葉 蕾，賈 霜，潘文萍（.山東省千佛山醫(yī)院藥學(xué)部，濟(jì)南 25004；2.山東省千佛山醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，濟(jì)南 25004）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）以關(guān)節(jié)慢性侵蝕性炎癥為特征，基本病理變化為滑膜炎，表現(xiàn)為成纖維樣滑膜細(xì)胞（Fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS）過度增生、大量T 淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤以及血管翳的形成。FLS 作為炎癥性滑膜炎中組織損傷和基質(zhì)重塑的直接效應(yīng)細(xì)胞，可通過誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)、介導(dǎo)骨基質(zhì)降解、促進(jìn)破骨細(xì)胞分化或增殖等途徑參與RA 患者關(guān)節(jié)軟骨、骨質(zhì)的破壞[1-3]。因此，抑制FLS的異常增殖或誘導(dǎo)FLS分化成熟成為治療RA的新策略。

雷公藤是衛(wèi)茅科植物，具有抗炎、抑制免疫的作用，臨床上常用于治療RA、腎病綜合征、支氣管哮喘等，但其作用機(jī)制尚不完全清楚[4]。雷公藤甲素（Triptolide，TP）又稱雷公藤內(nèi)酯醇，是中藥雷公藤的有效單體成分，是雷公藤中活性最高的環(huán)氧化二萜內(nèi)酯化合物，臨床上常用于治療RA。有研究表明，TP 體外可誘導(dǎo)RA 患者FLS 的凋亡[5]，但相關(guān)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)較少，故本試驗(yàn)研究TP 對RA 患者體外FLS 增殖和細(xì)胞周期的影響，并探討其可能的作用機(jī)制，以期為TP治療RA提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

3100 SeniesⅡ水套CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、Labofuge 400 高速離心機(jī)、Multiskan MK3酶標(biāo)儀（美國Thermo 公司）；Epics XL流式細(xì)胞儀（美國Beckman coulter公司）；X70倒置顯微鏡[Olympus（中國）有限公司]。

1.2 藥品與試劑

雷公藤甲素（上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，批號：071206，純度：99.92%）；高糖DMEM 培養(yǎng)基（美國Gibco BRL公司）；胎牛血清（FBS，美國Gibco BRL公司），Ⅲ型膠原酶（美國Sigma 公司，批號：30H6812）；胰蛋白酶（上海華美公司）；二甲基亞砜（DMSO，上海生工生物工程有限公司）。

1.3 滑膜組織來源

滑膜組織取自山東省千佛山醫(yī)院骨關(guān)節(jié)科經(jīng)關(guān)節(jié)鏡行膝關(guān)節(jié)置換術(shù)或滑膜切除術(shù)的5 例RA 患者，RA 診斷均符合1987年美國風(fēng)濕病學(xué)會修訂的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎分類標(biāo)準(zhǔn)?；颊呔鶠榕?，年齡59～72 歲，平均年齡61 歲，X 線分期均為Ⅳ期。5 例患者均于術(shù)中切取膝關(guān)節(jié)滑膜組織。本試驗(yàn)經(jīng)山東省千佛山醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

2 方法

2.1 FLS的分離、培養(yǎng)與鑒定

采用組織塊原代培養(yǎng)法進(jìn)行FLS 原代培養(yǎng)，具體方法見文獻(xiàn)[5]。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，當(dāng)細(xì)胞生長至覆蓋底面＞80%時，吸棄培養(yǎng)液，用無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗2～3遍，加入胰蛋白酶/乙二胺四乙酸溶液于37 ℃消化約1 min。倒置顯微鏡下觀察，若大部分細(xì)胞胞質(zhì)回縮、胞體變圓、細(xì)胞間隙增大，則加入少量含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液終止消化，吸管吹打使細(xì)胞懸液混勻后移至15 ml 離心管中，以離心半徑為17 cm、1 000 r/min 離心5 min，棄上清，加入適量含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液吹打均勻后，按1∶3傳代，分別接種到培養(yǎng)瓶中，置于含5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞的生長情況及培養(yǎng)液的變化，每1～3 天更換培養(yǎng)液1 次。細(xì)胞培養(yǎng)至3～4代后，加入CD55抗體，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表達(dá)CD55陽性率，檢驗(yàn)細(xì)胞純度。

2.2 臺盼藍(lán)法對體外FLS計(jì)數(shù)及活力檢測

將第3～4 代細(xì)胞消化、離心、重懸后，取等體積細(xì)胞懸液與5 g/L的臺盼藍(lán)染液混勻，靜置染色3～4 min后計(jì)數(shù)。死細(xì)胞被染成淡藍(lán)色，活細(xì)胞拒染。根據(jù)以下公式進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并計(jì)算活細(xì)胞百分率：細(xì)胞總數(shù)＝（4大格細(xì)胞總數(shù)/4）×104×稀釋倍數(shù)；活細(xì)胞百分率（%）＝（4 大格活細(xì)胞總數(shù)/4 大格細(xì)胞總數(shù)）×100%。

2.3 MTT法檢測細(xì)胞的增殖抑制率

取對數(shù)生長期細(xì)胞，用含10% FBS 的DMEM 制備成1×105ml－1的細(xì)胞懸液，接種于96 孔培養(yǎng)板中，孵育24 h 后加入TP溶液，制成TP終濃度為0 nmol/ml的空白對照組和50、100、200 nmol/ml 的低、中、高濃度組，每個濃度設(shè)6 個復(fù)孔。分別置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后，加入5 mg/ml MTT 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清，每孔加DMSO 200 μl，振蕩至結(jié)晶完全溶解。用酶標(biāo)儀于490 nm波長處測定吸光度A，細(xì)胞的增殖抑制率（SF，%）＝（1－A試驗(yàn)組/A空白對照組）×100%。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡和周期

取對數(shù)生長期細(xì)胞制成5×105ml－1的細(xì)胞懸液，將試驗(yàn)分為4 組，TP 濃度分別為0（空白對照）、50、100、200 nmol/ml，每個濃度設(shè)6個復(fù)孔。各組細(xì)胞均于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后，取適量細(xì)胞，PBS 洗滌2 次，加入70%乙醇固定30 min，離心后PBS洗2次，棄上清，加入10 mg/ml的核糖核酸酶A 100 μl 和10 mg/ml 的溴化丙啶（PI）2 ml，4 ℃避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞的形態(tài)及鑒定結(jié)果

對原代培養(yǎng)的FLS進(jìn)行貼壁分離純化，細(xì)胞傳代培養(yǎng)，試驗(yàn)各間段均在倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。結(jié)果顯示，活細(xì)胞百分率＞98%，流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞表面CD55陽性表達(dá)率大于95%，因此可用3～4代細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

3.2 各組細(xì)胞增殖抑制率檢測結(jié)果

與空白對照組比較，各給藥組作用24、48、72 h后SF值均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；作用時間相同時，隨著藥物濃度的增加，SF 值增加；當(dāng)藥物濃度相同時，適當(dāng)延長作用時間，SF 值略有升高（除中濃度組72 h SF 值較48 h 略有下降），平均在24～48 h達(dá)抑制最大值。增殖抑制率測定結(jié)果見表1。

表1 增殖抑制率測定結(jié)果（，n＝6）Tab 1 The results of proliferation inhibitory rates（，n＝6）

表1 增殖抑制率測定結(jié)果（，n＝6）Tab 1 The results of proliferation inhibitory rates（，n＝6）

注：與空白對照組比較，＊P＜0.05Note：vs.blank control group，＊P＜0.05

3.3 各組細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期檢測結(jié)果

與空白對照組比較，中、高濃度TP 作用后G0/G1期細(xì)胞比例增加，S 期細(xì)胞比例減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；且高濃度時可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，作用48 h后出現(xiàn)顯著凋亡峰（見圖1）。各組細(xì)胞周期檢測結(jié)果見表2。

圖1 高濃度TP對FLS的流式細(xì)胞凋亡圖Fig 1 Flow cytometry apoptosis of FLS after treated with high concentration of TP

表2 細(xì)胞周期檢測結(jié)果（，n＝6，%）Tab 2 The results of cell cycle test（，n＝6，%）

表2 細(xì)胞周期檢測結(jié)果（，n＝6，%）Tab 2 The results of cell cycle test（，n＝6，%）

注：與空白對照組比較，＊P＜0.05Note：vs.blank control group，＊P＜0.05

4 討論

正常情況下，F(xiàn)LS可分泌纖維蛋白、膠原蛋白、軟骨素蛋白聚糖等多種結(jié)締組織的組成成分，在保持關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[6]。大量的研究表明，RA 患者的FLS 在慢性炎癥過程中被激活后出現(xiàn)細(xì)胞表型的顯著改變，在連續(xù)培養(yǎng)中這些細(xì)胞表現(xiàn)出高增殖率、接觸抑制缺失、組成性表達(dá)細(xì)胞因子mRNA 和錨定非依賴性細(xì)胞生長等特性[7]。FLS為RA患者炎癥性滑膜炎中組織損傷和基質(zhì)重塑的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞，抑制FLS增殖可有效減輕關(guān)節(jié)炎和減少骨侵蝕，從而達(dá)到治療RA的效果。

研究證明，TP可抑制炎癥關(guān)節(jié)滑膜組織中多種趨化因子、細(xì)胞因子mRNA及其相應(yīng)受體的表達(dá)[8-11]，抑制血清中炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子的水平升高[11]，抑制滑膜細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、金屬基質(zhì)蛋白酶9（MMP-9）等從而抑制血管翳增殖[12]。

筆者從RA患者膝關(guān)節(jié)分離滑膜組織，采用組織塊培養(yǎng)法得到的FLS，經(jīng)原代培養(yǎng)后，取第3～4代FLS用于試驗(yàn)。加入TP 作用24 h 后FLS 即開始出現(xiàn)生長明顯減慢，光鏡下可見細(xì)胞突觸回縮，細(xì)胞形態(tài)變不規(guī)則，細(xì)胞變圓甚至皺縮變小，核分裂相細(xì)胞較少，有的可見凋亡小體。這與周光偉等[5]研究結(jié)果相一致。不同濃度對FLS 的增殖均有抑制作用，并隨濃度的加大抑制作用增強(qiáng)，呈濃度依賴性；而與作用時間并無明顯的正相關(guān)關(guān)系，平均24～48 h均達(dá)作用最高峰。低劑量TP雖對FLS細(xì)胞增殖有抑制作用，但對其細(xì)胞周期無明顯影響。加大藥物濃度可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，使S 期細(xì)胞比例降低，G0/G1期細(xì)胞比例增加，抑制細(xì)胞有絲分裂，促進(jìn)細(xì)胞分化。

綜上，TP 對RA 患者體外培養(yǎng)的FLS 具有良好的抑制作用，高濃度TP 可誘導(dǎo)FLS 凋亡，但其作用機(jī)制不明，有待進(jìn)一步研究。

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