌液用0.2μm微孔濾膜過(guò)濾濃縮成500億CFU/mL菌液，獲得的濃縮菌液為微生態(tài)制劑。

1.5 橙色粘球菌JCH-04對(duì)病原微生物抗菌實(shí)驗(yàn)

將指示菌用無(wú)菌生理鹽水稀釋成不同梯度，測(cè)定OD600并涂平板，確定不同細(xì)菌最適涂布濃度OD600為0.02～0.03 ，將不同指示菌0.2ml 均勻涂于直徑為9cm平板表面，晾干，在平板不同位置等距離放置高溫滅菌的牛津杯，再將培養(yǎng)濃縮得到的橙色粘球菌(Myxococcus fulvus) JCH-04菌液，用無(wú)菌槍頭吸取200μl加于牛津杯，牛津杯直徑5mm ，在37℃下培養(yǎng)16-24 小時(shí)，測(cè)量抑菌圈直徑。培養(yǎng)次副溶血性弧菌MH培養(yǎng)基中加鹽量為3%，培養(yǎng)霍亂弧菌MH培養(yǎng)基中pH為8.8，其它不變，同MH培養(yǎng)基；其它指示菌培養(yǎng)用培養(yǎng)基同MH培養(yǎng)基。

1.6 橙色粘球菌JCH-04安全性試驗(yàn)

將橙色粘球菌(Myxococcus fulvus) JCH-04培養(yǎng)，用生理鹽水調(diào)節(jié)菌液的濃度分別為108、109、1010CFU/mL。試驗(yàn)開始前24h停止投喂，對(duì)草魚(體重20g左右/尾)采用灌服的方法，劑量為

0.5mL/尾，每組魚30尾，以同濃度的嗜水氣單胞菌和生理鹽水做對(duì)照，每組設(shè)6個(gè)重復(fù)，記錄觀察20d累計(jì)死亡情況。

1.7 橙色粘球菌JCH-04在草魚養(yǎng)殖飼料中的應(yīng)用

草魚飼料配方:魚粉12%，花生粕20%，豆粕15%,膨化大豆粉5%，麩皮15%，棉粕11%，次粉8%，維生素預(yù)混料0.6%， 礦物質(zhì)預(yù)混料2%，植物油1.4%。

菌劑加入方法：將魚飼料制成直徑為5mm 的顆粒料，用噴涂機(jī)采用外噴涂方法，等菌液浸入到顆粒料內(nèi)再低溫烘干；魚飼料菌劑加入量為108CFU/g。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表1 JCH-04菌株對(duì)不同細(xì)菌的抑制作用

由表1可見，抑菌圈直徑均大于10mm，說(shuō)明橙色粘球菌(Myxococcus fulvus) JCH-04對(duì)所列6種病原微生物指示菌具有較強(qiáng)的抑菌作用。

2.2 安全性試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明，灌服108、109、1010CFU/mL嗜水氣單胞菌的草魚死亡率分別為89.67%、97.67%、100%，將草魚屠宰取肝和脾臟，做電鏡切片觀察，肝、脾細(xì)胞形態(tài)異常，病變特征明顯。灌服108、109、1010CFU/mL Myxococcus fulvus JCH-04的草魚和空白對(duì)照組在試驗(yàn)期間采食和生長(zhǎng)均正常，無(wú)死亡。將草魚屠宰取肝和脾臟，做電鏡切片觀察，肝、脾細(xì)胞形態(tài)正常，未見病變特征，說(shuō)明Myxococcus fulvus JCH-04菌株對(duì)草魚安全無(wú)毒，可以作為在水產(chǎn)品養(yǎng)殖中具有安全性和潛在應(yīng)用價(jià)值的外源益生菌使用。

2.3 產(chǎn)消化酶能力測(cè)定結(jié)果

分別測(cè)定發(fā)酵液中的淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶活力，平行測(cè)三組，取平均值，測(cè)定結(jié)果如表2所示。

表2 三種消化酶活力測(cè)定

由表2可見，測(cè)定發(fā)酵液中淀粉酶活力為3148.8 U/mL，蛋白酶活力為78.5 U/mL和脂肪酶活力為48.4 U/mL；益生菌能產(chǎn)生胞外酶，分泌到周圍環(huán)境中，尤其是在動(dòng)物的腸道中，往往是益生菌發(fā)揮營(yíng)養(yǎng)作用的原因之一；該菌株可以產(chǎn)生淀粉酶和蛋白酶、脂肪酶，因此，當(dāng)該菌在動(dòng)物的腸道存活時(shí)，就有可能分泌消化酶輔助消化，進(jìn)而提高飼料的消化率。

2.4 在草魚養(yǎng)殖飼料中的應(yīng)用情況

將橙色粘球菌(Myxococcus fulvus) JCH-04制備的微生態(tài)制劑添加到水產(chǎn)飼料中，經(jīng)飼喂實(shí)驗(yàn)證明：飼料轉(zhuǎn)化率達(dá)到1.84%，成活率達(dá)到

96.2%，死亡率減低了27.7%；對(duì)其免疫保護(hù)率也有一定的提高；從生長(zhǎng)性能的指表反映，菌劑的添加可改善草魚生長(zhǎng)性能；同時(shí)對(duì)草魚體內(nèi)消化酶指標(biāo)測(cè)定表明：菌劑的添加可顯著提高淀粉酶活性，對(duì)脂肪酶和蛋白酶活性也有一定提高。

3 討論

飼用微生態(tài)制劑是一種多功能的綠色飼料添加劑，它在促生長(zhǎng)、防病抗病、提高水產(chǎn)品質(zhì)、提高養(yǎng)殖效益、改善環(huán)境等方面具有明顯效果且無(wú)毒副作用，通過(guò)本實(shí)驗(yàn)對(duì)微生態(tài)制劑的作用機(jī)理進(jìn)行系統(tǒng)地研究，將極大地促進(jìn)微生態(tài)制劑的研制、生產(chǎn)與應(yīng)用，其在飼料工業(yè)中有著極為廣泛的用途，并且其新用途還將被不斷發(fā)現(xiàn)和開發(fā)。

近年來(lái)，隨著生物技術(shù)在我國(guó)的發(fā)展，水產(chǎn)養(yǎng)殖用高效飼用微生態(tài)添加劑，以其安全綠色高效、可替代飼用抗生素又無(wú)藥殘、無(wú)副作用，正在飼料工業(yè)中生產(chǎn)規(guī)模逐漸擴(kuò)大，形成產(chǎn)業(yè)，已成為飼用添加劑的一個(gè)發(fā)展方向，它對(duì)我國(guó)抗生素替代產(chǎn)品的大面積推廣應(yīng)用、 提高飼料產(chǎn)品質(zhì)量以及生產(chǎn)無(wú)公害水產(chǎn)類食品，將起到重要作用[8-14]。

將篩選到的一株新的粘細(xì)菌制備成微生態(tài)制劑，并對(duì)其進(jìn)行了抗菌實(shí)驗(yàn)、酶活性測(cè)定、安全性試驗(yàn)和作為草魚飼料添加劑的飼喂實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明該微生態(tài)制劑具有簡(jiǎn)單易制得、安全高效等特點(diǎn)，可以作為在水產(chǎn)品養(yǎng)殖中具有安全性和潛在應(yīng)用價(jià)值的外源益生菌使用。

[1] 李艷利，張蔭雷，劉迎，等.一株新粘細(xì)菌生物學(xué)性質(zhì)的研究[J].微生物學(xué)通報(bào)，2008，35(12)：1888-1891.

[2] 肖蓉，文也，唐少軍，等，土壤樣品中粘細(xì)菌的分離鑒定及其生物活性檢測(cè)[J].微生物學(xué)報(bào)，2014，54(12)：1429-1437.

[3] Gerth K, Pradella S, Perlova O, et al. Myxobacteria: proficient producers of novel natural products with various biological activities-past and future biotechnological aspects with the focus on the genus Sorangium[J].J. Biotechnol,2003(106):233-253.

[4] 何柳興，劉冰花.淡水樣品中粘細(xì)菌的分離·純化及其抗菌抗腫瘤活性研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39(36)：22350-22352.

[5] Juana Diez,Javier P M,Jordi M,et al.Myxobacteria: natural pharmaceutical factories [J].Microbial Cell Factories,2012,11(52): 1-3.

[6] Reichenbach H.Myxobacteria,producers of novel bioactive substances[J].J Ind Microbiol Biotechnol,2001,27(3):149-156.

[7] Mishra B B, Tiwari V K.Natural products：an evolving role in future drug discovery[J].Eur J Med Chem,2011,46(10):4769-4807.

[8] 陳永青，林亮，楊鶯鶯，等，微生態(tài)制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用[J].生態(tài)科學(xué)，2005，24(1)：80-83.

[9] 羅輝，李俊波，劉立鶴，等.3種微生態(tài)制劑對(duì)鯉魚生產(chǎn)性能和體成分的影響[J].水產(chǎn)科學(xué)，2010，29(6):360-362.

[10] 潘雷，郭文，高風(fēng)祥，等.餌料中添加益生菌對(duì)大菱鲆幼魚腸道菌群及部分免疫指標(biāo)的影響[J].海洋科學(xué)，2012，36(2):34-39.

[11] 易力，汪洋.不同益生菌制劑對(duì)鯉魚促生長(zhǎng)作用研究[J].水利漁業(yè)，2006，26(5)：86-87.

[12] 郭凱，趙文.微生態(tài)制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應(yīng)用現(xiàn)狀及發(fā)展方向[J].中國(guó)水產(chǎn)，2008(1)：72-74.

[13] 王蕓，鄭宗林.微生態(tài)制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].飼料與畜牧，2013，27(2)：18-24.

[14] 齊遵利，張秀文，王麗敏.飼用微生態(tài)制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用[J].河北漁業(yè)，2002，12(4)：10-11,22-36.

(責(zé)任編輯：蔣 華)

Preparation and Application of the Microecologics of Myxococcus Fulvus

LIU Xuan-hao, KUAI Jian, FU Li-hua, JIA Jian-bo*

(Faculty of Life Science & Food Engineering,Huaiyin Institute of Technology,Huai'an Jiangsu 223003,China)

The zymotic fluid of Myxococcus fulvus was concentrated by passing through a micropore filter membrane to make microecologics. The results of experiments showed that the microecologics had strong inhibition to the growth of six common pathogenic microbes. Through feeding grass carp with the microecologics, It was found that the Myxococcus fulvus JCH-04 was safe to grass carp. It can also produce many digestive enzymes with high activity, such as amylase, protease and lipase. It indicated that the Myxococcus fulvus could be used as safe exogenous probiotics and have potential application value in aquatic products breeding.

Myxococcus fulvus; microecologics; probiotics

2014-11-29

江蘇省高校科研成果產(chǎn)業(yè)化推進(jìn)工程項(xiàng)目(JHB2012-59)

劉軒豪(1991-)，男，江蘇徐州人，在讀碩士，主要從事生物化工方面的研究；*為通訊作者。

R978

A

1009-7961(2015)05-0004-03