王紅日等

摘要：以酵母EGY48為材料，研究了不同培養(yǎng)時間（12、16、20、24、30h）、細胞狀態(tài)（OD600）、電擊電壓（600、800、1000、1200、1400V）及不同質粒DNA用量（1、2、5、10、15、20μg）對酵母電擊轉化效率的影響。結果表明：當培養(yǎng)時間為20h、OD600=1.4、電擊電壓為1000V、質粒用量為5μg時，該系統(tǒng)轉化效率最高，為后續(xù)高效文庫的篩選奠定了基礎。

關鍵詞：酵母；電擊轉化；轉化效率

中圖分類號：Q785文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2014）01-0029-03

酵母菌（Saccharomycescerevisiae）作為單細胞真核生物，是傳統(tǒng)食品工業(yè)的主要用菌，近年來更是低等真核生物基因工程表達的重要菌種。由于具有生長快、易于培養(yǎng)和遺傳操作、具有比大腸桿菌更完備的基因表達調控機制和對表達產(chǎn)物加工修飾及分泌的能力等優(yōu)點，酵母在基因工程的表達系統(tǒng)中日益受到重視。外源基因進入酵母菌一般采用遺傳轉化的方法，1978年Himmen等[1]和Beggs[2]分別報道了酵母菌原生質體轉化法，該方法轉化率較高，但需要脫去細胞壁進行轉化后再生，步驟比較繁瑣，不利于轉化子的快速制備。隨后Ito等[3]建立了完整酵母轉化法，該方法簡捷，但轉化率偏低。1985年，Karube等[4]和Hashimoto等[5]分別利用電擊法轉化酵母原生質體及完整細胞獲得成功后，電擊轉化法以其高轉化率、操作方便等優(yōu)點越來越受到重視?，F(xiàn)在，電轉化技術不斷提高，已被廣泛用于酵母細胞外源基因導入中[5～11]。本試驗以酵母EGY48為材料，研究了影響酵母電擊轉化的幾個因素，以期建立一套高效、簡便的酵母外源基因轉化系統(tǒng)，為進一步基因工程研究提供保障。

1材料與方法

1.1材料與試劑

酵母菌株：EGY48，為本實驗室保存；質粒：pLEXAD，為本實驗室保存。

YPD液體培養(yǎng)基：2%蛋白胨，1%酵母粉，2%葡萄糖；選擇培養(yǎng)基：SD/His-/Leu-培養(yǎng)基。各種培養(yǎng)用主要試劑和抗生素購自Promega公司；質粒提取試劑盒購自北京天根公司；其它化學藥品為國產(chǎn)分析純。

1.2試驗方法

1.2.1感受態(tài)酵母的制備挑取直徑為2～3mm的酵母單菌落于內有5mlYPD培養(yǎng)液的10ml搖管中，30℃、230～250r/min振蕩培養(yǎng)12～24h；取上述菌液0.5ml加入到內有500mlYPD培養(yǎng)液的1L三角瓶中，30℃、230～250r/min分別振蕩培養(yǎng)12、16、20、24、30h，測其OD600值；1500×g、4℃離心5min，棄上清，收集菌體；用500ml預冷的無菌水重懸；1500×g、4℃離心5min，棄上清，收集菌體；用250ml預冷的無菌水重懸；1500×g、4℃離心5min，棄上清，收集菌體；用20ml預冷的1mol/L山梨醇重懸；1500×g、4℃離心5min，棄上清，收集菌體；用1ml預冷的1mol/L山梨醇溶解，使終體積約為1.5ml；每管分裝80μl，備用。

1.2.2酵母電擊轉化取不同體積一定濃度的質粒DNA，使其終用量分別為1、2、5、10、15、20μg，分別加入80μl感受態(tài)細胞中，轉入0.2cm預冷的電擊杯中，冰上放置5min；采用伯樂電穿孔儀電擊，電壓分別設定600、800、1000、1200、1400V，電容25μF，電阻400Ω；后向電擊杯中立即加入1ml預冷的1mol/L山梨醇，轉入1.5ml無菌離心管中；取200～600μl涂平板，30℃倒置培養(yǎng)3～6d，直至出現(xiàn)菌落。

2結果與分析

2.1不同培養(yǎng)時間對酵母轉化率的影響

將酵母分別培養(yǎng)12、16、20、24、30h后進行轉化，此時電壓采用1000V，質粒DNA用量為2μg，其他條件均相同。統(tǒng)計結果（圖1）表明：不同培養(yǎng)時間對平均轉化率的影響較大，培養(yǎng)20h、OD600值約為1.4的酵母轉化效果比較理想，平均轉化率最高，可達3.62×105轉化子/μgDNA。

不同生長時期的酵母細胞對轉化率影響較大，本研究的結果顯示，處于對數(shù)生長中期的酵母細胞生長旺盛，該時期電擊轉化效果明顯高于穩(wěn)定期的細胞，推測可能是由于處于對數(shù)生長中期的酵母細胞壁結構疏松，更利于進行電擊轉化。對于感受態(tài)酵母的制備，建議現(xiàn)制現(xiàn)用，從而保證較高的轉化率。一般認為，電擊轉化是通過觸發(fā)細胞膜使其電通透性增大，瞬間形成小孔，從而使各種生物大分子進出細胞[14，15]。電壓較低時，細胞不容易瞬間形成微孔通道，質粒DNA等生物大分子難以進入細胞，無法完成轉化；電壓過高，則會導致大部分細胞因小孔形成較大，難以復原而死亡，降低了酵母細胞的存活率，也影響了轉化率。本試驗條件下，電壓為1000V時，酵母轉化率最大。質粒DNA的用量對電擊轉化率也有一定的影響，原因可能是當質粒DNA濃度較低時，電擊產(chǎn)生的細胞小孔可以允許大部分的DNA分子進入細胞；但當質粒DNA用量增大，超過最大容納值時，細胞能吸收的DNA分子達到極限飽和狀態(tài)，反而降低了轉化率。

根據(jù)本試驗方法，培養(yǎng)時間為20h、OD600=1.4、電擊電壓為1000V、質粒用量為5μg時，該系統(tǒng)轉化效率最為理想，可以滿足電擊轉化試驗要求，為后續(xù)高效文庫的篩選奠定了基礎。

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