譚曉亮，李瑞海，賈天柱

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側(cè)柏葉炮制前后成分的對(duì)比

譚曉亮1，李瑞海2*，賈天柱2

目的 建立HPLC法測(cè)定側(cè)柏葉及其炮制品中楊梅苷、槲皮苷、楊梅素、槲皮素、山柰酚、穗花杉雙黃酮及扁柏雙黃酮的含量，對(duì)比側(cè)柏葉炮制前后7種成分的含量變化。方法 采用藥典法進(jìn)行炮制。色譜柱為Welch Ultimate LP-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-0.2%磷酸水梯度洗脫，檢測(cè)波長為330 nm，流速1 mL/min。結(jié)果 楊梅苷、槲皮苷、楊梅素、槲皮素、山柰酚、穗花杉雙黃酮及扁柏雙黃酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線呈良好的線性關(guān)系(r≥0.999 5)，各組分平均回收率在97.6%～101.1%之間，RSD≤1.14%(n=6)。炮制后，楊梅苷、槲皮苷、穗花杉雙黃酮及扁柏雙黃酮含量降低，而楊梅素、槲皮素及山柰酚含量相對(duì)升高。結(jié)論 所建立的HPLC法簡(jiǎn)便易行，可用于側(cè)柏葉、側(cè)柏炭的含量測(cè)定。側(cè)柏葉炮制前后成分種類和量的改變，表明其炮制過程存在著成分轉(zhuǎn)化過程。

側(cè)柏葉；側(cè)柏炭；HPLC；楊梅苷；槲皮苷；楊梅素；槲皮素；山柰酚；穗花杉雙黃酮；扁柏雙黃酮

0 引言

側(cè)柏葉為柏科植物側(cè)柏Platycladus orientalis(L.)Franco的干燥枝梢和葉，具有涼血止血、化痰止咳、生發(fā)烏發(fā)的作用。用于吐血、衄血、咯血、便血、崩漏下血、肺熱咳嗽、血熱脫發(fā)、須發(fā)早白[1]。側(cè)柏葉作為治療出血癥之要藥，其炮制方法歷代本草記載有生用或炒用、燒灰存性等，現(xiàn)代生制并用。側(cè)柏葉生品多用于血熱妄行的吐血衄血，咳喘及脫發(fā)；側(cè)柏葉炭則偏于收澀止血，多用于各種出血癥。2010年版《中國藥典》僅對(duì)生品中槲皮苷進(jìn)行含量測(cè)定。近代炮制研究報(bào)道，側(cè)柏葉制炭后槲皮苷部分分解生成槲皮素[2]。本實(shí)驗(yàn)以楊梅苷、槲皮苷、楊梅素、槲皮素、山柰酚、穗花杉雙黃酮和扁柏雙黃酮為指標(biāo)，對(duì)側(cè)柏葉、側(cè)柏炭的含量進(jìn)行測(cè)定，對(duì)比炮制前后成分的變化，為進(jìn)一步的側(cè)柏葉炮制機(jī)理的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)[3-5]。

1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料

P230II UV230II紫外檢測(cè)器，EC2006-色譜數(shù)據(jù)處理工作站(大連依利特)；KQ3200超聲波清洗器(江蘇昆山)，十萬分之一電子天平(德國賽多利斯)。槲皮苷(批號(hào):111538-200504)、槲皮素(批號(hào):10081-00901)(中國藥品生物制品檢定所)、楊梅苷(批號(hào):20130528)、楊梅素(批號(hào):20130619)、山柰酚(批號(hào):20130623)、穗花杉雙黃酮(批號(hào):20130713)、扁柏雙黃酮(批號(hào):20140112)(大連美侖生物技術(shù)有限公司，純度>99%)；水為重蒸餾水，甲醇為色譜純；其他試劑為分析純。不同產(chǎn)地側(cè)柏葉、側(cè)柏炭藥材經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)尹海波教授鑒定均為柏科植物側(cè)柏Platycladus orientalis(L.)Franco的干燥枝梢和葉，具體來源見表1。

表1 側(cè)柏葉來源

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱定對(duì)照品適量，加甲醇制成楊梅苷0.032 mg/mL、槲皮苷0.051 mg/mL、楊梅素0.006 1 mg/mL、槲皮素0.008 2 mg/mL、山柰酚0.007 1 mg/mL、穗花杉雙黃酮0.065 mg/mL、扁柏雙黃酮0.047 mg/mL的混合對(duì)照品溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備 取樣品粉末約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2 色譜條件 色譜柱為Welch Ultimate LP-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相按表2進(jìn)行設(shè)定；檢測(cè)波長為330 nm；流速為1 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量為20 μL。

表2 流動(dòng)相梯度表

2.3 專屬性實(shí)驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液各20 μL，在上述選定的色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果7種對(duì)照品的分離度良好，且與供試品中的其他成分不干擾。色譜圖見圖1。

圖1 側(cè)柏葉和側(cè)柏炭的HPLC圖

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密吸取7種混合對(duì)照品溶液各1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mL，分別以甲醇溶解并定容于10 mL量瓶中，按“2.2”項(xiàng)下的色譜條件，注入液相色譜儀器中，測(cè)定色譜峰面積，以對(duì)照品進(jìn)樣量X(μg)為橫坐標(biāo)、峰面積值為縱坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程與線性范圍見表3。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品20 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，結(jié)果7種對(duì)照品的峰面積RSD值見表4，說明本實(shí)驗(yàn)精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一樣品6份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行HPLC測(cè)定，結(jié)果7種對(duì)照品的峰面積RSD值見表4，說明方法重現(xiàn)性良好。

表3 7個(gè)黃酮類化合物的回歸方程

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件，于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果7種對(duì)照品的峰面積RSD值見表4，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的樣品粉末6份，每份0.2 g，精密稱定，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入對(duì)照品溶液楊梅苷0.032 mg/mL、槲皮苷0.051 mg/mL、楊梅素0.006 1 mg/mL、槲皮素0.008 2 mg/mL、山柰酚0.007 1 mg/mL、穗花杉雙黃酮0.065 mg/mL、扁柏雙黃酮0.047 mg/mL各1 mL，按“2.1.2”項(xiàng)下進(jìn)行制備，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行HPLC測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表4。

表4 方法學(xué)考察試驗(yàn)結(jié)果

2.9 側(cè)柏葉炮制品制備及樣品測(cè)定結(jié)果

2.9.1 側(cè)柏炭 取凈側(cè)柏葉，照炒炭法[1](附錄ⅡD)炒至表面黑褐色，內(nèi)部焦黃色。本品形如側(cè)柏葉，表面黑褐色。質(zhì)脆，易折斷，斷面焦黃色。氣香，味微苦澀。

2.9.2 側(cè)柏葉炒黃炒焦 取凈側(cè)柏葉，照炒法[1](附錄ⅡD)，其中炒黃品，取凈側(cè)柏葉，用文火炒至表面顏色加深，有香味。炒焦品，取凈側(cè)柏葉，用文火炒至表面有焦斑，起鍋放涼。

2.9.3 側(cè)柏葉及炮制品中7種對(duì)照品含量 取樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別吸取各供試品溶液20 μL，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄各供試品7種的對(duì)照品的色譜圖，采用外標(biāo)一點(diǎn)法，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程進(jìn)行含量計(jì)算，結(jié)果見表5。

表5 側(cè)柏葉、側(cè)柏炭中7種對(duì)照品的含量(mg/g)

3 討論

3.1 預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示，在330 nm處所示色譜峰數(shù)目較多，分離較好，基線較平穩(wěn)，因此選用330 nm為檢測(cè)波長。本實(shí)驗(yàn)所建立的方法簡(jiǎn)便易行，精密度、回收率、重現(xiàn)性均符合要求。由于目前普遍認(rèn)為中藥是以多組分協(xié)同而起效，因此，本研究所建立的多個(gè)指標(biāo)的含量測(cè)定方法，為制定側(cè)柏葉質(zhì)量控制方法提供了依據(jù)[6]。

3.2 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，側(cè)柏葉中檢出楊梅苷、槲皮苷、楊梅素、穗花杉雙黃酮及扁柏雙黃酮成分，但檢不出槲皮素、山柰酚成分，側(cè)柏葉經(jīng)過炮制后，炒焦、炒炭品中均可檢出7種成分，特別是在側(cè)柏炭中變化最為明顯，其楊梅苷、槲皮苷、穗花杉雙黃酮和扁柏雙黃酮成分含量均下降，穗花杉雙黃酮和扁柏雙黃酮成分含量下降顯著，而楊梅素、槲皮素、山柰酚成分含量上升顯著，提示側(cè)柏葉在炮制過程中出現(xiàn)了成分轉(zhuǎn)化的過程，其機(jī)制有待于進(jìn)一步的研究[7]。

3.3 目前側(cè)柏葉的成分研究多見于生品或者炮制品單獨(dú)研究等，本實(shí)驗(yàn)把生品和炮制品結(jié)合起來同時(shí)測(cè)定相關(guān)成分，對(duì)于側(cè)柏葉炮制過程的機(jī)

理研究，有非常重要的作用。同時(shí)，目前文獻(xiàn)報(bào)道的側(cè)柏葉指標(biāo)性成分，以楊梅苷、槲皮苷等5種成分為多，本實(shí)驗(yàn)條件確定了側(cè)柏葉中還含有穗花杉雙黃酮、扁柏雙黃酮成分，建立同時(shí)測(cè)定7種成分的HPLC條件，并對(duì)比了炮制前后成分的變化，為側(cè)柏葉炮制機(jī)理的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)[8-10]。

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Comparison of components before and after processing ofCacumenPlatycladi

TAN Xiao-liang1,LI Rui-hai2*,JIA Tian-zhu2

(1.Shenyang Traditional Chinese Medicine,Shenyang 100020,China;2.China College of Pharmacy,Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Dalian 116600,China)

Objective To establish an HPLC method with myricetrin,quercitrin,myricetin,quercetin,kaempferol,amentoflavone and hinokiflavone as reference subatances inCacumenPlatycladiand processedCacumenPlatycladi,and compare the components before and after processing ofCacumenPlatycladi.Methods Pharmacopoeia method was used in processing.The chromatographic column was Welch Ultimate LP-C18(4.6 mm×250 mm，5μm),gradient mobile phase were methanol-0.2% phosphoric acid,the detection wavelength was 330 nm,flow rate was 1 mL/min.Results The linear relationship of myricetrin,quercitrin,myricetin,quercetin,kaempferol,amentoflavone and hinokiflavone had good linearity (r≥0.999 5).The average recovery rate was 97.6%～101.1%,withRSD≤1.14% (n=6).The content of myricetrin,quercitrin,amentoflavone and hinokiflavone inCacumenPlatycladiwas declined after processing,and the content of the quercetinand and kaempferol increased.Conclusion The method can be used for determination of the content of theCacumenPlatycladiand processedCacumenPlatycladi.The results of the content shows that the flavone inCacumenPlatycladichanged by processing.

CacumenPlatycladi;Cacumen Platycladi Carbonisatum;HPLC;Myricetrin;Quercitrin;Myricetin;Quercetin;Kaempferol;Amentoflavone;Hinokiflavone

2015-03-04

1.沈陽市中醫(yī)院，沈陽 100020；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，大連 116600

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201511023