呂情花

追風(fēng)透骨膠囊中馬兜鈴酸A的限量檢查

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目的完善追風(fēng)透骨膠囊中馬兜鈴酸A的限量檢查。方法用Waters C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱檢測(cè)馬兜鈴酸A, 流動(dòng)相：乙腈-0.4%冰醋酸(30∶70), 流速：1.00 ml/min, 檢測(cè)波長(zhǎng)∶393 nm。結(jié)果用本法測(cè)定10批不同批號(hào)的追風(fēng)透骨膠囊, 均能準(zhǔn)確的判斷為未檢出馬兜鈴酸A。結(jié)論本法結(jié)果準(zhǔn)確, 可完善追風(fēng)透骨膠囊中馬兜鈴酸A的限量檢查。

高效液相色譜法；追風(fēng)透骨膠囊；馬兜鈴酸A；限量檢查

追風(fēng)透骨膠囊為國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)收載的品種[1]。由制川烏、細(xì)辛、地龍等二十四味中藥組成, 具有通經(jīng)絡(luò)、祛風(fēng)濕、鎮(zhèn)痛祛寒等功效。用于風(fēng)寒濕痹、四肢痹痛、手足麻木等。標(biāo)準(zhǔn)中用高效液相色譜法(HPLC法)測(cè)定馬兜鈴酸A的限量, 但在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn), 該試驗(yàn)條件下有其他物質(zhì)的干擾, 影響結(jié)果的判斷。追風(fēng)透骨膠囊屬?lài)?guó)家基本藥物,國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局每年都會(huì)對(duì)每一種基本藥物進(jìn)行監(jiān)督抽查檢驗(yàn), 如果標(biāo)準(zhǔn)方法存在問(wèn)題, 那勢(shì)必會(huì)造成錯(cuò)誤的結(jié)論。因此, 本文改變了一些實(shí)驗(yàn)條件, 排除其他物質(zhì)的干擾, 更能準(zhǔn)確的反映藥品的質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥 Waters e2695 HPLC色譜儀, METTLER TOLEDO XS205十萬(wàn)分之一天平；水為Ⅰ級(jí)純化水, 乙腈為色譜純, 其他試劑均為分析純。馬兜鈴酸A對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所(批號(hào)：110746-200806)10批追風(fēng)透骨膠囊由湖南省回春堂藥業(yè)有限公司提供, 批號(hào)分別為20130514；20130305；20130308；20121213；20140521；20141203；20131108；20130206；20140409；20140709。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)方法

1.2.1.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 以碳十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料, 以乙腈-0.4%冰醋酸(35：65)為流動(dòng)相,流速：1.00 ml/min, 檢測(cè)波長(zhǎng)393 nm, 理論板數(shù)按馬兜鈴酸A峰計(jì)應(yīng)＞5000, 分離度＞1.5。

1.2.1.2 對(duì)照品溶液 精密稱(chēng)取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥至恒重的馬兜鈴酸A對(duì)照品約9 mg, 加甲醇約90 ml, 超聲處理5 min使溶解, 放冷, 加甲醇稀釋至100.00 ml, 搖勻, 再精密量取2 ml, 加甲醇稀釋至50.00 ml, 搖勻, 即得。

1.2.1.3 供試品溶液 精密取供試品細(xì)粉10 g, 置250 ml圓底燒瓶中, 加甲醇約80 ml回流提取1 h, 濾過(guò), 殘?jiān)蛹状?0 ml洗滌, 濾過(guò), 合并濾液, 水浴蒸干, 殘?jiān)?.1 mol/L氫氧化鈉溶液20 ml分次溶解洗滌, 轉(zhuǎn)入分液漏斗中, 再加氯仿40 ml分次溶解洗滌, 轉(zhuǎn)入分液漏斗中, 靜置使分層, 分取堿水層, 氯仿液再加0.1 mol/L氫氧化鈉溶液萃取4次,20 ml/次,棄去氯仿液, 合并堿水層, 再加5 mol/L鹽酸溶液20 ml, 加氯仿萃取5次,20 ml/次, 合并氯仿液, 加20 ml水洗2次, 氯仿液水浴蒸干, 殘?jiān)蛹状既芙庀♂屩? ml, 搖勻, 即得。標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定應(yīng)不得檢出馬兜鈴酸A。

1.2.2 試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的問(wèn)題 用Waters C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)分離, 照上述試驗(yàn)條件, 取上述對(duì)照品及供試品溶液各10.00 μl進(jìn)樣, 色譜圖中, 在馬兜鈴酸A峰保留時(shí)間附近, 分離出3個(gè)峰, 且其中1個(gè)峰與馬兜鈴酸A峰保留時(shí)間一致,不借助DAD檢測(cè)器提取的峰光譜圖或質(zhì)譜檢測(cè)儀進(jìn)行區(qū)別,結(jié)果無(wú)法判斷。其他色譜條件不變, 改用Gemini C18色譜柱、Shimadzu C18色譜柱及迪馬鉆石C18柱(規(guī)格均為4.6 mm×250 mm,5 μm)三種不同廠家的色譜柱, 結(jié)果均只有2個(gè)峰,且保留時(shí)間與馬兜鈴酸A不一致。

1.2.3 原標(biāo)準(zhǔn)方法系統(tǒng)適用性驗(yàn)證 本文對(duì)原方法做了精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性等試驗(yàn), 結(jié)果表明試驗(yàn)用的高效液相色譜儀和色譜柱均穩(wěn)定, 對(duì)照品溶液和樣品溶液均穩(wěn)定, 供試品的提取處理重現(xiàn)性好。但需分離物質(zhì)對(duì)色譜柱有一定的選擇, 待兩種物質(zhì)有的色譜柱能將其分開(kāi), 有的則不行。且分離開(kāi)后, 應(yīng)對(duì)流動(dòng)相的比例進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。

2 結(jié)果

2.1 調(diào)整流動(dòng)相 本文嘗試改變流動(dòng)相, 分別以甲醇-3%冰醋酸(68:32)[2], 甲醇-3%冰醋酸(35:65)[3], 乙腈-0.5%冰醋酸(40:60)[4], 乙腈-甲醇-1%冰醋酸溶液(15:15:70)[5],乙腈-0.4%冰醋酸(30:70)為流動(dòng)相, 流速1.00 ml/min, 以Waters C18柱、Gemini C18柱、Shimadzu C18柱及Dikma 鉆石C18柱(規(guī)格均為4.6 mm×250 mm,5 μm)進(jìn)行分離測(cè)定, 結(jié)果以流動(dòng)相乙腈-0.4%冰醋酸(30:70), Waters C18柱分離測(cè)定結(jié)果最好。見(jiàn)圖1。同時(shí)測(cè)定10批樣品, 結(jié)果均為未檢出,重現(xiàn)性好, 準(zhǔn)確度高。

2.2 改用二極管陳列檢測(cè)器 原標(biāo)準(zhǔn)的色譜條件, 用Waters C18柱分離得到的色譜圖中可疑峰保留時(shí)間雖然與馬兜鈴酸A保留時(shí)間接近, 但通過(guò)提取兩者光譜圖比較, 可疑峰光譜圖和對(duì)照品并不一致, 這樣也能判斷為未檢出馬兜鈴酸A。光譜圖見(jiàn)圖2。

圖1 色譜圖

圖2 光譜圖

3 討論

3.1 根據(jù)參考文獻(xiàn)和實(shí)驗(yàn), 供試品的制備：經(jīng)甲醇提取、堿化后用氯仿除去雜質(zhì)、酸化后氯仿提取, 用甲醇溶解定容,可消除其他物質(zhì)對(duì)馬兜鈴酸A的干擾[3]。

3.2 因本實(shí)驗(yàn)室不具有質(zhì)譜檢測(cè)儀, 所以未用LC/MS法來(lái)鑒別。如果有質(zhì)譜檢測(cè)儀, 可以通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用法做出更準(zhǔn)確的定性。有文獻(xiàn)記載[6]LC/MS法的測(cè)定條件：流動(dòng)相：乙腈-0.1%甲酸和0.1%四氫呋喃的水溶液；電噴霧離子源(ESI),負(fù)離子檢測(cè)；源電壓3.06 kV, 毛細(xì)管電壓：80 V, 管透鏡補(bǔ)償電壓(RF lens)：-0.5 V, 源溫度105℃, 錐孔氣流：72 L/h。

3.3 建議標(biāo)準(zhǔn)加一條：測(cè)定過(guò)程中, 如果有陽(yáng)性結(jié)果, 必須用DAD檢測(cè)器比較光譜圖或用液質(zhì)確認(rèn)。這樣可以準(zhǔn)確的判斷出結(jié)果。

[1]張瑗惠.基層食品藥品監(jiān)督管理局網(wǎng)站建設(shè)現(xiàn)狀與對(duì)策建議研究.山東大學(xué),2013.

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[4]李慶杰, 劉永強(qiáng), 常艷茹, 等.清腦止痛膠囊中馬兜鈴酸A限量測(cè)定.特產(chǎn)研究,2009(4):61-64.

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10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.15.196

2015-03-17]

417000 湖南省婁底市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)所