王金鳳 李才文 李 蒙 宋書群

(1. 中國科學(xué)院海洋研究所海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點實驗室 青島 266071; 2. 中國科學(xué)院大學(xué) 北京 100049)

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus),俗稱梭子蟹,屬于甲殼綱,十足目,梭子蟹科。因其養(yǎng)殖周期相對較短、食用價值高、養(yǎng)殖利潤豐厚等優(yōu)勢,自1981年被列為海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖對象,已經(jīng)成為我國沿海地區(qū)重要的養(yǎng)殖品種(孫穎民等,1984)。2012年,我國三疣梭子蟹的養(yǎng)殖面積達(dá)到29036公頃,年產(chǎn)量約為 99580噸; 山東半島梭子蟹的養(yǎng)殖面積約 9000公頃,占全國養(yǎng)殖規(guī)模的 31%左右(中國農(nóng)業(yè)部漁業(yè)局,2013)。然而,隨著三疣梭子蟹養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大,生產(chǎn)中養(yǎng)殖條件相對落后、養(yǎng)殖技術(shù)及疾病防控技術(shù)還不完善等問題日益顯現(xiàn)。近年來病害問題,特別是“牛奶病”、“牙膏病”、“黃水病”等新近出現(xiàn)的流行性疾病,對三疣梭子蟹的人工養(yǎng)殖造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失(許文軍等,2007a,c; 劉淇等,2007; 施慧等,2008)。

血卵渦鞭蟲(Hematodiniumspp.)是一類感染海水甲殼類的寄生性甲藻(parasitic dinoflagellates),隸屬于甲藻門(Sarcomastigophora),寄生藻目(Syndinida),寄生藻科(Syndiniceae),血卵渦鞭蟲屬(Hematodinium)(Stentifordet al,2005; 李才文等,2014)。該寄生性病原先后在多個國家和地區(qū)的野生甲殼動物群體中大范圍流行,嚴(yán)重影響了挪威龍蝦(Nephrops norvegicus)、美國蘭蟹(Callinectes sapidus)、蛛雪蟹(Chionoecetes opilio)、白氏雪蟹(C. bairdi)等多種重要經(jīng)濟(jì)甲殼類的漁業(yè)生產(chǎn)(Stentifordet al,2005)。近年來,血卵渦鞭蟲(Hematodiniumsp.)先后在我國浙江舟山、廣東汕頭和山東半島海域的主要經(jīng)濟(jì)甲殼類中發(fā)現(xiàn)和報道,并已確定該寄生性病原是近年來導(dǎo)致養(yǎng)殖三疣梭子蟹和汕頭牛田洋養(yǎng)殖青蟹“牛奶病”主要病原之一(許文軍等,2007b; Liet al,2008; 許文軍等,2010; Liet al,2013)。

目前國內(nèi)對于血卵渦鞭蟲的相關(guān)研究較少,且主要集中于實地調(diào)查、病原確定、診斷技術(shù)等,尚缺乏血卵渦鞭蟲的致病機制、生活史特征、病原-宿主相互作用及傳播擴(kuò)散機制等方面的研究,這些基礎(chǔ)研究的缺失制約了在實際漁業(yè)生產(chǎn)中針對該寄生性病原的預(yù)防和控制。因此,本文對于自然感染和人工感染血卵渦鞭蟲的養(yǎng)殖三疣梭子蟹的病原形態(tài)學(xué)和宿主組織病理變化進(jìn)行了系統(tǒng)研究,以期更深入理解該寄生性病原的致病機理和染病宿主的發(fā)病機制,為在實際漁業(yè)生產(chǎn)中預(yù)防和控制血卵渦鞭蟲流行病的發(fā)生提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

本實驗所用三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)(以下簡稱梭子蟹)于2013年9月至11月間采自青島市黃島區(qū)大場鎮(zhèn)水產(chǎn)養(yǎng)殖基地的梭子蟹養(yǎng)殖池塘[鹽度(28±1),溫度(26±2)°C]中,樣品置于泡沫塑料箱中,保持濕潤并低溫充氧,迅速運回實驗室進(jìn)行進(jìn)一步研究。

1.2 病原檢測

根據(jù) Stentiford等(2005)的血涂片法對三疣梭子蟹是否感染血卵渦鞭蟲(Hematodiniumsp.)進(jìn)行初步檢測。具體步驟如下: 用75%酒精對梭子蟹游泳足基部擦拭消毒,用 1mL無菌注射器于其關(guān)節(jié)膜處抽取約200μL血淋巴,滴1—2滴于載玻片上,混合大致等量的中性紅溶液(中性紅 : PBS = 0.02%W/V),制作血涂片,在顯微鏡(Olympus BX53)下進(jìn)行觀察并拍照記錄。剩余血淋巴加入到盛有 800μL無水乙醇的1.5mL離心管中固定,于–20°C 下冷凍保存以用于DNA提取,并經(jīng)特異性分子生物學(xué)檢測(Smallet al,2007)最終確定其感染狀態(tài)。具體方法如下: 將用無水乙醇固定保存的梭子蟹血淋巴樣品,按TIANGEN試劑盒說明書提取基因組總DNA用于PCR反應(yīng); 反應(yīng)體系總體積為20μL,分別包括超純水7.6μL,引物(正向HITS1F 5'-CATTCACCGTGAACCTTAGCC-3'; 反向HITS1R 5'-CTAGTCATACGTTTGAA GAAAGCC-3')各 1.2μL,DNA 模板 1.2μL,PCR mix (1mmol/L KCl,0.2mmol/L Tris-HCl,0.03mmol/L MgCl2,4μm dNTPs,1U Taq DNA聚合酶)10μL; PCR反應(yīng)條件為: 94°C預(yù)變性 5min,94°C 變性 30s,56°C 退火 30s,72°C 延伸30s; 共30個循環(huán),最后72°C延伸10min,4°C保存。取 3μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行 1.5%的瓊脂糖凝膠電泳,于紫外光照條件下觀察特征條帶(約300bp)(如圖1所示)存在與否以辨別梭子蟹是否感染血卵渦鞭蟲。經(jīng)檢測確定感染狀態(tài)的梭子蟹個體分別暫養(yǎng)于實驗室的循環(huán)水系統(tǒng)中,待進(jìn)行下一步研究。本文參照Appleton 等(1998)對于感染程度的定義,將感染的第I階段劃分為感染早期,第II和第III階段劃分為感染中期,第IV階段劃分為感染晚期。

圖1 寄生蟲甲藻血卵渦鞭蟲的特異性PCR檢測結(jié)果Fig.1 Diagnosis of the parasitic dinoflagellate Hematodinium sp. using a specific PCR assayM: DNA標(biāo)記; 1—3: 健康蟹; 4—6: 病蟹

1.3 感染實驗

共 44只經(jīng)血淋巴檢測和 PCR檢測(方法見 1.2)診斷沒有血卵渦鞭蟲感染的梭子蟹暫養(yǎng)在兩個配有生物濾器和紫外消毒裝置的 300L玻璃缸中[鹽度(28±1),溫度(26±2)°C],用于人工感染實驗。從感染血卵渦鞭蟲的梭子蟹中抽取血淋巴,通過顯微計數(shù),估算血淋巴中血卵渦鞭蟲細(xì)胞濃度,并用 PBS緩沖液稀釋終濃度至約 106cells/mL作為注射液; 將受試梭子蟹第五步足和蟹體軟組織結(jié)合處用酒精(75%)擦拭干凈,小心注入 100μL注射液(大約 105個病原細(xì)胞)。實驗期間(共20天),每天定時投喂蛤蜊肉一次,并觀測評估已進(jìn)行人工注射侵染梭子蟹的生活狀況,及時取出瀕死實驗蟹進(jìn)行組織病理樣品采集(詳細(xì)步驟見1.4)。注射感染后第20天,存活的實驗梭子蟹經(jīng)解剖、取樣處理后用于組織病理學(xué)診斷(見1.4)。

1.4 病理組織樣品制備及觀察

相關(guān)研究表明,血卵渦鞭蟲對甲殼類動物的肝胰腺、心臟、鰓和步足肌肉等組織器官造成明顯的影響或病變(Stentifordet al,2000,2005; Wheeleret al,2007)。因此,本實驗中選取經(jīng)檢測確定已感染血卵渦鞭蟲的注射感染的三疣梭子蟹進(jìn)行解剖,取肝胰腺、心臟、鰓絲和步足肌肉等組織塊于10%海水福爾馬林固定,48h后轉(zhuǎn)移到75%酒精中長期保存或進(jìn)行下一步處理; 參考 Wheeler等(2007)的樣品處理和石蠟切片技術(shù)處理固定樣品,而后經(jīng)系列脫水后進(jìn)行H & E(hematoxylin and eosin)染色,切片經(jīng)蓋片、封片后于顯微鏡(Olympus BX53)下觀察實驗三疣梭子蟹組織病理變化并拍攝數(shù)碼照片,記錄保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品感染率和感染程度

取樣期間共采集了170只梭子蟹,其中 25只梭子蟹經(jīng)檢測確定感染血卵渦鞭蟲,感染率為14.7 %。其中13只處于感染早期,3只處于感染中期,9只處于感染晚期。

人工侵染實驗的44只梭子蟹,除實驗前5天死亡的 5只梭子蟹(可能由于人為操作導(dǎo)致機械損傷或偶發(fā)細(xì)菌感染死亡)未進(jìn)行檢測之外,其余39只經(jīng)檢測均感染血卵渦鞭蟲,可見隨著時間推移,感染程度逐漸加重(具體見表1),其中7只處于感染早期,8只處于感染中期,24只處于感染晚期,感染率≥88.6%(表 2)。

2.2 血淋巴中寄生蟲形態(tài)學(xué)檢測

感染血卵渦鞭蟲的病蟹血淋巴由具有很強凝聚能力的青藍(lán)色透明血液轉(zhuǎn)變?yōu)榘诐崤Ｄ虪罨螯S水狀喪失凝聚能力的液體,因此也被稱為“牛奶病”或“黃水病”(許文軍等,2007c)。顯微鏡檢法可觀察到在感染早期病蟹的血淋巴中仍有大量的顆粒細(xì)胞、半顆粒細(xì)胞、血細(xì)胞等淋巴細(xì)胞,其中夾雜著少量的卵圓形或絲狀的血卵渦鞭蟲滋養(yǎng)體結(jié)構(gòu)(圖2a); 感染中期病蟹的血液中淋巴細(xì)胞數(shù)量急劇減少,而被大量的卵圓形的滋養(yǎng)體結(jié)構(gòu)(圖2b)或團(tuán)聚體結(jié)構(gòu)(圖2e)的血卵渦鞭蟲所占據(jù),其中常見到雙核、三核以及多核的滋養(yǎng)體結(jié)構(gòu)(圖2c、d); 感染晚期病蟹血淋巴中細(xì)胞完全被血卵渦鞭蟲的孢子前細(xì)胞及孢子所取代(圖2f)。

2.3 寄生蟲組織病理學(xué)形態(tài)

組織病理學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)血卵渦鞭蟲在宿主的肝胰腺、心臟、肌肉、鰓等器官和組織中均存在不同程度的感染,寄生蟲在各器官或組織中的存在形態(tài)和數(shù)量也有一定的差異。在輕度感染個體中,肝胰腺和心臟中能夠發(fā)現(xiàn)血卵渦鞭蟲的侵入和存在,但數(shù)量較少,多數(shù)為滋養(yǎng)體結(jié)構(gòu)(圖 2a); 而宿主肌肉、胃等組織則鮮有病原蟲的存在,組織病理變化不明顯。在感染中后期個體中,肝胰腺、心臟、鰓、肌肉、胃等組織中均能明顯發(fā)現(xiàn)病原蟲的侵入,心臟、肝胰腺病理變化尤為明顯,心臟中常見血卵渦鞭蟲蛛網(wǎng)狀的滋養(yǎng)體結(jié)構(gòu)(圖3d)和團(tuán)聚體結(jié)構(gòu)(圖3c)。

表1 人工侵染實驗中三疣梭子蟹死亡數(shù)量及血卵渦鞭蟲感染程度Tab.1 The mortality of P. trituberculatus and degree of Hematodinium infection in experimental infection trial

表2 實地取樣和人工侵染實驗中三疣梭子蟹血卵渦鞭蟲感染程度及感染率Tab.2 The intensity and prevalence of Hematodinium sp. infection in P. trituberculatus in the field and in the experimental infection trial

圖2 三疣梭子蟹血淋巴中血卵渦鞭蟲生活史形態(tài)Fig.2 Representative life stages of Hematodinium sp. found in the hemopymph of the swimming crab P. trituberculatusa. 絲狀滋養(yǎng)體(箭頭); b. 變形蟲狀滋養(yǎng)體; c. 單核、雙核、多核滋養(yǎng)體(箭頭); d. 多核滋養(yǎng)體(箭頭); e. 團(tuán)聚體(箭頭); f. 孢子前細(xì)胞

圖3 三疣梭子蟹心臟中血卵渦鞭蟲形態(tài)Fig. 3 Representative life stages of Hematodinium sp. found in the heart tissue of the swimming crab P. trituberculatusa. 絲狀滋養(yǎng)體(箭頭); b. 多核滋養(yǎng)體(箭頭); c. 團(tuán)聚體(箭頭); d. 蛛網(wǎng)狀營養(yǎng)體(箭頭)

2.4 宿主主要器官和組織病理學(xué)變化

2.4.1 感染早期 肝胰腺: 健康蟹的肝胰腺組織中肝小管排列緊密,肝小管間由疏松的結(jié)締組織和血竇(hemal sinus)結(jié)構(gòu)相連,肝小管(hepatopancreatic tubule)管腔較小。感染早期,組織切片顯示可觀察到完整的肝小管結(jié)構(gòu),肝小管上皮細(xì)胞細(xì)胞核清晰可見; 但隨著血卵渦鞭蟲的浸入,肝小管間隙距離擴(kuò)大、管間結(jié)締組織破損缺失,血竇結(jié)構(gòu)受損、總血細(xì)胞數(shù)量減少,顆粒細(xì)胞數(shù)量相對增加且偶有聚集; 部分肝小管纖毛柱狀上皮組織損壞,有些上皮細(xì)胞核溶解變性,但仍有較明顯的界限(圖4a)。

心臟: 健康蟹心臟結(jié)構(gòu)外層由結(jié)締組織包裹,肌纖維間有結(jié)締組織緊密相連,肌絲纖維呈現(xiàn)明顯的帶狀結(jié)構(gòu)。感染早期,少量血卵渦鞭蟲侵入到心肌纖維間隙,導(dǎo)致肌絲間距擴(kuò)大、部分肌絲纖維溶解性變性,但并未進(jìn)入心肌纖維細(xì)胞內(nèi)部,大部分肌絲纖維結(jié)構(gòu)完整仍呈現(xiàn)明顯的帶狀結(jié)構(gòu); 心肌間隙的血竇內(nèi)血細(xì)胞數(shù)量明顯下降,取而代之的是血卵渦鞭蟲蟲體; 心肌外圍以及外層心肌纖維間的結(jié)締組織有零散破損或缺失(圖4b)。

鰓: 蟹類鰓為葉鰓型鰓,鰓葉由鰓絲(gill lamellaes)和鰓小片(tip of gill lamellaes)構(gòu)成(李太武等,1995)。組織病理觀察顯示,輕度感染個體,鰓絲結(jié)構(gòu)完整,鰓絲內(nèi)可見由柱細(xì)胞特化形成的鰓小隔結(jié)構(gòu)以及流動在其中的血細(xì)胞; 鰓絲的中央血竇中并未發(fā)現(xiàn)血卵渦鞭蟲的存在,然而鰓絲間隙卻分布著少量的血卵渦鞭蟲蟲體(圖4c)。

步足肌肉: 三疣梭子蟹步足肌屬橫紋肌,健康個體肌肉纖維排列緊密,呈現(xiàn)明顯的帶狀結(jié)構(gòu)(王國良等,2006)。感染早期個體,步足肌病理變化不明顯,少數(shù)樣品可見有極少量血卵渦鞭蟲侵入,局部肌纖維出現(xiàn)斷裂、分離,大部分樣品步足肌肉仍呈現(xiàn)正常的帶狀結(jié)構(gòu)(圖4d)。

2.4.2 感染中期 肝胰腺: 感染中期,大量血卵渦鞭蟲進(jìn)入肝小管間隙,肝小管間隙明顯增大,結(jié)締組織幾乎完全缺失; 血細(xì)胞數(shù)量明顯減少,顆粒細(xì)胞明顯增多并聚集,未發(fā)現(xiàn)固定吞噬細(xì)胞(fixed phagocytes)的存在; 肝小管管腔進(jìn)一步擴(kuò)大,仍未發(fā)現(xiàn)血卵渦鞭蟲侵入,然而肝小管纖毛柱狀上皮結(jié)構(gòu)明顯溶解變性并呈空泡狀(圖5a)。

圖4 感染早期,血卵渦鞭蟲病蟹組織病理變化Fig.4 Histopathological changes in the tissues of P. trituberculatus in early Hematodinium infectionC: 表皮組織; H: 血卵渦鞭蟲; HC: 鰓絲管腔; HM: 心肌; HPT: 肝小管; HS: 血竇; L: 肝小管管腔; M: 肌肉; Tr: 鰓小隔細(xì)胞。a. 感染早期,肝小管結(jié)構(gòu)(HPT)清晰可見但上皮組織破損,管腔(L)增大,管間疏松結(jié)締組織受損,血卵渦鞭蟲分布其中; b. 心肌纖維帶狀結(jié)構(gòu)明顯,血細(xì)胞數(shù)量較少,肌束間有血卵渦鞭蟲分布; c. 鰓絲結(jié)構(gòu)完整,鰓小隔可見,鰓絲管腔中血細(xì)胞數(shù)量較少,鰓絲上皮組織變薄,鰓絲間現(xiàn)少量血卵渦鞭蟲; d. 肌肉組織變化不明顯可見清晰帶狀結(jié)構(gòu)

心肌: 感染中期,大量血卵渦鞭蟲侵入心肌組織,心肌纖維溶解斷裂,大部分心肌纖維帶狀結(jié)構(gòu)消失,只有少數(shù)仍呈現(xiàn); 血卵渦鞭蟲的侵入導(dǎo)致心臟外層以及肌纖維間的結(jié)締組織破損嚴(yán)重甚至完全缺失,肌束間隙增大,肌絲纖維互相分離; 血竇結(jié)構(gòu)消失,血細(xì)胞數(shù)量明顯下降,取而代之的是大量血卵渦鞭蟲細(xì)胞,同時部分感染個體的心肌層間隙內(nèi)顆粒細(xì)胞數(shù)量增加并集聚在血卵渦鞭蟲周圍(圖5b)。

圖5 感染中期,血卵渦鞭蟲病蟹組織病理變化Fig. 5 Histopathological changes in the tissues of P. trituberculatus in middle Hematodinium infectiona. 感染中期,肝小管管腔擴(kuò)大,肝管上皮組織呈空泡狀變性,結(jié)締組織基本完全消失被大量病原蟲取代; b. 部分肌絲溶解變性,肌束相互分離,肌絲間隙現(xiàn)大量病原蟲細(xì)胞; c. 感染中期,鰓絲管腔內(nèi)現(xiàn)大量病原蟲細(xì)胞,上皮組織及鰓絲末端受損變薄; d. 步足肌肌絲斷裂溶解,相鄰肌絲纖維互相分離,間隙中侵入大量的血卵渦鞭蟲細(xì)胞

鰓: 大量血卵渦鞭蟲侵入鰓絲壁圍成的中央管腔內(nèi),導(dǎo)致鰓絲中央管腔變粗以及末端鰓小片膨脹變大,鰓絲上皮組織變薄,上皮細(xì)胞破損變性。健康蟹的鰓絲中央管腔中分布著由柱細(xì)胞構(gòu)成呈網(wǎng)狀的橫隔結(jié)構(gòu),血液由網(wǎng)孔中流過; 然而,由于血卵渦鞭蟲的侵入,導(dǎo)致橫隔結(jié)構(gòu)部分破損或消失,大量血卵渦鞭蟲蟲體分布在鰓絲管腔及鰓小片腔內(nèi)(圖5c)。

步足肌肉: 患病梭子蟹肌絲纖維排列疏松,肌絲斷裂溶解,相鄰肌絲纖維互相分離,間隙中侵入大量的血卵渦鞭蟲細(xì)胞或可見一些血細(xì)胞聚集,但其病理變化不如心肌病變顯著(圖5d)。

2.4.3 感染后期 肝胰腺: 重度感染個體,肝胰腺組織中充斥著大量血卵渦鞭蟲蟲體; 肝小管間隙嚴(yán)重擴(kuò)大,肝小管間結(jié)締組織完全缺失; 肝小管柱狀上皮細(xì)胞由于擠壓變性溶解呈現(xiàn)空泡狀,上皮組織界限模糊,管腔擴(kuò)大,但內(nèi)部并未發(fā)現(xiàn)血卵渦鞭蟲存在; 血細(xì)胞、顆粒細(xì)胞等幾乎完全消失,代之以大量血卵渦鞭蟲蟲體(圖6a)。

心臟: 大量血卵渦鞭蟲細(xì)胞侵入心肌層間隙,導(dǎo)致心肌纖維彎曲、斷裂、溶解壞死,肌絲纖維相互分離,喪失原本的條帶結(jié)構(gòu); 血竇腔內(nèi)血細(xì)胞等完全消失,心肌纖維間及外層結(jié)締組織完全破損缺失(圖6b)。

鰓: 鰓絲腔內(nèi)充斥著大量血卵渦鞭蟲蟲體; 可能由于物理擠壓導(dǎo)致鰓絲表皮層壞死變薄,鰓絲管腔膨脹變形,柱細(xì)胞形成的鰓小隔(trabecular cells)完全缺失,血細(xì)胞數(shù)量下降,鰓絲末端的鰓小片膨脹變形,部分鰓絲末端表皮層破裂; 而且由于鰓絲膨脹變形,導(dǎo)致相鄰鰓絲進(jìn)一步靠近(圖6c)。

步足肌肉: 打開蟹蓋,嚴(yán)重感染個體步足末端肌肉液化呈透明狀,很難取出成塊的肌肉。組織切片顯示肌肉組織幾乎全部變性壞死,肌絲排列紊亂且相互分離,大部分肌絲纖維彎曲、 斷裂、溶解,喪失正常緊密的條帶狀結(jié)構(gòu),壞死部分充滿血卵渦鞭蟲細(xì)胞(圖 6d)。

3 討論

2004年,血卵渦鞭蟲首次在我國浙江沿海地區(qū)的養(yǎng)殖三疣梭子蟹感染中報道發(fā)現(xiàn),此后又相繼在該區(qū)域的養(yǎng)殖鋸緣青蟹、脊尾白對蝦,以及廣東汕頭地區(qū)的養(yǎng)殖鋸緣青蟹等海產(chǎn)甲殼類動物體內(nèi)檢測到該寄生性病原(許文軍等,2007a,b; 許文軍等,2010;吳清洋等,2010)。血卵渦鞭蟲病的顯著特征為宿主血淋巴呈現(xiàn)明顯的白濁狀態(tài)并喪失正常的凝聚能力,形態(tài)類似牛奶狀,因此當(dāng)?shù)貪O民也稱這種血卵渦鞭蟲病為“牛奶病”。近年來,養(yǎng)殖蝦蟹類多種“牛奶病”頻發(fā),已對經(jīng)濟(jì)甲殼類的養(yǎng)殖造成嚴(yán)重的損失(許文軍等,2007a; 王高學(xué)等,2007; 許文軍等,2010),其中血卵渦鞭蟲作為引發(fā)甲殼類“牛奶病”的主要病原,引起了廣泛關(guān)注。近來,我們在山東半島的養(yǎng)殖梭子蟹中也發(fā)現(xiàn)了血卵渦鞭蟲感染,表明該寄生性病原在我國近海主要蝦蟹類養(yǎng)殖區(qū)有廣泛的分布(Liet al,2013)。

圖6 感染后期,血卵渦鞭蟲病蟹組織病理變化Fig. 6 Histopathological changes in the tissues of P. trituberculatus in late Hematodinium infectiona. 感染后期,肝小管結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞變性,管間距擴(kuò)大,其間結(jié)締組織完全被大量病原蟲細(xì)胞取代; b. 心臟肌絲溶解變性呈島狀分布,帶狀結(jié)構(gòu)消失,肌束間隙充滿病原蟲細(xì)胞; c. 感染后期,鰓絲管腔充滿病原蟲細(xì)胞,鰓小隔消失,鰓絲上皮組織變薄破損,鰓絲末端膨脹;d. 步足肌肌絲嚴(yán)重溶解斷裂,肌絲間隙充斥著大量病原蟲細(xì)胞

研究表明,血卵渦鞭蟲能夠侵入宿主血淋巴系統(tǒng),隨后在宿主器官的結(jié)締組織間隙或血竇內(nèi)增殖,引發(fā)一系列組織病變而致使宿主死亡。該寄生蟲全身性的侵染可能與甲殼類血液的開腔循環(huán)相關(guān); 然而,血卵渦鞭蟲如何侵入宿主體內(nèi)及如何在宿主群體內(nèi)傳播等有待進(jìn)一步研究。甲殼類動物相對于脊椎動物缺乏特異性的免疫系統(tǒng),主要依靠血淋巴細(xì)胞對外來異物及病原生物產(chǎn)生吞噬、凝聚、包裹等本體免疫反應(yīng)(李長紅等,2008)。健康三疣梭子蟹的血淋巴呈淡藍(lán)色,具有很強的凝聚能力,可有效促進(jìn)傷口的愈合。然而,感染血卵渦鞭蟲的梭子蟹往往表現(xiàn)為血淋巴細(xì)胞明顯減少,重度感染蟹的血淋巴中甚至完全被病原蟲細(xì)胞占據(jù),直接導(dǎo)致宿主機體部分免疫功能缺失,為該病原的快速增殖及其他病原生物的入侵創(chuàng)造了有利條件。進(jìn)而推測宿主血淋巴細(xì)胞直接或間接參與針對血卵渦鞭蟲的免疫反應(yīng)是導(dǎo)致血淋巴細(xì)胞數(shù)量急劇變化的主要原因; 然而,其具體作用機制有待進(jìn)一步研究。

血卵渦鞭蟲在宿主體內(nèi)的系統(tǒng)性感染增殖導(dǎo)致宿主的主要器官和組織均發(fā)生不同程度的病變,其中肝胰腺、心臟、鰓等組織變化尤為顯著。感染前期,病原蟲首先在肝胰腺中出現(xiàn),而在心臟、鰓中鮮有病原蟲細(xì)胞的存在; 在感染中后期,各組織中均現(xiàn)大量的病原蟲體; 可見,肝胰腺可作為血卵渦鞭蟲病早期診斷的指示性組織(Wheeleret al,2007)。梭子蟹的肝胰腺由泡狀(B細(xì)胞)、纖維(F細(xì)胞)、吸收(R細(xì)胞)以及胚細(xì)胞(E細(xì)胞)四種細(xì)胞構(gòu)成,承擔(dān)了機體的消化吸收及儲存營養(yǎng)物質(zhì)的部分甚至全部功能(姚桂桂等,2008)。血卵渦鞭蟲在肝小管間隙內(nèi)大量增殖,可能會直接導(dǎo)致肝小管上皮細(xì)胞及結(jié)締組織損傷甚至壞死,主要表現(xiàn)為細(xì)胞水腫變性、細(xì)胞核固縮、裂解等。肝胰腺的多少直接或間接影響到宿主的消化吸收,而且大量病原蟲增殖還會直接消耗組織中儲存的營養(yǎng)物質(zhì),直接導(dǎo)致組織發(fā)生生理饑餓現(xiàn)象,進(jìn)而影響到宿主的蛻皮周期、營養(yǎng)物質(zhì)的貯藏、糖類代謝等過程(Stentifordet al,1999; Stentifordet al,2000; Stentifordet al,2001)。在不同感染階段,肝胰腺結(jié)構(gòu)受到不同程度的損害,然而實驗中并未發(fā)現(xiàn)血卵渦鞭蟲進(jìn)入肝小管的管腔。有研究表明,肝小管中常見食物殘渣和脫落的B細(xì)胞頂泡及R細(xì)胞(姚桂桂等,2008),但其具體的功能和作用機制并沒有明確的結(jié)論。因此,病原蟲導(dǎo)致梭子蟹肝胰腺結(jié)構(gòu)破損但未進(jìn)入管腔內(nèi)部的原因和機制尚待進(jìn)一步研究。

感染血卵渦鞭蟲梭子蟹的心臟、鰓和肌肉組織內(nèi)均現(xiàn)大量病原蟲體,并有明顯病變。與其他種類宿主感染血卵鞭蟲的病理變化類似,重度染病梭子蟹的心肌纖維斷裂分離,帶狀結(jié)構(gòu)消失(Meyerset al,1987;Hudsonet al,1994; Messick,1994; Stentifordet al,2002)。心臟受到損傷可引起心律衰竭,血淋巴液循環(huán)、氣體交換、能量傳遞等障礙,進(jìn)而引起宿主個體死亡。鰓作為甲殼類動物的主要呼吸器官,兼具滲透調(diào)節(jié)功能。然而,重度感染個體的鰓管中常充斥大量病原細(xì)胞,造成鰓管阻塞,直接導(dǎo)致宿主呼吸功能受阻; 而且大量血卵渦鞭蟲會消耗氧氣,減弱血淋巴細(xì)胞的攜氧功能(Tayloret al,1996)。因此,血卵渦鞭蟲在宿主鰓內(nèi)的寄生和增殖能夠直接導(dǎo)致梭子蟹呼吸性功能障礙,進(jìn)而影響機體正常的生理代謝。大量血卵渦鞭蟲的侵入,會導(dǎo)致鰓絲上皮細(xì)胞壞死、上皮組織變薄甚至破損,不僅影響到機體滲透調(diào)節(jié)功能,而且便于水體中其他病原生物侵入而造成繼發(fā)性感染。另外,Wheeler等(2007)研究表明,鰓可能是血卵渦鞭蟲進(jìn)入宿主的重要渠道。肌肉組織在感染前中期,并未發(fā)現(xiàn)明顯的病理變化; 感染后期步足肌出現(xiàn)類似心肌的病理癥狀,肌絲斷裂、變性、溶解,帶狀結(jié)構(gòu)消失,肌絲間隙充斥著大量的病原蟲體,重度感染個體的步足基部肌肉呈水樣溶解狀態(tài); 血卵渦鞭蟲感染導(dǎo)致的肌肉組織損傷會導(dǎo)致宿主活動力受阻、攝食能力減弱等。

通過血淋巴涂片及組織病理觀察,在染病梭子蟹的血淋巴和主要組織器官中發(fā)現(xiàn)了不同形態(tài)或生活史階段的血卵渦鞭蟲蟲體,包括單核、雙核、多核滋養(yǎng)體結(jié)構(gòu),滋養(yǎng)體團(tuán)聚體結(jié)構(gòu),蛛網(wǎng)狀滋體結(jié)構(gòu)以及孢子前細(xì)胞或孢子結(jié)構(gòu)。本研究所觀察到的血卵渦鞭蟲形態(tài)與已有報道的血卵渦鞭蟲形態(tài)相似,在不同宿主體內(nèi)寄生或者在不同的體外條件下培養(yǎng)可能會導(dǎo)致血卵渦鞭蟲的形態(tài)有一定差異(Messick,1994;Appletonet al,1998; Shieldset al,2000; Pestalet al,2003; Liet al,2011)?；疾∷笞有敷w內(nèi)的病原蟲多數(shù)呈圓形或卵圓形,大小與血淋巴細(xì)胞相近; 然而,在病蟹的肝胰腺、心臟、肌肉等組織器官中除上述卵圓形形態(tài)結(jié)構(gòu)之外,還存在蛛網(wǎng)狀滋養(yǎng)體結(jié)構(gòu)。血卵渦鞭蟲的多種形態(tài)表明宿主處于不同的感染階段,或者是處于血卵渦鞭蟲不同的生活史階段。血卵渦鞭蟲不同形態(tài)結(jié)構(gòu)所代表的生活史階段,以及其不同生活史階段對于宿主機能的影響尚需進(jìn)一步研究。而且,關(guān)于血卵渦鞭蟲完整的生活史的研究較少,目前僅有從挪威龍蝦和美國蘭蟹體內(nèi)分離的血卵渦鞭蟲具有完整的生活史研究(Appletonet al,1998; Liet al,2011),感染三疣梭子蟹的血卵渦鞭蟲的完整生活史也有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

血卵渦鞭蟲是一類主要寄生于甲殼類動物體內(nèi)的致病性病原蟲,該病原蟲可對三疣梭子蟹進(jìn)行系統(tǒng)性侵染,在感染過程中歷經(jīng)絲狀滋養(yǎng)體,單核、雙核以及多核滋養(yǎng)體結(jié)構(gòu),團(tuán)聚體結(jié)構(gòu),蛛網(wǎng)狀滋體結(jié)構(gòu)以及孢子前細(xì)胞和孢子等不同的生活史階段。

血卵渦鞭蟲在宿主體內(nèi)增殖導(dǎo)致梭子蟹機體發(fā)生不同程度的病理變化,血淋巴、心臟、肝胰腺、鰓、肌肉等主要的組織器官均會受到相應(yīng)程度的破壞,主要表現(xiàn)為體細(xì)胞破損或壞死,細(xì)胞間隙模糊,組織中充斥著大量寄生蟲。感染早期,血卵渦鞭蟲多呈絲狀或卵圓形的滋養(yǎng)體形態(tài),病變主要表現(xiàn)為宿主顆粒、半顆粒細(xì)胞以及透明細(xì)胞等血細(xì)胞數(shù)量明顯下降,少量病原蟲體侵入肝胰腺和心臟組織。感染中后期,病原多呈現(xiàn)圓球狀的孢子前細(xì)胞或孢子結(jié)構(gòu),心臟組織中可發(fā)現(xiàn)蛛網(wǎng)狀滋養(yǎng)體的存在,血卵渦鞭蟲大量增殖導(dǎo)致梭子蟹心臟、肝胰腺、肌肉、鰓等主要的組織器官結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯的破損或壞死,病原蟲細(xì)胞幾乎完全取代血淋巴細(xì)胞,重度感染個體最終可能因主要組織器官功能破壞或喪失而死亡。

目前,對于血卵渦鞭蟲的幾種典型的生活史形態(tài)雖然有所認(rèn)識,但其完整的生活史過程仍缺乏深入的了解,有待進(jìn)一步的研究; 血卵渦鞭蟲大量增殖對宿主組織器官結(jié)構(gòu)功能的影響機制以及其不同生活史形態(tài)對該病原傳播、擴(kuò)散的作用仍需要進(jìn)一步探索。

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