成人股骨頭缺血性壞死中轉(zhuǎn)化生長因子與血管內(nèi)皮因子的表達研究

何志明

臨床醫(yī)學

成人股骨頭缺血性壞死中轉(zhuǎn)化生長因子與血管內(nèi)皮因子的表達研究

何志明

目的通過對壞死股骨頭進行轉(zhuǎn)化生長因子及血管內(nèi)皮因子的檢驗, 更深入地掌握股骨頭缺血性壞死的發(fā)生進展規(guī)律, 更深入地探討股骨頭缺血性壞死的分子生物學基礎。方法采集30例髖關(guān)節(jié)置換手術(shù)患者的股骨頭作為標本,15例股骨頭缺血性壞死的病例作為試驗組,15例股骨頸囊內(nèi)骨折的病例作為對照組。將標本送實驗室行免疫組織化學技術(shù)檢驗, 即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理,通過化學反應使標記抗體的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色來確定組織細胞內(nèi)抗原(多肽和蛋白質(zhì)), 對其進行定位、定性及定量的研究。結(jié)果對照組壞死區(qū)及其周圍區(qū)域均有轉(zhuǎn)化生長因子與血管內(nèi)皮因子的陽性表達, 本實驗中股骨頭缺血性壞死區(qū)表達最少, 對照組表達居中, 股骨頭缺血性壞死周圍區(qū)表達最多。結(jié)論①轉(zhuǎn)化生長因子及血管內(nèi)皮因子在股骨頭缺血性壞死周圍區(qū)的表達明顯增強, 說明股骨頭缺血性壞死周圍區(qū)局部有良好的修復力, 在股骨頭缺血性壞死病理形成中起著非常重要的作用, 與新骨的形成以及肉芽組織與纖維組織大量增生有關(guān)。②轉(zhuǎn)化生長因子及血管內(nèi)皮因子在股骨頭缺血性壞死區(qū)表達不足, 與壞死骨修復的失敗有非常密切的關(guān)系, 說明該區(qū)缺少修復活動能力。

股骨頭缺血性壞死；轉(zhuǎn)化生長因子；血管內(nèi)皮因子；免疫組織化學技術(shù)；組織病理學

轉(zhuǎn)化生長因子屬于一個超級家族的相關(guān)蛋白成員, 轉(zhuǎn)化生長因子在骨組織、血小板、軟骨中含量豐富。骨的形成、生長、壞死后的修復均與轉(zhuǎn)化生長因子有著密切關(guān)系[1]。轉(zhuǎn)化生長因子在骨痂形成與塑形中起著重要作用[2]。骨母細胞和軟骨細胞富含轉(zhuǎn)化生長因子受體, 轉(zhuǎn)化生長因子已被證實能夠刺激軟骨內(nèi)化骨。各種基礎研究證實[3], 轉(zhuǎn)化生長因子在不同的效應細胞中也表現(xiàn)出不同效應, 具有雙向調(diào)節(jié)性。在發(fā)生組織損傷后轉(zhuǎn)化生長因子在修復進程中起著非常重要的作用。如果轉(zhuǎn)化生長因子過量表達就會出現(xiàn)肉芽組織過度增生甚至慢性纖維化。血管內(nèi)皮因子與多種組織器官肉芽組織過度增生、纖維化也有密切的關(guān)系。目前關(guān)于成人股骨頭缺血性壞死轉(zhuǎn)化生長因子或血管內(nèi)皮因子方面的研究報道還很少[4]。通過對壞死股骨頭進行轉(zhuǎn)化生長因子及血管內(nèi)皮因子的檢驗, 可以更準確地認識股骨頭發(fā)生缺血性壞死的發(fā)展規(guī)律, 對于進一步深入探討股骨頭發(fā)生缺血性壞死的分子生物學基礎是有益的, 也能夠為臨床進行股骨頭缺血性壞死的治療提供一定的方向[5]。

1 資料與方法

1.1 一般資料 實驗用的股骨頭標本都是來自佛山市三水區(qū)人民醫(yī)院骨科行髖關(guān)節(jié)置換手術(shù)患者, 共30例, 其中女12例, 男18例, 實驗室檢查類風濕因子陰性, 抗O抗體＜500單位, 血常規(guī)及血沉都正常。15例股骨頭缺血性壞死者作為試驗組,15例股骨頸囊內(nèi)骨折者作為對照組, 試驗組中女9例, 男6例, 年齡25～60歲, 平均年齡48.2歲, 主要表現(xiàn)為：患側(cè)髖部疼痛(可有靜息痛), 活動后加劇, 患者髖關(guān)節(jié)活動受限, X光影像學表現(xiàn)為股骨頭發(fā)生扁平甚至塌陷。對照組中女3例, 男12例, 年齡59～98歲, 平均年齡68.5歲, 來源為因外傷行髖關(guān)節(jié)置換的手術(shù)者, 手術(shù)均在7 d內(nèi)完成, 受傷前無髖關(guān)節(jié)疼痛、活動受限等癥狀, 檢查未發(fā)現(xiàn)股骨頭缺血性壞死的醫(yī)學證據(jù)。

1.2 主要儀器與試劑 低溫超速離心機, 烤箱, 自動照相顯微鏡, 低溫冰箱, 轉(zhuǎn)化生長因子及血管內(nèi)皮因子免疫組織化學技術(shù)試劑盒, 烘片機, 恒低溫冰凍切片機, 全自動組織脫水機, 攤片機, 超低溫冰箱。

1.3 方法 試驗組標本是手術(shù)病例切除的股骨頭, 在切出時立即選取5 mm×5 mm大小的壞死中心骨組織和壞死周邊骨組織各1塊, 吸干血跡, 馬上浸入濃度為4％的福爾馬林液中, 保存在4℃冰箱內(nèi)。標本經(jīng)濃度為4％福爾馬林液固定。對照組則取相應部位骨組織。用上述方法制作5 μg冰凍切片,做免疫組織化學技術(shù)染色。免疫組織化學技術(shù)是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理, 通過化學反應使標記抗體的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色來確定組織細胞內(nèi)抗原(多肽和蛋白質(zhì)), 對其進行定位、定性及定量的研究。

1.4 操作流程 ①脫鈣, 標本脫水；②透明；③浸蠟, 包埋；④切片；⑤烤箱加熱；⑥免疫組織化學技術(shù)染色；⑦滅活內(nèi)源性酶；⑧加滴封閉；⑨稀釋；⑩滴加生物素化；?滴加試劑SABC；?顯色；?復染；?脫水；?二甲苯洗滌；?樹膠封片；?微鏡鏡檢。

1.5 免疫組織化學技術(shù)染色結(jié)果觀察 positive reaction呈淺黃色至深棕黃色顆粒狀, 無positive reaction為陰性(-)。淺黃色(+), 黃色(++), 深黃色(+++)。為評估轉(zhuǎn)化生長因子與血管內(nèi)皮因子免疫染色細胞的數(shù)量, 在呈positive reaction病例中,每例隨機進行鏡下檢查10個不同視野累計200個細胞計數(shù)相應免疫染色的百分率[6]。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行分析處理。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示, 采用t檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)化生長因子在試驗組股骨頭缺血性壞死區(qū)較低, 與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05), 血管內(nèi)皮因子在試驗組股骨頭缺血性壞死區(qū)較低, 與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表1。

表1 轉(zhuǎn)化生長因子與血管內(nèi)皮因子在試驗組壞死區(qū)與對照組的表達情況(±s)

表1 轉(zhuǎn)化生長因子與血管內(nèi)皮因子在試驗組壞死區(qū)與對照組的表達情況(±s)

注：與對照組比較,aP＜0.05

組別 例數(shù) 轉(zhuǎn)化生長因子 血管內(nèi)皮因子試驗組(壞死區(qū)) 15 12.89±4.01a 11.29±1.56a對照組 15 18.56±3.25 16.78±1.42

2.2 轉(zhuǎn)化生長因子在試驗組股骨頭缺血性壞死周圍區(qū)較高,與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05), 血管內(nèi)皮因子在試驗組股骨頭缺血性壞死周圍區(qū)亦較高, 與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表2。

表2 轉(zhuǎn)化生長因子與血管內(nèi)皮因子在試驗組壞死周圍區(qū)與對照組的表達情況(±s)

表2 轉(zhuǎn)化生長因子與血管內(nèi)皮因子在試驗組壞死周圍區(qū)與對照組的表達情況(±s)

注：與對照組比較,aP＜0.05

組別 例數(shù) 轉(zhuǎn)化生長因子 血管內(nèi)皮因子試驗組(周圍區(qū)) 15 26.89±2.23a 38.29±3.15a對照組 15 18.56±3.25 16.78±1.42

2.3 轉(zhuǎn)化生長因子在試驗組股骨頭缺血性壞死周圍區(qū)較高,與壞死區(qū)比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05), 血管內(nèi)皮因子在試驗組股骨頭缺血性壞死周圍區(qū)較高, 與壞死區(qū)比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表3。

表3 轉(zhuǎn)化生長因子與血管內(nèi)皮因子在試驗組病理壞死區(qū)與病理周圍區(qū)表達情況(±s)

表3 轉(zhuǎn)化生長因子與血管內(nèi)皮因子在試驗組病理壞死區(qū)與病理周圍區(qū)表達情況(±s)

注：與病理壞死區(qū)比較,aP＜0.05

分區(qū) 例數(shù) 轉(zhuǎn)化生長因子 血管內(nèi)皮因子病理壞死區(qū) 15 12.89±4.01 11.29±1.56病理周圍區(qū) 15 26.89±2.23a 38.29±3.15a

3 討論

股骨頭缺血性壞死在缺血壞死的早期, 還沒有發(fā)生明顯影像學改變時, 已有骨損傷(鏡下骨折等), 因此, 局部的分子必然會啟動一個骨折修復程序, 但是如何啟動并不清楚。實驗表明在周圍區(qū)轉(zhuǎn)化生長因子與血管內(nèi)皮因子為高表達,而在壞死區(qū)則為低表達, 增加轉(zhuǎn)化生長因子與血管內(nèi)皮因子的表達應該能促進修復的進度[7]。假設股骨頭缺血性壞死在缺血壞死早期進行人為的干預, 增加轉(zhuǎn)化生長因子與血管內(nèi)皮因子的表達, 促進修復進度, 使修復快于壞死, 也許能夠治愈股骨頭缺血性壞死。目前已有大量的轉(zhuǎn)化生長因子與血管內(nèi)皮因子針對如何進行組織的修復和組織的纖維化相關(guān)性治療嘗試, 對于股骨頭缺血性壞死的防治有很好的啟迪作用[8], 本課題有關(guān)的分子生物學研究結(jié)果, 不僅對以后繼續(xù)深入探討打下基礎, 也為針對股骨頭缺血性壞死治療的分子介入治療提出了另一個問題：如何防止轉(zhuǎn)化生長因子與血管內(nèi)皮因子的過度表達造成大量纖維組織與肉芽組織增生乃至瘢痕化從而導致新骨形成障礙的不良后果。

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10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.07.012

2014-12-12]

廣東省佛山市醫(yī)學科研立項(項目編號：2013448)

528100 廣東省佛山市三水區(qū)人民醫(yī)院