王鑫++++++王巍++++++張君丞++++++賈大林

[摘要] 目的 觀察原花青素（PCs）通過抑制內質網(wǎng)應激對H9C2心肌細胞缺氧/復氧（H/R）后損傷的保護作用。方法 將培養(yǎng)的H9C2心肌細胞隨機分為5組：對照組、缺氧/復氧組（H/R組）、低劑量PCs+H/R組（LPCs組）、中劑量PCs+缺氧復氧組（MPCs組）、高劑量PCs+缺氧復氧組（HPCs組）。對照組心肌細胞正常培養(yǎng)至實驗結束，H/R組行缺氧3 h后復氧3 h，PCs組分別于缺氧前30 min給予50、100、200 μg/mL 的PCs培養(yǎng)再行缺氧/復氧過程。實驗后MTT法測定細胞生存率；測定乳酸脫氫酶（LDH）活性；流式細胞術檢測心肌細胞凋亡；Western blot測定內質網(wǎng)應激蛋白葡萄糖調節(jié)蛋白78（GRP78）、CCAAT/增強子結合蛋白（CHOP）、磷酸化c-Jun氨基末端激酶（p-JNK）、Caspase-12的表達。結果 與對照組比較，H/R組細胞生存率顯著降低（P < 0.05），LDH活性和細胞凋亡率顯著升高（P < 0.05）；H/R組GRP78、CHOP、p-JNK、Caspase-12蛋白表達較對照組明顯增加（P < 0.05）；給予不同濃度PCs干預后，PCs預處理組細胞生存率較H/R組明顯升高（LPCs組除外），LDH活性和細胞凋亡率明顯降低（P < 0.05），PCs預處理組GRP78、CHOP、p-JNK、Caspase-12蛋白表達較H/R組明顯下降（P < 0.05），中高劑量PCs抑制作用較低劑量強（P < 0.05）。結論 H/R可誘導心肌細胞內質網(wǎng)應激，引起細胞損傷和凋亡；PCs可以通過抑制內質網(wǎng)應激發(fā)揮其保護作用，減少細胞損傷和凋亡。

[關鍵詞] 原花青素；H9C2心肌細胞；缺氧/復氧；內質網(wǎng)應激

[中圖分類號] R542 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）11（b）-0029-05

[Abstract] Objective To observe the protective effect of proanthocyanidins （PCs） on hypoxia/reoxygenation （H/R） injury by attenuating endoplasmic reticulum stress （ERS） in H9C2 cardiomyocytes. Methods The H9C2 cardiomyocytes were randomly divided into five groups： control group， hypoxia/reoxygenation group （H/R group）， low-dose PCs+H/R group （LPCs group）， middle-dose PCs+H/R group （MPCs group）， high-dose PCs+H/R group （HPCs group）. H9C2 cardiomyocytes of control group were cultured under normal condition till the end of experiment. Cardiomyocytes of H/R group underwent hypoxia for 3 hours followed by reoxygenation for 3 hours. Different doses of PCs （50， 100， 200 μg/mL） were given 30 minutes before hypoxia in the PCs groups. Cell viability by MTT， lactic dehydrogenase （LDH） activity， cell apoptosis ratio by flow cytometric measurement and the protein expression of glucose-regulated proteins 78 （GRP78）， C/EBP-homologous protein（CHOP）， phosphorylation of c-Jun-N-terminal protein kinase（p-JNK） and Caspase-12 were detected. Results Compared with the control group， cell viability decreased significantly and LDH activity and apoptosis ratio increased significantly in the H/R group （P<0.05）， coupled with obvious increased expression of GRP78， CHOP， p-JNK， Caspase-12 protein （P < 0.05）. Different doses of PCs pretreatment increased cell viability （except the LPCs group）， decreased LDH activity and apoptosis ratio （P < 0.05） as well as decreased expression of GRP78， CHOP， p-JNK， Caspase-12 protein compared to the H/R group （P < 0.05）. Middle and high dose PCs pretreatment showed more effect than low dose group. Conclusion H/R can induce ERS leading to cell injury and apoptosis. PCs can protect cardiomyocytes against H/R injury by inhibiting ERS.

[Key words] Proanthocyanidins； H9C2 cardiomyocytes； Hypoxia/reoxygenation； Endoplasmic reticulum stress

缺血/再灌注損傷會引起組織功能紊亂甚至細胞凋亡[1-2]，如何有效預防心肌缺血/再灌注損傷是近年來冠心病治療的熱點問題[3]。越來越多的研究表明，內質網(wǎng)應激（ERS）在缺血/再灌注損傷的病理過程中起重要作用[4]。早期ERS可通過調節(jié)蛋白合成促進細胞修復，而持續(xù)的ERS則會激活內質網(wǎng)相關凋亡通路：CHOP、JNK、Caspase-12，引起細胞凋亡[5]。原花青素（PCs）是從植物中提取的一類具有多種生物活性的多酚類化合物，已被證實對心肌缺血/再灌注損傷有保護作用[6]，但PCs是否通過抑制ERS來減輕再灌注損傷及細胞凋亡未有文獻報道。本實驗采用H9C2心肌細胞建立缺氧/復氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）模型，模擬心肌缺血/再灌注損傷，在細胞水平觀察PCs對心肌細胞H/R損傷的保護作用，同時檢測ERS凋亡通路相關蛋白的表達變化，為保護心肌缺血/再灌注損傷提供藥物防治理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞株與藥物

H9C2心肌細胞株（購自中科院上海細胞庫），PCs（購自上海Aladdin科技公司，純度≥95%）。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基（Gibco），胎牛血清（Hyclone），PBS緩沖液（雙螺旋），胰蛋白酶（碧云天），MTT試劑盒（Sigma），細胞凋亡檢測試劑盒、GRP78、CHOP、p-JNK抗體（沈陽萬類生物公司），Caspase-12抗體（Santa Cruze CA，USA），乳酸脫氫酶（LDH）測定試劑盒（南京建成公司），CO2培養(yǎng)箱（HF-90），流式細胞儀（C6，美國BD公司），凝膠成像系統(tǒng)（WD-9413B，北京六一公司），雙垂直蛋白電泳儀（DYCZ-24DN），酶標儀（ELX-800）等。

1.3 實驗分組

將實驗用H9C2心肌細胞分為5組，①對照組：心肌細胞于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在95%空氣+5%CO2的37℃培養(yǎng)箱內正常培養(yǎng)6 h；②H/R組：將心肌細胞置換到無糖無血清、缺氧的DMEM培養(yǎng)基（氮氣預缺氧處理10 min），置于37℃充滿95%N2和5%CO2的三氣培養(yǎng)箱內培養(yǎng)3 h，然后更換為正常培養(yǎng)基，置于95%空氣+5%CO2的37℃培養(yǎng)箱復氧培養(yǎng)3 h。③④⑤不同濃度PCs預處理組：分別加入50 μg/mL（LPCs組）、100 μg/mL（MPCs組）、200 μg/mL（HPCs組）PCs對心肌細胞預處理30 min，后行H/R（同H/R組）。

1.4 MTT法檢測細胞存活率

將H9C2組細胞培養(yǎng)至密度為90%左右，進行細胞計數(shù)，按實驗分組接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔的細胞個數(shù)為5×103個，每組設計5個復孔，接種后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h。每個實驗組按照上述方法分別處理后加入5 mg/mL的MTT，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育4 h，小心吸去上清，加入200 μL DMSO以溶解細胞形成的紫色結晶，在酶標儀上測定其在490 nm處OD值，進行數(shù)據(jù)分析。存活率（%）=實驗組OD/對照組OD×100%，重復測定5次。

1.5 LDH測定

將LDH試劑盒中NaOH與丙酮酸稀釋10倍，分別配制為0.4 mol/L NaOH溶液與0.2 μmol/mL丙酮酸標準液；取各組細胞上清液為待測樣品，與試劑盒中適量的底物緩沖液、輔酶及0.2 μmol/mL丙酮酸標準液、蒸餾水混勻，37℃水浴15 min；加入適量2，4-二硝基苯肼混勻，37℃水浴15 min；加入適量0.4 mol/L NaOH溶液混勻，室溫放置5 min，在酶標儀上測定其在450 nm處的OD值，進行數(shù)據(jù)分析。

1.6 流式細胞儀（FCM）檢測細胞凋亡率

細胞按不同分組要求處理后，收集細胞，去上清，用PBS緩沖液洗滌細胞兩次，再離心去上清，每管細胞樣品中加入500 μL Binding Buffer輕輕重懸細胞，后加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL Propidium Iodide混勻，室溫避光孵育15 min，隨即進行流式檢測。

1.7 Western blot檢測

收集細胞提取蛋白，通過BCA反應測定蛋白濃度。取樣本蛋白40 μg，以8%～13%聚丙烯酰胺凝膠（SDS）電泳分離蛋白，轉印、封閉后，依次加入一抗（羊抗兔GRP78抗體1∶500，羊抗兔CHOP抗體1∶500，羊抗兔p-JNK抗體1∶500，羊抗兔Caspase-12抗體1∶1000）4℃孵育過夜，加入二抗37℃孵育45 min，加入ECL發(fā)光液靜置5 min，用凝膠圖象處理系統(tǒng)（Gel-Pro-Analyzer軟件）分析目標條帶的光密度值。β-actin為內參照。

1.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料用x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用LSD法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PCs預處理提高H/R損傷后心肌細胞存活率，減少心肌細胞LDH釋放

與對照組比較，H/R組細胞存活率明顯降低（P < 0.05），LDH活性明顯升高（P < 0.05）。與H/R組相比，MPCs、HPCs組心肌細胞存活率顯著提高（P < 0.05），LPCs組改善作用不明顯（P > 0.05），其中MPCs組細胞存活率提高最多。不同濃度PCs預處理組的LDH活性明顯低于H/R組（P < 0.05）。見表1。

2.2 PCs預處理可減少H/R后心肌細胞凋亡

對照組細胞凋亡極少，而H/R組出現(xiàn)大量凋亡和壞死細胞，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。與H/R組比較，不同濃度PCs預處理后細胞凋亡及壞死均明顯減少（P < 0.05），MPCs組細胞凋亡減少最明顯。見圖1。

2.3 PCs預處理對心肌細胞ERS相關蛋白表達的影響

H/R組GRP78、CHOP、p-JNK、Caspase-12蛋白表達水平較對照組明顯升高（P < 0.05）；給予不同濃度PCs干預后，GRP78、CHOP、p-JNK、Caspase-12蛋白表達水平下降（P < 0.05），MPCs、HPCs組GRP78、CHOP、p-JNK蛋白表達低于LPCs組，HPCs組Caspase-12蛋白表達低于LPCs組（P < 0.05）。見圖2。

3 討論

本研究主要發(fā)現(xiàn)PCs可以通過減輕內質網(wǎng)應激發(fā)揮對H/R心肌細胞的顯著保護作用，這種作用非劑量依賴性，本研究PCs最佳保護濃度測定為100 μg/mL。

PCs是植物中廣泛存在的一類多酚類化合物，由兒茶素或表兒茶素形成的二聚體或多聚體。在眾多植物中，葡萄籽提取物中的PCs的含量最高。PCs是強效的天然抗氧化物，其清除氧自由基的能力遠超過維生素C、維生素E或β胡蘿卜素[7]。PCs具有眾多生物活性，如抗炎、抗氧化、抗腫瘤、保護心血管作用等[8-11]。PCs可以通過清除氧自由基和減輕線粒體凋亡通路減輕心肌缺血/再灌注損傷[12-13]，但目前尚未報道證實PCs通過抑制內質網(wǎng)應激介導的凋亡通路保護H/R心肌細胞。

ERS指的是在各種不良刺激下內質網(wǎng)穩(wěn)態(tài)被破壞、功能發(fā)生紊亂，使大量錯誤折疊、未折疊蛋白在內質網(wǎng)腔內累積及鈣平衡紊亂的過程[14]。GRP78是內質網(wǎng)分子伴侶蛋白，其表達上調是內質網(wǎng)應激激活的標志[15]。早期內質網(wǎng)應激時，GRP78結合未折疊或錯誤折疊蛋白，通過減少蛋白合成、增加促進蛋白正確折疊的分子伴侶的表達和內質網(wǎng)相關降解來減輕ERS并促進細胞恢復[16]。如果應激嚴重或持續(xù)存在，則會誘導ERS相關性細胞凋亡，造成組織細胞損傷，主要包括CHOP、JNK和Caspase-12凋亡通路的激活[17]。

本研究中，H/R組的心肌細胞存活率明顯降低，LDH活性和細胞凋亡率明顯升高，GRP78、CHOP、p-JNK、Caspase-12蛋白表達明顯上調，均說明H/R對心肌細胞造成明顯損傷并激活了ERS及其凋亡通路。PCs預處理顯著提高了心肌細胞存活率，減少了LDH釋放和細胞凋亡，下調了ERS相關蛋白表達，說明PCs對H/R心肌細胞有明顯的保護作用。

本研究結果顯示，100 μg/mL劑量PCs保護作用優(yōu)于50、200 μg/mL劑量組，說明這種保護作用不隨濃度增加而增強。法國科學院曾報告PCs抗氧化活性在一定濃度內呈現(xiàn)劑量依賴性，但如果超出一定濃度，其抗氧化活性隨濃度升高而降低[18]。余瑩等[19]發(fā)現(xiàn)，PCs清除羥基自由基的能力在10 g/L以內隨濃度增加幾乎呈直線上升，超過20 g/L后不再增加。另一方面，劉暢等[20]觀察PCs對腦缺血影響中報道，50～200 mg/（kg·d）的PCs呈劑量依賴性減少大鼠腦缺血后自由基生成；何佳聲等[21]研究PCs對人結腸癌細胞增殖和凋亡的影響中發(fā)現(xiàn)，20～80 μg/mL的PCs呈劑量依賴性抑制結腸癌細胞增殖并促凋亡，與本文研究結果不一致，考慮本研究中高劑量組PCs濃度已超過PCs對心肌細胞的最佳保護濃度，故保護作用呈降低趨勢。目前PCs對心肌缺血/再灌注損傷研究中未見濃度研究的報道。

本文從細胞水平證實了PCs預處理可通過抑制ERS減少H/R引起的細胞損傷和凋亡，為缺血再灌注損傷的藥物預防提供了理論基礎。本文不足之處在于H9C2心肌細胞無自發(fā)性收縮，不能充分模擬人類心肌細胞條件，有待于動物實驗進一步證實實驗結果。

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