陳玲，蔣桃珍

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

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IBDV B87株不同雞胚代次毒力和細胞嗜性差異的比較研究

陳玲，蔣桃珍*

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

對IBDV疫苗株 B87的雞胚傳代毒E2和E6的VP2片段進行測序和分析，發(fā)現(xiàn)兩個代次毒株VP2序列存在7個氨基酸的差異，即S76G、 L217S、 Q253H、 D279N、 A284T、 I294L、 S330R。將E2和E6接種CEF細胞，E2不能在CEF上增殖，而接種E6的CEF細胞可以產(chǎn)生明顯的CPE，說明兩個毒株對CEF的嗜性不同。分別將E2和E6接種3周齡SPF雞，對雞的毒力進行比較，接種后第7 天開始，E2出現(xiàn)囊體比下降，BB指數(shù)明顯低于E6，相應的法氏囊切片經(jīng)HE染色后，接種E2的法氏囊濾泡萎縮嚴重，結(jié)構(gòu)松散，E6只有部分濾泡出現(xiàn)萎縮，濾泡間隔基本正常，說明E2，E6對SPF雞法氏囊毒力存在明顯差異。根據(jù)兩個毒株的VP2序列差異以及相關(guān)研究，推測Q253H/D279N/A284T三個位點突變可能是IBDV毒力和細胞嗜性差異的分子基礎(chǔ)，但另外4個位點也可能對IBDV毒力差異產(chǎn)生影響。

傳染性法氏囊病毒；VP2基因；毒力差異；細胞嗜性

傳染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease, IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus, IBDV)引起的雛雞的一種急性、高度接觸性傳染病，給世界養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失[1]。VP2是IBDV的主要宿主保護性抗原，病毒的抗原變異、細胞嗜性和毒力強弱都與VP2的高變區(qū)密切相關(guān)，但是具體的毒力位點尚存在爭議[2-3]。

1987年以來，超強毒株(very virulent IBDV, vvIBDV)的出現(xiàn)和流行使得IBDV成為危害世界養(yǎng)禽業(yè)的重要病源之一[4]，隨著反向遺傳學的發(fā)展，尤其是1996年vvIBDV反向遺傳操作系統(tǒng)的建立[5]，越來越多的研究集中在vvIBDV的細胞嗜性和毒力位點上，取得了較大的進展，但具體的毒力位點仍沒有確定。本研究從中等毒力疫苗株B87入手，通過分析不同雞胚傳代毒株E2和E6的VP2序列變化，比較兩個毒株細胞嗜性和對SPF雞毒力差異，探究IBDV的細胞嗜性和毒力位點，對于明確IBDV毒力變異的分子基礎(chǔ)，探索IBDV致弱的方法和疫苗研發(fā)具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 種毒 IBDV B87 E2 (AV140 1987.05), E6(AV140 2010.12)為本所保藏。

1.2 SPF雞和雞胚 三周齡SPF雞和SPF雞胚均購自北京梅里亞維通公司。

1.3 菌株、載體和主要試劑 大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞、RNA提取試劑盒、DNA Marker為Takara產(chǎn)品；Reverse Transcription System為Invitrogen公司產(chǎn)品；pfu高保真聚合酶為Promega公司產(chǎn)品；Zero-TOPO載體購于Clonesmarter公司; 瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒為Omega產(chǎn)品; DMEM/F12(1∶1), Foetal Bovine Serum為 GIBCO產(chǎn)品。

1.4 PCR 引物設計和合成根據(jù)GeneBank 中IBDV B87株VP2序列，利用引物設計軟件Primer 5.0，在A片段的上半段設計一對引物(表1)，由上海立菲生物科技有限公司合成。

表1 VP2擴增引物

1.5 IBDV基因組RNA的提取 參照Takara MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0說明書進行。

1.6 RT-PCR 根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，用隨機引物作為反轉(zhuǎn)錄引物，對提取的RNA進行反轉(zhuǎn)錄。以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，以A5/A3為引物進行PCR擴增。反應體系：10×Buffer 5 uL，dNTP 4 uL，A5、A3(10 umol/L)各2 uL，模板5 uL，pfu 0.5 uL，ddH2O 31.5 uL；反應條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 40 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，30個循環(huán)；72 ℃10 min。取5 uL PCR產(chǎn)物，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR擴增結(jié)果。

1.7 PCR產(chǎn)物的克隆和鑒定 將PCR產(chǎn)物回收后，與pCloneEZ-TOPO載體連接，轉(zhuǎn)化到JM109細胞，取100 uL涂布含有氨芐的LB瓊脂，37 ℃過夜培養(yǎng)。利用菌落PCR的方法鑒定重組子，挑選陽性克隆送往上海立菲生物技術(shù)有限公司測序。

1.8 E2、E6在CEF上的增殖 按照《中國獸藥典》中雞胚成纖維細胞的制備方法，制作CEF細胞，分裝到T25細胞瓶中，細胞密度為106/mL。將E2和E6毒株稀釋100倍，分別取1 mL同步接種9 mL CEF細胞，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)72 h。

1.9 E2、E6對SPF雞的毒力比較 75只三周齡SPF雞隨機分成三組，每組25只，第一組和第二組作為試驗組，其余為對照組；分別將E2和E6進行10×稀釋，點眼接種25只SPF雞，0.2 mL/只；在接種后3 d、7 d、14 d和21 d，每組取5只SPF雞致死后，稱取雞重，碘酊涂抹后采囊，觀察有無明顯病變，稱取法氏囊重量，并收集不同時間的法氏囊，保存在10%中性福爾馬林液中，用于制作病理切片。

2 結(jié)果與分析

2.1 E2、E6 VP2序列 比較從E2和E6 VP2氨基酸水平系統(tǒng)進化樹(圖1)可以看出，E2和E6位于不同的分支上，E6與弱毒株處于同一進化群，而E2則與經(jīng)典毒株親緣關(guān)系更近一些。

E2和E6VP2氨基酸序列差異如表2所示。E2和E6在VP2上有7個氨基酸差異，其中253、279和284是目前研究最多的三個位點，與IBDV的毒力和細胞嗜性密切相關(guān)；294I是vvIBDV的特征性氨基酸之一；330位于富含絲氨酸的七肽區(qū)(S-W-S-A-S-G-S)，該區(qū)域通過氫鍵影響分子內(nèi)部或分子間的相互作用從而影響毒力；另外兩個位點76和217，目前沒有相關(guān)文獻報道。

D78、Gt、PBG-98、P2、Cu1、JD1為弱毒株; STC、A-BH83、52/70、Cu-1wt為經(jīng)典毒株; GLS、variant E為變異株;IBDVks、UK661、D6948、OKYM、HK46為超強毒株;2512為中等毒力疫苗株

表2 E2和E6VP2上存在差異的氨基酸位點

2.2 E2和E6對CEF細胞嗜性比較 E6在接種CEF后24 h，開始出現(xiàn)細胞病變，細胞團聚，碎裂，折光性增強，呈砂礫狀，48 h細胞病變加??；E2在接種后72 h，一直沒有出現(xiàn)CPE。結(jié)果說明E2和E6對CEF細胞嗜性存在差異，E6可以在CEF上增殖，但是E2不能適應CEF培養(yǎng)。

2.3 E2和E6對SPF雞的毒力比較 實驗過程中，所有的SPF雞均沒有出現(xiàn)死亡或者IBD的典型臨床癥狀，接種后3 d，法氏囊均沒有出現(xiàn)膠凍樣水腫、出血等法氏囊強毒感染后的特征性病理變化，接種兩個代次毒的法氏囊大小也與正常對照相似。但接種后7d開始，E2代接種雞法氏囊明顯萎縮，其兩個代次毒接種后不同時間的囊體比和BB指數(shù)分別見圖2和圖3。

圖2 接種E2、E6的SPF雞囊體比

BB指數(shù)低于0.7表示法氏囊萎縮

圖2結(jié)果顯示，E2與E6株在接種后3 d，囊體比與對照沒有差異，E6株在接種后14 d出現(xiàn)短暫性的法氏囊萎縮，21 d時恢復正常；E2株從接種后7 d開始，囊體比明顯下降。

從圖3可以看出，與囊體比指標一致，E2與E6株在接種后3 d時，BB指數(shù)相同。E6株在接種后第14天BB指數(shù)為0.69，略低于0.7，其余時間點均高于0.7。E2株從第7天開始，BB指數(shù)明顯下降，維持在0.3左右。

2.4 法氏囊的病理組織學變化 結(jié)果見圖4。接種E6的SPF雞在第3天法氏囊部分濾泡出現(xiàn)輕微萎縮，接種后7 d, 濾泡淋巴細胞開始流失，濾泡間隔增寬，第14天開始恢復，21 d基本正常。E2在接種后3 d少量濾泡開始萎縮，髓質(zhì)中淋巴細胞出現(xiàn)流失，7 d和14 d濾泡間結(jié)締組織增生，間隔變寬，濾泡變小，大量淋巴細胞流失，21 d萎縮開始恢復。

圖4 E2、E6和對照組在接種SPF雞后3 d、7 d、14 d和21 d法氏囊HE染色圖(10×)

3 討論

晶體學結(jié)構(gòu)表明每一個VP2蛋白亞單位分為base(B)、shell(S)和projection(P)三個結(jié)構(gòu)域，B和S分別由相對保守的VP2的N端和C端構(gòu)成，而P則是由VP2的可變區(qū)(aa206～350)構(gòu)成。通過對大量的野毒株VP2序列進行比對，Van den Berg等[6]認為IBDV的VP2的可變區(qū)可以看做是vvIBDV在演化系譜中的一種分子標志，VP2可變區(qū)的氨基酸變異可能會造成IBDV毒力和細胞嗜性的變化。

IBDV在雞體傳代后毒力會增強，而在雞胚和細胞上傳代后毒力會減弱[7]。本研究選擇中等毒力疫苗株在雞胚上傳代后的E2和E6毒株，測序發(fā)現(xiàn)其VP2上氨基酸存在較大差異。通過接種三周齡SPF雞，發(fā)現(xiàn)兩個毒株對法氏囊造成的萎縮程度明顯不同，E6代毒株對于SPF雞的毒力比E2代毒株弱。

VP2片段測序分析發(fā)現(xiàn)，E2與E6在VP2上存在7個位點的差異，即S76G、L217S、Q253H、D279N、A284T、I294L、S330R。Yamaguchi[2]、Brandt[8]、Van loon[9]等的研究表明，Q253H、D279N和A284T三個位點與病毒毒力密切相關(guān)。根據(jù)VP2片段的多序列比對結(jié)果，發(fā)現(xiàn)位于VP2 P結(jié)構(gòu)域頂端的PDE(aa240～265)和PFG(aa270～293)兩個區(qū)域可能與IBDV毒力相關(guān)[10]，而253、279和284三個位點正好位于PDE和PFG上，253位點由線性的氨基酸Q變成環(huán)形的H以及284位由非極性氨基酸A變成極性的T都有利于β轉(zhuǎn)角的形成，從而改變VP2的構(gòu)象[11]。Yamaguchi將253H的疫苗株在雞體內(nèi)連續(xù)傳代后會發(fā)生H253Q的變異，并且變異后毒力明顯增強；Jackwood等[12]研究發(fā)現(xiàn)，H253Q/N的突變可以顯著增強弱毒株的毒力，與Yamaguchi等[2]的研究結(jié)果一致；宮世玲等[13]將兩株弱毒株在機體內(nèi)連續(xù)傳代6次，也發(fā)現(xiàn)了同樣的規(guī)律。本研究中的B87 E2和E6代毒株也存在Q253H、D279N和A284T的變異，但由于還有其他4個位點的差異，所以不能確定接種E2株SPF雞法氏囊的變化是否只是由這3個位點引起。

294I是IBDV超強毒株的特征性氨基酸位點[14]，該位點的突變可能與毒力差異相關(guān)；VP2的可變區(qū)有兩個親水峰，A(aa 210～215)和B(312～324)，這兩個親水峰編碼序列的突變與抗原變異和血清I型毒株的毒力相關(guān)[17]，因此L217S的突變也可能也會造成毒力下降，但需要進一步的研究證實；另外一個位點S76G位于VP2的N端的保守區(qū)，對毒力影響不大；Heine[7]在比對了強毒株和能適應CEF的低致病性毒株的VP2序列后，認為富含絲氨酸的七肽區(qū)S-W-S-A-S-G-S(aa 326～332)是高致病性毒株的保守序列，該區(qū)域可能通過氫鍵改變分子間或分子內(nèi)的相互作用從而影響毒力，但Yamaguchi等[2]在比對超強毒株OKYM及其細胞適應毒株OKYMT后，發(fā)現(xiàn)這兩個毒株都有S-W-S-A-S-G-S七肽序列，因此，330位S到R的突變或許并不影響毒力。

將兩個毒株同時接種CEF，E6可以在CEF上產(chǎn)生CPE，E2則不能在CEF上增殖，說明E2和E6株對CEF的嗜性不同。研究表明，VP2的氨基酸位點253、279和284與細胞嗜性有關(guān)，Q253H和A284T同時突變，可以使毒株在CEF上有效復制，但是單一位點的突變不能適應CEF培養(yǎng)[15]；雙突變D279N和A284T可以使HK46(vvIBDV)適應細胞生長并獲得較高滴度，但UK661經(jīng)過雙突變后，病毒滴度低了很多[16]，Abdeljel等[17]通過定點突變D279N/A284T發(fā)現(xiàn)vvIBDV PO7突變株也可以適應CEF生長。說明284T是IBDV適應細胞的關(guān)鍵位點，但也需要Q253H或者D279N發(fā)生突變。研究表明Q253H、 D279N和A284T是IBDV細胞嗜性的分子基礎(chǔ)，但具體的分子機制還需要進一步的研究。

為進一步確定E2和E6代毒株的毒力和細胞嗜性位點，可以利用反向遺傳學技術(shù)對E2毒株的VP2進行定點突變來進行驗證，通過疫苗毒株來研究IBDV毒力與細胞嗜性的分子機制。

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(編輯：李文平)

Study on Virulence and Cell Tropism Difference of IBDV B87 Passage Strains in Chicken Embryo

CHEN Ling，JIANG Tao-zhen*

(ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China)

E2 and E6 were passage strains of moderate virulent vaccine strain B87 in chicken embryo, VP2 was sequenced and analyzed, and there are 7 amino acid mutations in VP2 between E2 and E6, S76G, L217S, Q253H, D279N, A284T, I294L, S330R. CEF were infected with E2 and E6, E2 could not adapt to CEF, but E6 could induce CPE. 3-weeks SPF chickens were inoculated to compare the safety difference of the two strains, then bursas of Fabricius from each group were removed and evaluated for histo-pathologic lesions at 3 d, 7 d, 14 d and 21 d, separately, and the bursa to body weight ratio and bursa: body-weight index(BB Index) were also determined. Chicken experiments reveal that the bursa to body weight ratio of SPF chickens infected with E2 began to decrease from 7 days post inoculation, and the BB Index of E2 was also much lower than that of E6. Bursas of chicks inoculated with E2 show atrophy and loss of the follicular architecture at 7 days post infection, while bursas of that inoculated with E6 had a small part of follicles atrophy, with normal follicular connective tissues. This study suggests that mutations of Q253H/D279N/A284T may be the molecular basis of virulence and cell tropism, but the other 4 mutations may also influence the virulence of IBDV.

IBDV; VP2 gene; virulent difference; cell tropism

陳玲，碩士研究生，從事預防獸醫(yī)學研究。

蔣桃珍。E-mail：taozhen_jiang@163.com

2015-05-04

A

1002-1280 (2015) 10-0005-05

S858.31