劉小燕，李朝品，朱 濤（.安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，安徽淮南 300；.皖南醫(yī)學(xué)院，安徽蕪湖 400）

中國圓田螺（Cipangopaludina chinensis）俗稱螺螄、田螺、田嬴、香螺，是在我國廣泛分布的淡水貝類之一?！侗静菥V目》記載：“田螺利濕清熱，止渴醒酒，利大小便；治腳氣、黃疸”。近年，有關(guān)貝類多糖的研究證實其具有抗腫瘤、抗病毒、抗凝血、降血脂、降血糖等多種生物學(xué)活性[1-4]，引起了學(xué)術(shù)界關(guān)注。

貝類多糖作為一種動物多糖，目前常用的提取方法有熱水浸提法、堿解法、酶解法、酶堿結(jié)合法等[5]。本課題組前期對中國圓田螺多糖的水提工藝進(jìn)行了相關(guān)研究，已經(jīng)通過水提法成功獲得貝類多糖，但是水提工藝費(fèi)時較長（6 h）且得率不高（平均得率2.58%）[6]。動物多糖在提取過程中的關(guān)鍵之處是在不破壞多糖結(jié)構(gòu)和活性的前提下有效去除蛋白，而酶解蛋白的作用較好且溫和。為了進(jìn)一步提高提取效率，本研究嘗試采用木瓜蛋白酶提取中國圓田螺多糖。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了酶濃度、pH、酶解溫度及酶解時間的正交試驗，優(yōu)選最優(yōu)提取條件，以期建立一種簡便、快速、有效的提取方法，為進(jìn)一步研究中國圓田螺多糖的生物活性奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

1.2 原料、藥品與試劑

中國圓田螺，于2014年7月在安徽省淮南市焦崗湖采集，經(jīng)皖南醫(yī)學(xué)院李朝品教授鑒定為真品；葡萄糖對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號：13041223，純度：≥98%）；木瓜蛋白酶（北京化學(xué)試劑公司，批號：201402，酶活性：2 000 u/mg）；無水乙醇、丙酮均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取工藝流程

新鮮活體中國圓田螺，洗凈，去殼→取螺肉粉粹勻漿→離心（離心半徑16 cm，轉(zhuǎn)速4 000 r/min，30 min），棄上清→加40倍體積蒸餾水→木瓜蛋白酶浸提（不同酶濃度、pH、溫度及時間下浸提）→升溫至90 ℃滅酶→過濾→75%乙醇沉淀→漂洗→干燥→多糖粗品。其中木瓜蛋白酶浸提液制備方法為：稱取木瓜蛋白酶10 g溶于pH 6.5磷酸鹽緩沖溶液中，轉(zhuǎn)至100 ml量瓶定容，制備成100 mg/ml的酶液，酶解時調(diào)節(jié)不同初始pH。

2.2 中國圓田螺多糖得率計算

多糖粗提物得率（%）＝（多糖粗提物質(zhì)量/樣品質(zhì)量）×100%。式中，多糖粗提物質(zhì)量即稱取的多糖粗品質(zhì)量（g）；樣品質(zhì)量即中國圓田螺螺肉質(zhì)量（g）。

2.3 單因素試驗

本試驗選取了影響酶法提取中國圓田螺粗多糖得率的4個主要因素，即酶液初始pH值、酶濃度[木瓜蛋白酶（g）/中國圓田螺螺肉（g）×100%]、酶解溫度及酶解時間進(jìn)行單因素試驗。每個因素不同水平下，均取中國圓田螺螺肉200 g，按照上述工藝流程提取，分別計算中國圓田螺粗多糖得率。

2.3.1 酶濃度的篩選 在酶解溫度55 ℃、pH 6.5、酶解時間1 h的條件下，設(shè)置5個酶濃度（梯度分別為0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%），考察不同酶濃度對多糖得率的影響，結(jié)果詳見圖1A。

圖1 各因素對多糖得率的影響A.酶濃度；B.pH；C.酶解溫度；D.酶解時間Fig 1 Effects of the factors on the yield of polysaccharidesA.enzyme concentration；B.pH；C.enzymolysis temperature；D.enzymolysis time

由圖1A可知，多糖得率在酶濃度為0.1%～1.0%時增加較為明顯，而當(dāng)酶濃度繼續(xù)增大時，多糖得率的增加趨勢趨于平緩?？赡茉驗槠鸪蹼S著酶濃度的增大，使多糖能快速有效地與蛋白質(zhì)分離，但當(dāng)酶濃度逐漸趨于飽和時，酶解反應(yīng)也會隨之趨于平緩。所以，酶濃度確定為1.0%左右。

2.3.2 pH的篩選 在酶解溫度55 ℃、酶濃度1.0%、酶解時間1 h的條件下，設(shè)置5個酶液初始pH（分別為4.5、5.5、6.5、7.5、8.5），考察不同pH對多糖得率的影響，結(jié)果詳見圖1B。

由圖1B可見，酶液pH的改變對多糖得率的影響較大。在pH為4.5～7.5范圍內(nèi)，多糖的得率隨著pH的增大而升高；但在7.5之后，當(dāng)繼續(xù)增大pH時，多糖的得率反而開始下降。這可能是酶活力的適宜pH范圍及糖肽鍵對堿的不穩(wěn)定性共同作用的結(jié)果。因此，酶提法的pH選為7.5左右。

鑒于版權(quán)保護(hù)僅“延及表達(dá)，而不延及思想、過程、操作方法或數(shù)學(xué)概念等類似對象”②世界貿(mào)易組織《與貿(mào)易有關(guān)的知識產(chǎn)權(quán)協(xié)定》第9條第2款。，如果自然人僅在思想層面對人工智能創(chuàng)作進(jìn)行干預(yù)則不構(gòu)成版權(quán)法意義上的參與創(chuàng)作。例如，“人工智能創(chuàng)作”程序的設(shè)計者和操作者如果僅在算法設(shè)計和參數(shù)輸入方面對人工智能的創(chuàng)作規(guī)則和風(fēng)格等思想層面的要素進(jìn)行控制，則并不構(gòu)成參與創(chuàng)作，對人工智能創(chuàng)作結(jié)果的思想層面的人工干預(yù)也不影響其構(gòu)成純粹“人工智能創(chuàng)作”。

2.3.3 酶解溫度的篩選 在酶濃度1.0%、pH 6.5、酶解時間1 h的條件下，設(shè)置5個溫度（梯度分別為40、45、50、55、60 ℃），考察不同酶解溫度對多糖得率的影響，結(jié)果詳見圖1C。

由圖1C可知，多糖的得率在40～55 ℃時隨著溫度的升高而升高，但繼續(xù)升高溫度，多糖得率反而下降。其可能原因是酶促反應(yīng)剛開始時會隨著溫度的升高而加快，而當(dāng)溫度高于最適反應(yīng)溫度后，酶活力反而減小，多糖得率也會隨之下降。因此，酶解溫度宜確定為55 ℃左右。

2.3.4 酶解時間的篩選 在酶濃度1.0%、pH 6.5、酶解溫度55 ℃條件下，設(shè)置5個酶解時間（分別為1、2、3、4、5 h），考察不同酶解時間對多糖得率的影響，結(jié)果詳見圖1D。

由圖1D可知，酶解反應(yīng)到3 h時達(dá)到最大得率，再繼續(xù)延長反應(yīng)時間，多糖得率反而呈平緩下降趨勢。可見反應(yīng)進(jìn)行到3 h時，多糖已充分解離溶出；再繼續(xù)反應(yīng)，某些多糖可能又會與蛋白質(zhì)大分子結(jié)合發(fā)生沉淀，導(dǎo)致得率略有下降。綜合考慮，酶解時間以3 h左右為宜。

2.4 正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，每個因素選取3個水平，因素與水平見表1；在課題組前期建立的成熟水提醇沉工藝基礎(chǔ)上，選擇多糖得率為單一指標(biāo)，對酶濃度、pH、酶解溫度與酶解時間選用L9（34）正交表設(shè)計試驗進(jìn)行各因素水平的優(yōu)選，從而確立酶法最優(yōu)提取條件，試驗安排及結(jié)果見表2；方差分析結(jié)果見表3。正交試驗安排表中每個組合下，均取中國圓田螺螺肉200 g，同樣按照“2.1”項工藝流程提取后分別計算中國圓田螺粗多糖得率。

表1 因素與水平Tab 1 Factors and levels

由表2可見，影響酶法提取中國圓田螺多糖因素的主次順序為B＞A＞C＞D，即pH＞酶濃度＞酶解溫度＞酶解時間；從表3的方差分析可見，B因素各水平之間有顯著性差異（P＜0.05），A因素對多糖得率有一定影響，C因素和D因素在本次試驗各水平下對多糖得率沒有顯著影響。綜合考慮，最優(yōu)工藝為A2B1C2D2，即酶濃度1.0%、pH 7.0、酶解溫度55 ℃、酶解時間3.0 h。

2.5 優(yōu)選工藝的驗證

由于正交試驗具有信息丟失現(xiàn)象，并不能包含所有組合[7]，在本試驗的安排中，A2B1C2D2不在所列正交試驗之內(nèi)。為此筆者又對優(yōu)選工藝進(jìn)行了驗證試驗，按A2B1C2D2組合進(jìn)行3次提取試驗。結(jié)果顯示，多糖平均得率為4.98%（RSD＝2.51%，n＝3），高于其他組合。

表2 正交試驗設(shè)計與結(jié)果Tab 2 Design and results of orthogonal test

表3 方差分析結(jié)果Tab 3 Results of variance analysis

2.6 多糖含量測定方法學(xué)考察

為進(jìn)一步驗證該工藝的提取質(zhì)量，筆者對所得粗多糖的多糖含量進(jìn)行了測定。采用苯酚-硫酸法[8-9]測定多糖含量，選取葡萄糖為對照品制備對照品溶液，以對照品溶液質(zhì)量濃度為x、吸光度為y繪制多糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：y＝11.81x－0.006（r2＝0.999 3），葡萄糖檢測質(zhì)量濃度線性范圍為0.02～1.0 mg/ml。同時，按相應(yīng)方法進(jìn)行了精密度、穩(wěn)定性和回收率試驗。結(jié)果，精密度試驗中吸光度的RSD為2.66%（n＝5）；穩(wěn)定性試驗中，取試樣120 min內(nèi)（前60 min每10 min測1次，后60 min每30 min測1次）吸光度的RSD為2.53%（n＝8）；樣品回收率試驗中，平均回收率為99.67%（RSD＝1.03%，n＝3）。上述結(jié)果表明方法學(xué)考察結(jié)果均符合要求。

2.7 多糖提取質(zhì)量考察及最優(yōu)工藝參數(shù)的確定

精密量取粗多糖10 mg置于10 ml量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度得供試品溶液。取供試品溶液2 ml，于490 nm波長處測定吸光度，代入回歸方程計算多糖濃度（c）。按公式：多糖含量（%）＝c×D/m×100（式中：m為多糖樣品質(zhì)量，D為多糖的稀釋倍數(shù)）計算多糖含量，得平均含量為73.54%（RSD＝1.36%，n＝3），結(jié)果表明該工藝穩(wěn)定可行。故在本試驗中確定木瓜蛋白酶提取中國圓田螺多糖的最優(yōu)工藝參數(shù)為A2B1C2D2，即酶濃度1.0%、pH 7.0、酶解溫度55 ℃、酶解時間3.0 h。

3 討論

蛋白酶水解法提取動物多糖是一種較為理想的方法，蛋白酶可作用的肽鍵范圍廣泛，可使蛋白質(zhì)充分水解，迅速將糖類解離[10]。常用的蛋白酶有木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶等。筆者選用了木瓜蛋白酶進(jìn)行中國圓田螺多糖的提取，評價多糖提取效果的指標(biāo)主要是得率和多糖含量。在前期研究基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)提取所得多糖含量較穩(wěn)定，主要是水提用時較長且得率不高（平均得率2.58%）。針對此，在本試驗設(shè)計中主要選取了多糖得率作為評價指標(biāo)來進(jìn)行工藝優(yōu)選。通過試驗確定了木瓜蛋白酶提取中國圓田螺多糖的最優(yōu)工藝條件。與前期優(yōu)選的水提工藝（醇沉濃度75%、浸提溫度60 ℃、料液比1 ∶2，浸提時間6 h）相比，酶法浸提時間縮短一半且得率亦有所提高[6]；同時，酶提法所得粗多糖含量（73.54%）亦高于水提法所得含量（65.85%）。由此可見，優(yōu)選的酶法提取工藝可有效提高多糖的提取效率和提取質(zhì)量。

在試驗中發(fā)現(xiàn)pH對多糖得率的影響較為顯著，單因素試驗中顯示提取最優(yōu)pH為7.5，正交優(yōu)選的pH為7.0。理論上酶活力的最適pH范圍通常在7.0以內(nèi)，而試驗結(jié)果卻顯示在中性偏堿的條件下得率較高。因此，應(yīng)同時考慮堿性環(huán)境利于糖肽鍵的解離以及酶活性適宜的pH范圍這兩個因素的共同作用[11]。王長云等[12]研究也發(fā)現(xiàn)，在不改變糖鏈結(jié)構(gòu)的前提下，采用酶堿結(jié)合法對動物多糖的釋放非常有效。莫開菊等[13]研究發(fā)現(xiàn)，采用堿液和木瓜蛋白酶聯(lián)合預(yù)處理原料后亦可以提高葛仙米多糖的提取率。鑒于此，在后續(xù)的研究中可以考慮先用堿處理樣品，再用蛋白酶水解，可能會更有效地提高多糖得率。

通過驗證試驗表明，優(yōu)選的酶法提取工藝簡便有效、穩(wěn)定可行。該工藝的建立為進(jìn)一步研究中國圓田螺多糖的結(jié)構(gòu)、生物活性及構(gòu)效關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

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