缺氧增強(qiáng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞“干性”的初步研究

李鵬程,周　椿,徐倫山,肖華亮　(.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所神經(jīng)外科，重慶40004；.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所病理科，重慶 40004)

缺氧增強(qiáng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞“干性”的初步研究

李鵬程1,周椿1,徐倫山1,肖華亮2(1.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所神經(jīng)外科，重慶400042；2.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所病理科，重慶 400042)

[摘要]目的研究在體外環(huán)境下，缺氧與腫瘤干細(xì)胞(CSCs)“干性”的關(guān)系。方法選擇U87細(xì)胞和U251細(xì)胞以及原代膠質(zhì)瘤細(xì)胞并進(jìn)行缺氧處理。用透射電子顯微鏡法來檢測(cè)這些細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)；用MTT法來檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)；用流式細(xì)胞儀來檢測(cè)細(xì)胞周期以及CD133的表達(dá)；用transwell法來檢測(cè)細(xì)胞遷移能力；用集落形成分析來分析細(xì)胞的集落形成能力；并用實(shí)時(shí)定量PCR來檢測(cè)干細(xì)胞以及其分化標(biāo)志物的mRNA表達(dá)。結(jié)果缺氧使原代膠質(zhì)瘤細(xì)胞維持在一個(gè)未分化的狀態(tài)，減慢處于相對(duì)靜止階段的膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增加它們的集落形成能力和膠質(zhì)瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，而且能提高干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)水平。腫瘤干細(xì)胞的分化標(biāo)志物在進(jìn)行缺氧處理后降低。結(jié)論缺氧能夠使已分化的膠質(zhì)瘤細(xì)胞“去分化”而使其獲得“干性”。

[關(guān)鍵詞]腫瘤干細(xì)胞；干性；缺氧；膠質(zhì)瘤

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要腫瘤，占成人顱內(nèi)腫瘤的35%～50%。而且，在膠質(zhì)瘤中有60%是惡性膠質(zhì)瘤[1]。目前，手術(shù)治療同時(shí)聯(lián)合放療、化療以及生物治療仍然是膠質(zhì)瘤的主要治療手段。然而，這些方法的治療效果并不理想。標(biāo)準(zhǔn)的治療方法同時(shí)聯(lián)合放療和/或化療能使患者的平均生存時(shí)間僅為14.6個(gè)月[2]。近些年來，越來越多的證據(jù)表明腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells,CSCs)參與了癌癥的發(fā)展過程，且能促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)，引起腫瘤的侵襲、復(fù)發(fā)以及轉(zhuǎn)移[3]。由于其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用，CSCs可能成為治療癌癥的一個(gè)靶點(diǎn)。然而，需要更多的實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步明確腫瘤細(xì)胞尤其是CSCs的生長(zhǎng)和分化與腫瘤微環(huán)境之間的關(guān)系。

缺氧是包括膠質(zhì)瘤在內(nèi)的幾乎所有惡性腫瘤的重要特征。缺氧對(duì)于腫瘤血管生成和能量代謝的影響已較為明確，而缺氧對(duì)于腫瘤細(xì)胞尤其是CSCs的生長(zhǎng)和分化的影響有待進(jìn)一步探索[4]。在這些研究的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)的目的是研究CSCs和腫瘤微環(huán)境之間的關(guān)系，以便更好地理解CSCs分化的機(jī)制。在本實(shí)驗(yàn)中，我們研究了缺氧和CSCs分化的相關(guān)因素，以期為膠質(zhì)瘤的治療提供很好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1CSCs的分離、鑒別和培養(yǎng)

根據(jù)文獻(xiàn)中的免疫磁珠細(xì)胞分離方法(MACS)分離CSCs和CD133陽性的腫瘤細(xì)胞[5]。首先，取新鮮的腫瘤組織并進(jìn)行沖洗，同時(shí)去除壞死的組織和血液。然后，將腫瘤組織切成1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，再用胰酶進(jìn)行消化并離心。收集離心出來的細(xì)胞，并在含有bFGF和EGF的無血清培養(yǎng)液里進(jìn)行培養(yǎng)。收集原代神經(jīng)球，并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD133陽性和CD133陰性的腫瘤細(xì)胞，再進(jìn)行進(jìn)一步的培養(yǎng)。

1.2細(xì)胞周期檢測(cè)

將U87細(xì)胞在常氧或者1%O2的環(huán)境中培養(yǎng)。然后在不同的時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.3免疫磁珠方法分離細(xì)胞

磁場(chǎng)能將細(xì)胞上結(jié)合的標(biāo)志物和細(xì)胞分開。在我們過去的研究中，用這個(gè)方法成功地分離了CD133陽性細(xì)胞和膠質(zhì)瘤來源的內(nèi)皮細(xì)胞[5-6]。CD133微球和羊抗鼠IgG微球購(gòu)自德國(guó)的Miltenyi公司。

1.4MTT分析

用MTT來檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，并描繪生長(zhǎng)曲線。收集對(duì)數(shù)期的細(xì)胞，并制成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液的濃度調(diào)整到5 000/孔(用無菌的PBS溶液加滿邊緣孔)。將細(xì)胞放在37 ℃和5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直到細(xì)胞鋪滿孔底(平底96孔板)，然后將細(xì)胞放在常氧或者缺氧環(huán)境中培養(yǎng)。將20 μl的MTT溶液加入到每一個(gè)孔里(5 mg/mL的0.5%MTT溶液)，然后繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后，將上清液棄去，再在每個(gè)孔里加入150 μl的二甲基亞砜(DMSO)，然后將培養(yǎng)板放在搖床上低速震蕩10 min來完全溶解結(jié)晶。最后用酶標(biāo)儀于570 nm處測(cè)定吸光度值。

1.5集落形成分析

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U251細(xì)胞，并用0.5%胰酶/0.04% EDTA消化，來制備單細(xì)胞懸液。然后，將這些細(xì)胞加入到24孔板中(50個(gè)細(xì)胞/孔)，再將其在37 ℃、飽和濕度和5%CO2的環(huán)境中培養(yǎng)24 h。未貼壁的細(xì)胞被棄去。培養(yǎng)2～3周后，出現(xiàn)了大的集落，然后用0.5%胰酶/0.04% EDTA來消化集落制備單細(xì)胞懸液。然后將這些細(xì)胞接種在96孔板中，再繼續(xù)在37 ℃、飽和濕度和5%CO2的環(huán)境中培養(yǎng)，觀察其集落形成能力以及集落的形態(tài)，并測(cè)量集落的大小以及計(jì)數(shù)每個(gè)集落中的細(xì)胞數(shù)。這次，將細(xì)胞分成早期傳代組以及晚期傳代組。在早期傳代組中，用0.5%胰酶/0.04%EDTA消化制備單細(xì)胞懸液，然后將這些細(xì)胞接種到96孔板中。在晚期傳代組中，用0.5%胰酶/0.04%EDTA消化制備單細(xì)胞懸液，然后將細(xì)胞接種到96孔板中。

1.6Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

將40 μl人工基底膜(matrigel膠+無血清培養(yǎng)基)加入到上室，在37 ℃環(huán)境中過夜。然后將細(xì)胞(1×106/mL)加入到上室中(100 μl)，再將條件培養(yǎng)基(600 μl)加到下室中并繼續(xù)培養(yǎng)24 h。然后將Transwell小室取出，將上室中的培養(yǎng)液棄去。再用PBS溶液清洗上室。用棉簽擦去Matrigel膠和上室內(nèi)的殘余細(xì)胞。接下來，用PBS溶液清洗上室，并浸入4%多聚甲醛中30 min來固定上室內(nèi)的細(xì)胞。用PBS溶液清洗2次后，用結(jié)晶紫對(duì)上室進(jìn)行染色20 min。用ddH2O清洗上室3次以上并晾干后，置于光學(xué)顯微鏡下觀察。每個(gè)孔選擇3個(gè)視野來進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.7統(tǒng)計(jì)分析

2結(jié)果

2.1缺氧對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞周期的影響

用MTT來檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)并描繪細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。圖1顯示了U87和x02GBM細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示缺氧能夠輕度抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，但是并不顯著。圖2顯示了細(xì)胞周期結(jié)果，表明在1% O2中缺氧處理2、12、24 h對(duì)細(xì)胞周期并沒有顯著影響。然而，缺氧處理48 h后，在G0/G1期的細(xì)胞數(shù)量較常氧組顯著增加(P<0.05)，而且在G2/M期的細(xì)胞數(shù)顯著下降(P<0.01)。細(xì)胞周期的變化與上述變化相似。

a:U87細(xì)胞生長(zhǎng)曲線;b:x02GBM細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

缺氧(1%O2)處理2、12、24和48 h后，G0/G1期,G2/M期和S期的U87細(xì)胞 (*：P<0.05;#:P<0.01;n=3)

圖2缺氧對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期的影響

2.2缺氧對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的集落形成能力的影響

集落形成分析顯示缺氧對(duì)膠質(zhì)瘤的集落形成能力有顯著的影響(圖3)。缺氧處理后，U251細(xì)胞的集落形成能力顯著高于常氧組(P<0.05)。尤其是致密型的集落比例顯著增加。在缺氧的條件下，U251細(xì)胞的致密型集落的比例顯著高于常氧組(P<0.01)。

a：缺氧對(duì)U251細(xì)胞的集落形成能力的影響；b：在常氧和缺氧條件下，不同類型U251細(xì)胞集落之間比較(*:P<0.05;#:P<0.01)

圖3缺氧對(duì)U251細(xì)胞的集落形成能力的影響

2.3缺氧對(duì)于膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移的影響

用Transwell法來分析細(xì)胞的遷移能力。缺氧處理2 h后，U87細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)與常氧組相近。缺氧處理12 h和24 h后，穿膜的細(xì)胞數(shù)與常氧組相比顯著增加(P<0.05),見圖4。

圖4　缺氧(1%O2)對(duì)細(xì)胞遷移的影響(*:P<0.05)

2.4缺氧對(duì)于CSCs標(biāo)志物及其分化標(biāo)志物的影響

2.4.1缺氧對(duì)CD133表達(dá)的影響經(jīng)過1%O2處理48 h后，檢測(cè)CD133的表達(dá)水平。跟常氧組相比，缺氧顯著增加了CD133的表達(dá)以及CD133陽性細(xì)胞數(shù)量(圖5c)。常氧組中CD133陽性的x01GBM細(xì)胞的比例是(4.38±0.95)%(n=3)，經(jīng)過缺氧處理48 h后CD133陽性的x01GBM細(xì)胞的比例是(15.90±1.38)%(n=3)，兩者之間存在顯著差異(P<0.01),見圖5a～c。

2.4.2缺氧對(duì)CSCs標(biāo)志物及其mRNA表達(dá)的影響實(shí)時(shí)定量PCR被用來檢測(cè)CSCs標(biāo)志物(OCT-4，SOX-2)和CSCs的分化標(biāo)志物(GFAP)。OCT-4的擴(kuò)增曲線很光滑，具有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)期、線性增長(zhǎng)期和平臺(tái)期，表現(xiàn)出特異性的增長(zhǎng)。圖6顯示了不同時(shí)間點(diǎn)U87中的OCT-4、SOX-2和GFAP的mRNA表達(dá)。在常氧組中，U87細(xì)胞中沒有OCT-4和SOX-2的mRNA表達(dá)。經(jīng)過缺氧(1%O2)處理2、12和24 h后，OCT-4和SOX-2的mRNA表達(dá)增加了；經(jīng)過缺氧(1%O2)處理48 h和72 h后，OCT-4和SOX-2的mRNA表達(dá)跟其他組相比最高(P<0.01)。然而，GFAP的mRNA變化與上述變化相反。經(jīng)過缺氧(1%O2)處理2 h和12 h后，GFAP的mRNA反而下降了，而且在處理48 h后仍維持在一個(gè)低水平。經(jīng)過缺氧處理48 h和72 h后，U87細(xì)胞中GFAP的mRNA水平顯著低于常氧組以及缺氧處理2 h組(P<0.01)。如果經(jīng)過0.5 μg/mL DAPT(一種Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的特異性抑制劑)預(yù)處理，在缺氧治療72 h后，U87細(xì)胞中OCT-4和SOX-2的mRNA表達(dá)水平顯著低于單用缺氧治療的U87細(xì)胞中的mRNA水平(P<0.01)。然而GFAP的mRNA變化水平表現(xiàn)出相反的規(guī)律(P<0.01)。

空白峰區(qū)為同型對(duì)照，紅色峰區(qū)為CD133表達(dá)；a：常氧條件下，x01GBM細(xì)胞中CD133的表達(dá)水平；b：缺氧處理48 h后，x01GBM細(xì)胞中CD133的表達(dá)水平;c:缺氧(1%O2)處理后，CD133陽性細(xì)胞的比例跟常氧組相比明顯增加(*:P<0.05;#:P<0.01)

圖5缺氧對(duì)CD133表達(dá)的影響

a：在U87細(xì)胞中OCT-4的mRNA表達(dá)；b：在U87細(xì)胞中SOX-2的mRNA表達(dá)；c：在U87細(xì)胞中GFAP的mRNA表達(dá)；*與缺氧48 h和72 h比較，P<0.05;#:與缺氧72 h比較，P<0.01

圖6缺氧對(duì)OCT-4、SOX-2以及GFAP的mRNA的表達(dá)的影響

3討論

缺氧是一種普遍的生理和病理生理現(xiàn)象。發(fā)生缺氧時(shí)，人的身體會(huì)通過復(fù)雜的機(jī)制來適應(yīng)缺氧。例如，在缺氧的情況下，機(jī)體會(huì)增加糖酵解來代償氧化磷酸化減少而引起的能量不足[7]；在缺氧的情況下，機(jī)體會(huì)增加血管生成來提高血管密度，從而改善血供；系統(tǒng)性缺氧可造成生理性的紅細(xì)胞生成素增加，從而適應(yīng)缺氧環(huán)境。此外，缺氧同樣是一種普遍的病理現(xiàn)象。例如，缺氧在癌癥中是一種常見的現(xiàn)象[8]。

過去有實(shí)驗(yàn)已證明缺氧能誘導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)能影響腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的不同目標(biāo)基因以及腫瘤的血管生成[9-11]。近年來，很多研究表明缺氧與干細(xì)胞的未分化狀態(tài)有關(guān)，并與神經(jīng)脊和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的干細(xì)胞的增殖和分化有關(guān)[12-13]。一些干細(xì)胞相關(guān)的信號(hào)分子參與了缺氧對(duì)干細(xì)胞的調(diào)節(jié)。迄今為止，研究發(fā)現(xiàn)參與干細(xì)胞的正常自我更新和分化的分子包括Wnt、BMP、Notch和Sonic hedgehog (Shh)。近期的研究顯示缺氧可能激活HIF-1α從而上調(diào)Notch信號(hào)通路中的對(duì)于維持神經(jīng)干細(xì)胞的未分化狀態(tài)至關(guān)重要的下游分子[14]。Covello等[15]證實(shí)了干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子OCT-4是HIF-2α的一個(gè)目標(biāo)因子。HIF-2α能夠激活OCT-4從而調(diào)節(jié)干細(xì)胞的自我更新和分化。Kaidi等[16]的研究同樣顯示W(wǎng)nt/β-catenin能夠與HIF-1α相互作用。因此，已有確切的證據(jù)顯示缺氧與調(diào)節(jié)正常干細(xì)胞的干性的信號(hào)通路相關(guān)。此外，也有研究發(fā)現(xiàn)這些信號(hào)通路中的分子參與了CSCs的自我更新和分化[17-18]。Axelson等[19]發(fā)現(xiàn)缺氧能夠改變神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞中分化相關(guān)基因的表達(dá)，能夠促進(jìn)已分化細(xì)胞的去分化以及使這些細(xì)胞獲得干細(xì)胞特征。Tavaluc等[20]證明了缺氧能夠增加側(cè)群腫瘤細(xì)胞。然而，關(guān)于缺氧對(duì)于膠質(zhì)瘤細(xì)胞以及膠質(zhì)瘤中CSCs細(xì)胞的影響的研究還是很少。

在我們的前期研究中，發(fā)現(xiàn)CA IX表達(dá)與干細(xì)胞的侵襲性和腫瘤的進(jìn)展相關(guān)。基于這些研究結(jié)果，我們假設(shè)缺氧能夠增加膠質(zhì)瘤中CSCs的干性，并進(jìn)一步較全面地證明了此假設(shè)。首先，檢測(cè)缺氧對(duì)于膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明缺氧能維持未分化狀態(tài)，而常氧能促進(jìn)細(xì)胞分化。我們還描繪了細(xì)胞生長(zhǎng)曲線并檢測(cè)了細(xì)胞周期。結(jié)果顯示，缺氧能減慢生長(zhǎng)速度而且增加靜止期的細(xì)胞比例。然后，我們檢測(cè)了缺氧處理后膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性。我們研究了缺氧對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和遷移的影響。結(jié)果顯示缺氧能夠促進(jìn)這些細(xì)胞的自我更新和遷移能力。最后，用PCR來研究缺氧對(duì)于膠質(zhì)瘤中CSCs及其分化標(biāo)志物的影響。結(jié)果顯示缺氧能增加CSCs標(biāo)志物CD133和巢蛋白的表達(dá)，但是減少了分化標(biāo)志物GFAP陽性的細(xì)胞比例?；谌毖鯇?duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞功能、CSCs自我更新和遷移能力和干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的影響，我們總結(jié)出缺氧能夠使分化的細(xì)胞去分化而且促進(jìn)這些細(xì)胞獲得干細(xì)胞能力。然而，干性的增加是由于膠質(zhì)瘤中已分化的細(xì)胞去分化導(dǎo)致的CSCs增加，還是由于缺氧導(dǎo)致的CSCs增殖增加仍不清楚，還需要更進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證這個(gè)結(jié)果。

總而言之，我們的研究全面證明了在體外環(huán)境下缺氧能夠增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞的干性，但是仍需要進(jìn)行進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來證實(shí)這個(gè)結(jié)果，而且這種影響的具體機(jī)制仍不清楚。在我們未來的研究中，我們將進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)并研究這些影響的機(jī)制，從而篩選出膠質(zhì)瘤的治療靶點(diǎn)。目前，關(guān)于CSCs的研究仍處于初級(jí)階段，還需要更進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來闡明CSCs與其微環(huán)境之間的關(guān)系。

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(編輯：周小林)

Hypoxia enhances stemness of cancer stem cells in glioblastoma

LI Peng-cheng1,ZHOU Chun1,XU Lun-shan1,XIAO Hua-liang2(1.Department of Neurosurgery,Institute of Field Surgery,Daping Hospital,Third Military University,Chongqing 400042,China；2.Department of Pathology，Institute of Field Surgery,Daping Hospital,Third Military University,Chongqing 400042,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the relationship between hypoxia and stemness of cancer stem cells (CSCs).MethodsU87 cells,U251 cells and primary glioma cells were experienced hypoxia.Detected the ultrastructure of these cancer cells with transmission electron microscopy; detect the cell growth with MTT assay; cell cycle and CD133 expression were detected by flow cytometry; and the cell migration ablity were detected through transwell chamber assay; the colony-forming efficiency were deteced by colony-forming assay; and real-time quantitative PCR and Western blot were carried out to detect the mRNA and protein expression of markers of stem cells and their differentiation respectively.ResultsHypoxia maintained the undifferentiated state of primary glioma cells, slowed down the growth of glioma cells which were in a relatively quiescent stage, increased the colony forming efficiency and migration of glioma cells, and increased the expression of markers of stem cells, but the expression of markers for stem cell differentiation was reduced after hypoxia treatment.ConclusionHypoxia may induce the “dedifferentiation” of differentiated glioma cells which then acquire the stemness.

Keywords:cancer stem cells;stemness;hypoxia;glioblastoma

[收稿日期]2015-04-28[修回日期] 2015-06-15

[通訊作者]徐倫山，E-mail：xuliu559@163.com；肖華亮，E-mail：xiaoyyuk@163.com

[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金(30872649)

doi:10.11659/jjssx.01E015027

[中圖分類號(hào)]R730.5

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1672-5042(2015)05-0479-05