王 慧，張曉紅，張 燕，楊苗苗，權(quán) 偉，戴尊孝（西安市精神衛(wèi)生中心，西安 710061）

隨著吸煙人數(shù)與日俱增，死于與吸煙有關(guān)疾病的人數(shù)也隨之增加[1]。為此，世界衛(wèi)生組織（WHO）提倡并于1996年向各國推薦了尼古丁替代法[2]。尼古丁替代法是采用非煙草的方式，向戒煙者提供小劑量安全性好的尼古丁制劑，使戒煙者尼古丁的攝取量達(dá)到最低，最終戒除香煙[3]。尼古丁是煙草的重要成分，研究表明，人體攝取尼古丁，反應(yīng)性及注意力一定程度有所提高，焦慮明顯降低[4]。尼古丁易透過人體皮膚，但其本身性質(zhì)不穩(wěn)定，很大程度上限制了其在藥物研發(fā)中的應(yīng)用。

乙醇脂質(zhì)體憑借其良好的包封率及柔性，可攜帶藥物進(jìn)入皮膚深層，是皮膚局部用藥較理想的載體[5]。為此，本實(shí)驗(yàn)研制了尼古丁乙醇脂質(zhì)體并通過體外透皮實(shí)驗(yàn)研究其體外釋藥及透皮行為。

1 材料

1.1 儀器

高效液相色譜系統(tǒng)（日本島津公司）；JEM-1200EX型透射電鏡（日本電子公司）；激光動態(tài)光散射儀（英國馬爾文儀器有限公司）；Tcs Sp2型激光共聚焦顯微鏡（德國徠卡公司）；RYJ-6B型藥物透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀（上海黃海藥檢儀器廠）；RC-3B藥物溶出儀（天津大學(xué)無線電廠）；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

尼古丁原料藥（重慶博騰制藥科技股份有限公司，批號：130211，純度：＞96%）；大豆磷脂（PC，常州四藥制藥有限公司，批號：1208S02，含量：90%）；羅丹明B（美國Sigma公司）；水為去離子雙蒸水。

1.3 動物

昆明種小鼠，♂，體質(zhì)量為18～20 g，由蘭州大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號為SCXK（甘）14-006。

透析袋（上海通善生物科技有限公司，截留分子質(zhì)量：8 000～14 000）。

2 方法與結(jié)果

2.1 尼古丁乙醇脂質(zhì)體的制備

采用注入法[6]制備尼古丁乙醇脂質(zhì)體。精密稱取尼古丁原料藥0.3 mg、磷脂適量、乙醇4.5 ml，溶解，置于磁力攪拌器上，在密閉條件下邊攪拌邊緩慢注入5.5 ml磷酸鹽緩沖液（PBS），攪拌30 min（整個過程溫度保持在45～55 ℃范圍內(nèi)）；超聲20 min后，冷卻至室溫，微孔濾過，即得尼古丁乙醇脂質(zhì)體。其中尼古丁含量為3%。采用透射電鏡觀察所制尼古丁乙醇脂質(zhì)體的外觀形態(tài)，結(jié)果顯示，尼古丁乙醇脂質(zhì)體外觀為均一穩(wěn)定的分散體系，大多數(shù)呈球形的雙分子層囊泡結(jié)構(gòu)，詳見圖1。

圖1 尼古丁乙醇脂質(zhì)體的電鏡照片（×110 000）Fig 1 SEM photograph of nicotine ethosome（×110 000）

2.2 尼古丁脂質(zhì)體和尼古丁乙醇溶液的制備

采用反相蒸發(fā)法制備尼古丁含量為3%的尼古丁脂質(zhì)體。將尼古丁原料藥溶于乙醇溶液中，制備尼古丁含量為3%的尼古丁乙醇溶液。

2.3 乙醇、磷脂用量對乙醇脂質(zhì)體粒徑和包封率的影響

由預(yù)試驗(yàn)可知，尼古丁乙醇脂質(zhì)體受乙醇用量（占處方量的比例，V/V）和磷脂用量（占處方量的比例，m/V）的影響最大。本試驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)考察0、25%、35%、45%乙醇和1%、2%、3%磷脂對尼古丁乙醇脂質(zhì)體粒徑和包封率的影響，粒徑采用激光動態(tài)光散射儀測定，結(jié)果見表1。

表1 乙醇、磷脂用量對尼古丁乙醇脂質(zhì)體粒徑和包封率的影響（）Tab 1 Effects of the amounts of ethanol and phospholipid on the particle size and encapsulation efficiency of the nicotine ethosome（）

表1 乙醇、磷脂用量對尼古丁乙醇脂質(zhì)體粒徑和包封率的影響（）Tab 1 Effects of the amounts of ethanol and phospholipid on the particle size and encapsulation efficiency of the nicotine ethosome（）

由表1可見，與不含乙醇的處方10比較，加入乙醇的脂質(zhì)體的粒徑明顯減小，包封率均增加。另外，固定乙醇濃度，增加磷脂含量，脂質(zhì)體的粒徑逐漸增大，包封率也隨之增加；固定磷脂含量，增加乙醇濃度，脂質(zhì)體的粒徑逐漸減小，包封率逐漸增加。研究表明，粒徑越小，包封率越大，脂質(zhì)體越易攜帶藥物經(jīng)皮滲透[7]。因此篩選乙醇脂質(zhì)體的處方為乙醇用量為35%，磷脂用量為3%。

2.4 尼古丁的含量測定

2.4.1 色譜條件 色譜柱：VP-ODS C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.02 mol/L醋酸銨-三乙胺（30 ∶60 ∶0.1，V/V/V），流速：1 ml/min；檢測波長：365 nm；進(jìn)樣量：20 μl。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取尼古丁20 μg，置于50 ml量瓶，甲醇溶解，得質(zhì)量濃度為400 μg/L的對照品溶液。用甲醇稀釋適量對照品溶液，制備成質(zhì)量濃度分別為6.25、12.5、25、50、75、100、200、400 μg/L的系列溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下方法進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y＝87 345x+35 671（r＝0.999 8）。結(jié)果表明，尼古丁檢測質(zhì)量濃度的線性范圍為6.25～400 μg/L。

2.4.3 精密度試驗(yàn) 精密量取適量尼古丁對照品溶液，用甲醇稀釋制備成低、中、高3種質(zhì)量濃度（6.25、50、200 μg/L）的溶液，分別于同日內(nèi)不同時間進(jìn)樣測定5次，考察日內(nèi)精密度；另每日測定1次，連續(xù)測定3 d，考察日間精密度。結(jié)果顯示，平均日內(nèi)RSD為2.03%（n＝5），平均日間RSD為2.18%（n＝3），表明該方法精密度良好。

2.4.4 回收率試驗(yàn) 將空白乙醇脂質(zhì)體置于5 ml量瓶，加入用甲醇稀釋的6.25、50、200 μg/L尼古丁溶液，渦旋混合器上充分振蕩混勻。取1 ml置于離心管中，10 000 r/min（離心半徑為6 cm）離心5 min，吸取上清液，微孔濾膜濾過，取20 μl進(jìn)樣測定峰面積。計算平均回收率為99.70%，RSD為0.91%，表明該方法回收率良好。

2.5 尼古丁乙醇脂質(zhì)體包封率測定

精密量取尼古丁乙醇脂質(zhì)體4 ml，溶解于10 ml乙醇中，搖勻，微孔濾膜濾過，取20 μl進(jìn)樣測定，計算尼古丁總含量（H1）。再精密量取尼古丁乙醇脂質(zhì)體4 ml，置于透析袋中，扎緊透析袋兩頭，放入100 ml含乙醇35%的PBS中，攪拌，達(dá)到平衡時間（6 h），量取透析液，微孔濾膜濾過，取20 μl進(jìn)樣測定峰面積，計算游離尼古丁含量（H2）。按公式計算尼古丁乙醇脂質(zhì)體的包封率（EE，%）＝（H1－H2）/H1×100%。

按“2.3”項(xiàng)下篩選的處方（磷脂、乙醇及尼古丁分別占處方量的3%、35%和3%）所制尼古丁乙醇脂質(zhì)體的包封率為（89.13±6.12）%，RSD＝0.28%（n＝3）。

2.6 尼古丁乙醇脂質(zhì)體的體外釋放

取尼古丁乙醇脂質(zhì)體、尼古丁脂質(zhì)體及尼古丁乙醇溶液各3 ml，均含尼古丁90 mg，分別加至預(yù)處理好的透析袋中，扎緊兩端袋口，固定于槳上[8]。釋放條件：pH 7.4的PBS 500 ml，37 ℃，100 r/min。分別于0、3、6、8、10、12、14、16、18、20、24 h時取樣2 ml，同時補(bǔ)充等量同溫的PBS。取樣液經(jīng)微孔濾膜濾過，取20 μl進(jìn)樣測定峰面積，計算累積釋放量，重復(fù)測定3次。3種制劑中尼古丁的累積釋放曲線見圖2。

由圖2可知，在釋放6 h時，尼古丁乙醇脂質(zhì)體累積釋放量為40%，而尼古丁脂質(zhì)體釋放量為62%，尼古丁乙醇溶液已達(dá)90%；經(jīng)過24 h，尼古丁乙醇脂質(zhì)體和尼古丁脂質(zhì)體中的尼古丁基本達(dá)到完全釋放。由此可見，尼古丁乙醇脂質(zhì)體具有明顯的緩釋作用。

2.7 離體皮膚滲透試驗(yàn)

2.7.1 離體小鼠皮膚的制備 取健康小鼠，飼養(yǎng)1周，剪去背部毛，斷頸處死，立即剝離背部皮膚，去除皮下組織，生理鹽水沖洗、浸泡，貯藏于4 ℃冰箱中備用。

圖2 3種制劑中尼古丁的累積釋放曲線（n＝3）Fig 2 Cumulative release curve of nicotine in 3 kinds of preparation（n＝3）

2.7.2 體外經(jīng)皮滲透試驗(yàn)[9]本試驗(yàn)在Franz擴(kuò)散池中進(jìn)行，供給室和接收室之間固定離體皮膚，有效滲透面積（擴(kuò)散池）為2.5 cm2，接收液為pH 7.4的PBS，接收室體積為6 ml。分別取尼古丁乙醇脂質(zhì)體、尼古丁脂質(zhì)體和尼古丁乙醇溶液各0.3 ml，滴于與接收液接觸的離體皮膚上，并將接收池置于（36±2）℃恒溫水浴中，電磁攪拌（350 r/min）。分別于0、0.5、1、2、3、6、8、12、24 h精密量取2 ml接收液，同時補(bǔ)充等量恒溫的接收液。取樣液經(jīng)微孔濾膜濾過，取20 μl進(jìn)樣測定含量，計算累積滲透量。重復(fù)測定3次。3種制劑中尼古丁的累積滲透曲線見圖3。

圖3 3種制劑中尼古丁的累積滲透曲線（n＝3）Fig 3 Cumulative penetrating curve of nicotine in 3 kinds of preparation（n＝3）

由圖3可知，12 h時尼古丁乙醇脂質(zhì)體的累積滲透量最高（45%），尼古丁脂質(zhì)體的累積滲透量最低（15%），但12 h時3種制劑的累積滲透量均達(dá)飽和。

2.8 滲透深度檢測[10]

將含有0.03%羅丹明B的熒光劑分別加入尼古丁脂質(zhì)體、尼古丁乙醇溶液和尼古丁乙醇脂質(zhì)體中。將以上3種含有熒光劑的制劑及尼古丁乙醇脂質(zhì)體分別均勻涂抹于同一只小鼠背部皮膚上，涂藥面積約2 cm2。給藥后12 h處死小鼠，取皮，立即用生理鹽水沖洗涂藥區(qū)域，剪取涂藥中心區(qū)域約1 mm2，用共聚焦激光掃描顯微鏡對離體皮膚斷層進(jìn)行掃描并繪制曲線。4種制劑的共聚焦激光掃描圖見圖4，熒光強(qiáng)度-皮膚深度曲線見圖5。

由圖4、圖5可見，尼古丁乙醇脂質(zhì)體、尼古丁乙醇溶液及尼古丁脂質(zhì)體在離體皮膚中最大熒光強(qiáng)度分別為168、75、36 AU，滲透深度分別為175、156、80 μm，而尼古丁乙醇脂質(zhì)體（對照）幾乎無熒光。表明與乙醇溶液和脂質(zhì)體比較，乙醇脂質(zhì)體可攜帶尼古丁進(jìn)入皮膚深層。

圖4 4種制劑的共聚焦激光掃描圖A.含羅丹明B的尼古丁脂質(zhì)體；B.含羅丹明B的尼古丁乙醇溶液；C.含羅丹明B的尼古丁乙醇脂質(zhì)體；D.尼古丁乙醇脂質(zhì)體Fig 4 Confocal laser scanning micrograms of 4 kinds of preparationsA.rhodamine B-containing nicotine ethosome；B.rhodamine B-containing nicotine/ethanol solution；C.rhodamine B-containing nicotine ethosome；D.nicotine ethosome

圖5 4種制劑的熒光強(qiáng)度-皮膚深度曲線（n＝5）Fig 5 Curves of fluorescence intensity-penetration depth in skin of 4 kinds of preparations（n＝5）

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將尼古丁乙醇脂質(zhì)體封裝于錐形瓶中，放于冰箱（4 ℃）及室溫下，每個月用動態(tài)光散射法測量樣品的粒徑及粒徑分布，同時電鏡觀察乙醇脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)，連續(xù)測定3個月。結(jié)果表明本品穩(wěn)定性良好。

3 討論

注入法制備的尼古丁乙醇脂質(zhì)體形狀均勻，平均粒徑為105 nm。當(dāng)磷脂與乙醇占處方量的3%和35%時為最佳處方，此時所制脂質(zhì)體包封率最高（89.13±6.12）%，且室溫及冰箱（4 ℃）放置3個月穩(wěn)定性良好。體外釋放實(shí)驗(yàn)表明，乙醇脂質(zhì)體有明顯的緩釋作用。體外經(jīng)皮滲透實(shí)驗(yàn)表明，乙醇脂質(zhì)體透過離體皮膚進(jìn)入PBS中的藥量分別是乙醇溶液及脂質(zhì)體的1.45倍和2.8倍。共聚焦激光掃描顯微電鏡試驗(yàn)表明，與乙醇溶液及脂質(zhì)體相比，乙醇脂質(zhì)體可攜帶藥物進(jìn)入皮膚深層，同時增大藥物在皮內(nèi)的滯留量。因而，尼古丁乙醇脂質(zhì)體有望開發(fā)成為戒煙的有效制劑。

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