劉果，孫洋，紀(jì)雪，佟盼盼，祝令偉，劉軍，周偉，郭學(xué)軍，馮書章

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所/吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春130122)

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超級(jí)細(xì)菌NDM-1質(zhì)粒的水平轉(zhuǎn)移研究

劉果，孫洋*，紀(jì)雪，佟盼盼，祝令偉，劉軍，周偉，郭學(xué)軍，馮書章*

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所/吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春130122)

為探究超級(jí)細(xì)菌NDM-1質(zhì)粒水平傳播的特性，以攜帶NDM-1質(zhì)粒的貓?jiān)绰宸撇粍?dòng)桿菌和人源醋酸鈣不動(dòng)桿菌為供體菌，以工程菌株大腸桿菌DH5α和大腸桿菌、沙門氏菌弱毒菌株為受體菌，通過接合試驗(yàn)驗(yàn)證了NDM-1基因通過質(zhì)?？绶N傳播的可能性。結(jié)果顯示，貓?jiān)碞DM-1質(zhì)?？梢赞D(zhuǎn)入E.coliDH5α中，并可以DH5α為中介，轉(zhuǎn)入豬霍亂沙門氏菌C500中；而人源NDM-1質(zhì)粒僅轉(zhuǎn)入E.coliDH5α中，未能轉(zhuǎn)入其他菌株。NDM-1質(zhì)粒在沙門氏菌C500中比在E.coliDH5α中較為穩(wěn)定遺傳。質(zhì)粒的導(dǎo)入并不影響宿主菌的生長(zhǎng)特性。本研究初步揭示了NDM-1的傳播方式，表明NDM-1質(zhì)粒能夠跨越菌種界限，并可以大腸桿菌為中介，轉(zhuǎn)移至其它菌株中。

新德里β內(nèi)酰胺酶-1；接合轉(zhuǎn)移；水平傳播

新德里β內(nèi)酰胺酶-1(New Delhi Metallo-betalactamase-1,NDM-1)自2008年首次被發(fā)現(xiàn)以來，就在腸桿菌科細(xì)菌中迅速蔓延，成為一個(gè)全球性的公共衛(wèi)生學(xué)問題[1]。鑒于寵物多與人密切接觸以及NDM-1跨種傳播的可能性，寵物體內(nèi)出現(xiàn)NDM-1，更是引起了人們的擔(dān)憂[2]。為了探究NDM-1質(zhì)粒的水平轉(zhuǎn)移特性，本研究以攜帶NDM-1質(zhì)粒的貓?jiān)绰宸撇粍?dòng)桿菌Iz4b和人源醋酸鈣不動(dòng)桿菌XM1570為供體菌，通過接合試驗(yàn)驗(yàn)證NDM-1質(zhì)?？绶N傳播的可能性，并對(duì)接合子特性進(jìn)行研究，以期為預(yù)防和控制NDM-1的傳播提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 供體菌：貓?jiān)绰宸撇粍?dòng)桿菌Iz4b，人源醋酸鈣不動(dòng)桿菌XM1570。受體菌：大腸桿菌DH5α，致病性大腸桿菌EPEC E2348/69，出血性大腸桿菌O157 F25，鼠傷寒沙門氏菌SMT，豬霍亂沙門氏菌C500。以上菌株均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 質(zhì)粒 pBR322：攜帶氨芐西林(AMP)、四環(huán)素(TET)抗性；pBR325：攜帶氨芐西林、四環(huán)素和氯霉素(CHL)抗性；由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 主要試劑 亞胺培南(IPM)為Merck公司產(chǎn)品；氯霉素和四環(huán)素為Sigma公司產(chǎn)品；胰蛋白胨，酵母提取物為英國Oxoid公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要儀器 生物安全柜(1300A2)購自美國Thermo公司；BD PhoenixTM-100 System細(xì)菌鑒定儀、Phoenix SpecTM比濁儀均購自美國BD公司；紫外可見分光光度計(jì)購自北京普析通用儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株鑒定 根據(jù)文獻(xiàn)[3]合成引物，PCR鑒定上述兩株供體菌的NDM-1基因。通過BD PhoenixTM-100 System全自動(dòng)微生物鑒定/藥敏系統(tǒng)對(duì)供體菌和受體菌進(jìn)行生化及藥敏檢測(cè)。

1.2.2 受體菌篩選標(biāo)記 通過電轉(zhuǎn)化，向E.coliDH5α導(dǎo)入質(zhì)粒pBR322，向其它受體菌株導(dǎo)入質(zhì)粒pBR325，使其具有TET及CHL的抗性便于后續(xù)接合子的篩選。轉(zhuǎn)化子分別標(biāo)記為DH5α::pBR322、 E2348/69::pBR325、F25::pBR325、SMT::pBR325和 C500::pBR325。按照CLSI(2012版)推薦的微量肉湯稀釋法，測(cè)定各轉(zhuǎn)化子對(duì)TET及CHL的MIC。

1.2.3 接合試驗(yàn) 采用濾膜接合法，并根據(jù)文獻(xiàn)[4-5],優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，如延長(zhǎng)接合時(shí)間，提高供體菌和受體菌濃度，用亞抑菌濃度抗生素促進(jìn)，用納米材料促進(jìn)等，多次進(jìn)行接合試驗(yàn)。

濾膜接合法：將供、受體菌分別于相應(yīng)抗性LB培養(yǎng)基中(供體菌為8 μg/mL IPM；受體菌：DH5α::pBR322為128 μg/mL TET，E2348/69::pBR325、F25::pBR325、SMT::pBR325、和C500::pBR325為100 μg/mL CHL)過夜培養(yǎng)，分別取1 mL供體菌和1 mL受體菌于1.5 mL離心管中，8000 r/min離心2 min，棄上清，用1 mL生理鹽水清洗三次。向供體菌和受體菌分別加100 μL生理鹽水重懸，然后將供體菌和受體菌混合，震蕩混勻。取煮沸滅菌后的濾膜放在LB瓊脂培養(yǎng)基上，滴加100 μL混合菌液于濾膜上。37 ℃恒溫培養(yǎng)4 h后，用1 mL生理鹽水沖洗濾膜，收集沖洗后的菌液，生理鹽水100倍稀釋后，取100 μL涂于相應(yīng)的雙抗LB平板(DH5α::pBR322作為受體菌時(shí)，雙抗?jié)舛葹? μg/mL IPM，128 μg/mL TET；其他菌株為受體菌時(shí)，雙抗?jié)舛葹? μg/mL IPM，100 μg/mL CHL)。37 ℃恒溫培養(yǎng)16～20 h，雙抗平板上生長(zhǎng)的單菌落判定為疑似接合子。

1.2.4 接合子鑒定 挑取雙抗平板上生長(zhǎng)的單菌落培養(yǎng)，根據(jù)文獻(xiàn)[6-7]合成大腸桿菌和沙門氏菌特異性引物，PCR驗(yàn)證疑似接合子。對(duì)PCR呈NDM-1陽性的菌株，使用大腸桿菌或沙門氏菌的特異性引物PCR驗(yàn)證菌株是否為接合子。對(duì)于驗(yàn)證陽性的接合子，通過BD PhoenixTM-100 System全自動(dòng)微生物鑒定/藥敏系統(tǒng)進(jìn)行生化和藥敏鑒定。

1.2.5 最小抑菌濃度(MIC)試驗(yàn) 按照CLSI推薦的微量肉湯稀釋法，測(cè)定供受體菌及接合子對(duì)IPM的MIC。

1.2.6 NDM-1質(zhì)粒遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 將供體菌及接合子劃線于IPM(16 μg/mL)抗性平板上，挑取單菌落于抗性液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h，取5 μL菌液于5 mL新鮮無抗LB液體培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)后，稀釋涂布于無抗LB瓊脂平板上，長(zhǎng)出單菌落后，挑取230個(gè)左右單菌落，點(diǎn)種于IPM(16 μg/mL)抗性LB平板，在抗性平板上不生長(zhǎng)的菌落即為質(zhì)粒丟失的菌株。質(zhì)粒的丟失率=不生長(zhǎng)的菌落數(shù)/挑取的菌落總數(shù)。

1.2.7 接合子生長(zhǎng)特性 從抗性平板上挑取受體菌DH5α::pBR322、C500、C500::pBR325以及所獲得的接合子的單菌落，于5 mL抗性液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)過夜。取1 mL菌液于100 mL 新鮮LB培養(yǎng)基中，充分振蕩，混合均勻， 37 ℃恒溫180 r/min振蕩培養(yǎng)，用紫外可見分光光度計(jì)于波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定菌液吸光度，每小時(shí)測(cè)定一次。觀察NDM-1質(zhì)粒對(duì)于宿主菌生長(zhǎng)特性的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 供受體菌鑒定 經(jīng)PCR鑒定，供體菌Iz4b和XM1570均攜帶NDM-1耐藥基因。細(xì)菌鑒定及藥敏檢測(cè)結(jié)果表明，Iz4b對(duì)所測(cè)的β-內(nèi)酰胺類、磺胺類、喹諾酮類抗生素均耐藥，對(duì)IPM的MIC為512 μg/mL，對(duì)阿米卡星敏感；XM1570對(duì)所測(cè)的β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥，對(duì)IPM的MIC為256 μg/mL，對(duì)其他抗生素均敏感。受體菌對(duì)所測(cè)抗生素均敏感。供體菌及部分受體菌藥敏檢測(cè)結(jié)果見表1。

表1 供體菌和部分受體菌藥敏檢測(cè)結(jié)果表

注：R：耐藥；I：中介；S：敏感。MIC：細(xì)菌鑒定儀藥敏檢測(cè)結(jié)果。*MIC：參照CLSI，用微量肉湯稀釋法測(cè)定的MIC值

2.2 質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化 pBR322轉(zhuǎn)入DH5α后，DH5α::pBR322對(duì)TET的MIC提高至256 μg/mL；pBR325轉(zhuǎn)入大腸桿菌弱毒株E2348/69、F25，以及沙門氏菌疫苗株SMT、C500后，轉(zhuǎn)化子對(duì)CHL的MIC提高至512 μg/mL。

2.3 接合試驗(yàn) 在濾膜接合法實(shí)驗(yàn)中，將NDM-1質(zhì)粒從洛菲不動(dòng)桿菌Iz4b中轉(zhuǎn)移至DH5α::pBR322中，命名為DH5α::pBR322-NDM-1。DH5α::pBR322-NDM-1容易丟失質(zhì)粒而變得對(duì)IPM敏感，在抗性條件下連續(xù)傳代，獲得了一個(gè)穩(wěn)定菌株，命名為DH5α::pBR322-NDM-1-1。將NDM-1質(zhì)粒從醋酸鈣不動(dòng)桿菌XM1570中轉(zhuǎn)入DH5α::pBR322中，命名為DH5α::pBR322-NDM-1-2。而其余四個(gè)弱毒受體菌均未能直接通過接合試驗(yàn)獲得兩供體菌的NDM-1質(zhì)粒。以DH5α::pBR322-NDM-1-1及DH5α::pBR322-NDM-1-2為供體菌，繼續(xù)向其他受體菌中接合轉(zhuǎn)移，NDM-1質(zhì)粒從DH5α::pBR322-NDM-1-1轉(zhuǎn)移至豬霍亂沙門氏菌C500::pBR325中，接合子命名為C500::pBR325-NDM-1。

2.4 接合子鑒定 接合子DH5α::pBR322-NDM-1、DH5α::pBR322-NDM-1-1、DH5α::pBR322-NDM-1-2和C500::pBR325-NDM-1通過NDM-1基因引物和特異性引物PCR驗(yàn)證均為陽性。藥敏檢測(cè)結(jié)果表明，除DH5α::pBR322-NDM-1外，其他接合子均獲得了β-內(nèi)酰胺類耐藥表型，對(duì)IPM的MIC提高至128 μg/mL以上，具體結(jié)果見表2，結(jié)果表明NDM-1質(zhì)?？梢詮牟粍?dòng)桿菌跨種傳播到大腸桿菌和沙門氏菌中。

表2 接合子藥敏檢測(cè)結(jié)果表

注：R：耐藥；I：中介；S：敏感。MIC：細(xì)菌鑒定儀藥敏檢測(cè)結(jié)果。*MIC：參照CLSI，用微量肉湯稀釋法測(cè)定的MIC值。

2.5 NDM-1質(zhì)粒的遺傳穩(wěn)定性 在無抗性LB液體中培養(yǎng)12 h，供體菌及接合子的質(zhì)粒丟失率如表3。結(jié)果表明，NDM-1質(zhì)粒在原宿主菌中能穩(wěn)定存在。Iz4b中NDM-1質(zhì)粒在新的宿主菌DH5α::pBR322中極不穩(wěn)定，接合子在無抗LB液體中培養(yǎng)12 h后，質(zhì)粒幾乎完全丟失。而抗性條件下傳代獲得的菌株，質(zhì)粒會(huì)相對(duì)穩(wěn)定的存在，但丟失率超過50%，轉(zhuǎn)入C500后，質(zhì)粒穩(wěn)定性增加。XM1570中NDM-1質(zhì)粒在DH5α中易丟失，12 h培養(yǎng)，丟失率達(dá)80.6%。

表3 NDM-1質(zhì)粒丟失率表

2.6 接合子的生長(zhǎng)特性 DH5α::pBR322、DH5α::pBR322-NDM-1-1和DH5α::pBR322-NDM-1-2及C500、C500::pBR325和C500::pBR325-NDM-1的生長(zhǎng)曲線如圖1所示。由圖中可知，原受體菌與接合子生長(zhǎng)曲線無顯著差異，因此NDM-1質(zhì)粒并不影響宿主菌的生長(zhǎng)特性。

3 討論與小結(jié)

圖1 受體菌及接合子生長(zhǎng)曲線(A. DH5α::pBR322及接合子生長(zhǎng)曲線；B. C500，C500::pBR325及接合子生長(zhǎng)曲線)

超級(jí)細(xì)菌攜帶NDM-1質(zhì)粒，可耐受幾乎所有的抗生素，因而具有重要的公共衛(wèi)生意義。目前，NDM-1在世界各地腸桿菌科的大部分細(xì)菌中，包括肺炎克雷伯菌、大腸桿菌、陰溝腸桿菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、弗氏檸檬酸桿菌等均被發(fā)現(xiàn)，我國被認(rèn)為是繼印度和巴基斯坦之后的NDM-1多發(fā)國之一[8]。在我國檢測(cè)到的多種攜帶NDM-1的腸桿菌菌株大多為散發(fā)，這標(biāo)志著NDM-1的傳播主要由接合性質(zhì)粒及其攜帶的可移動(dòng)元件介導(dǎo)，這與其它國家監(jiān)測(cè)到的NDM-1的傳播特點(diǎn)相一致[9]。目前對(duì)NDM-1傳播方式的探究多為基于流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果所做的推斷，迫切需要研究來驗(yàn)證和揭示NDM-1傳播的特點(diǎn)及其潛在傳播機(jī)制。

細(xì)菌耐藥性傳播的重要方式之一是接合(conjugation)，耐藥性質(zhì)粒作為可移動(dòng)遺傳元件通過細(xì)菌表面的性纖毛從一個(gè)細(xì)菌轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)菌，并使受體菌獲得相應(yīng)的耐藥表型。大量文獻(xiàn)[9-11]表明，NDM-1質(zhì)?？梢酝ㄟ^接合的方式轉(zhuǎn)移至工程菌株E.coliJ53及DH5α中，但國內(nèi)外尚未見到向其他弱毒及野生菌株轉(zhuǎn)移的報(bào)道。Iz4b是本實(shí)驗(yàn)室于2012年從病犬體內(nèi)分離得到的一株亞胺培南耐藥的洛菲不動(dòng)桿菌(Acinetobacterlwoffii)，其攜帶的NDM-1位于質(zhì)粒上，我們將該質(zhì)粒命名為pNDM-Iz4b。全質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果表明：該質(zhì)粒全長(zhǎng)46570 bp，其大部分序列與人源醋酸鈣不動(dòng)桿菌XM1570[10]中NDM-1質(zhì)粒pXM1一致，僅在接合轉(zhuǎn)移相關(guān)的區(qū)域(traC)有705 bp的缺失，此705 bp包含一個(gè)調(diào)節(jié)核酸酶活性相關(guān)蛋白的編碼基因和206 bp的正向重復(fù)序列。兩質(zhì)粒均含有traA、traC和traD三個(gè)與接合轉(zhuǎn)移有關(guān)的基因，且在NDM-1上下游有ISAba125，構(gòu)成了Tn125轉(zhuǎn)座子。說明NDM-1耐藥基因可能通過轉(zhuǎn)座以及細(xì)菌之間的接合等方式傳播，而跨種傳播到其他細(xì)菌中。

Iz4b和XM1570作為供體菌時(shí)，只有工程菌株DH5α獲得了NDM-1質(zhì)粒，說明工程菌株相對(duì)于其它菌株更容易接受外源大質(zhì)粒。貓?jiān)碔z4b的NDM-1質(zhì)粒在DH5α宿主中不能穩(wěn)定遺傳，這與Chen[11]等的報(bào)道一致?？剐詶l件下傳代后能獲得相對(duì)穩(wěn)定的菌株，說明抗性條件有利于細(xì)菌耐藥基因的穩(wěn)定存在。以穩(wěn)定的DH5α接合子為中介，pNDM-Iz4b可接合轉(zhuǎn)移至豬霍亂沙門氏菌C500中，而pXM1未能轉(zhuǎn)移，可能與兩質(zhì)粒序列差異有關(guān)。黃瑞等[12]曾用接合試驗(yàn)驗(yàn)證了傷寒桿菌耐藥質(zhì)粒pRST98能在4種腸道桿菌間傳遞，同時(shí)能以大腸桿菌為媒介，將耐藥基因轉(zhuǎn)移給其他腸道菌。因此腸道中數(shù)量龐大的大腸桿菌可以作為耐藥基因的儲(chǔ)存庫和中轉(zhuǎn)站，將耐藥基因從非致病菌轉(zhuǎn)移至致病菌，這將會(huì)給人類健康構(gòu)成嚴(yán)重的威脅。

本研究揭示了NDM-1質(zhì)?？梢酝ㄟ^接合方式傳播其耐藥性，在研究NDM-1質(zhì)粒這種轉(zhuǎn)移方式時(shí)，發(fā)現(xiàn)了有趣而重要的現(xiàn)象，這就是：①NDM-1質(zhì)粒可以跨種傳播，從不動(dòng)桿菌轉(zhuǎn)移到大腸桿菌和沙門氏菌；②NDM-1質(zhì)粒的遺傳穩(wěn)定性依受體菌種類不同而有所差異，在所實(shí)驗(yàn)的大腸桿菌和沙門氏菌中，NDM-1質(zhì)粒在沙門氏菌中能夠較為穩(wěn)定的遺傳；③NDM-1質(zhì)粒的跨種傳播受受體菌遺傳背景的影響，受體菌所攜帶的自然質(zhì)粒(尤其是不相容性質(zhì)粒)可能在一定程度上影響著NDM-1質(zhì)粒接合性轉(zhuǎn)移或轉(zhuǎn)化效率和傳播速度。此研究結(jié)果對(duì)于深入探究超級(jí)細(xì)菌的形成及其耐藥性的傳播具有重要意義。

近年來，NDM-1在中國的流行有加重的趨勢(shì)，流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，克隆株傳播造成的暴發(fā)[13-14]和由接合性質(zhì)粒及其攜帶的可移動(dòng)遺傳元件(如ISAba125,Tn125等)介導(dǎo)的跨種傳播[9,11,15]，是導(dǎo)致NDM-1流行的主要原因。鑒于NDM-1能夠突破菌屬和地理界限而傳播，世界各國均應(yīng)加強(qiáng)NDM-1的監(jiān)測(cè)，深入探討其跨種傳播的可能方式，研究針對(duì)這類超級(jí)細(xì)菌的控制技術(shù)。

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(編輯：侯向輝)

Horizontal Transferability of NDM-1 Plasmid

LIU Guo,SUN Yang*, JI Xue,TONG Pan-pan, ZHU Ling-wei, LIU Jun, ZHOU Wei, GUO Xue-jun,FENG Shu-zhang*

(InstituteofMilitaryVeterinary,AMMS/KeyLaboratoryofJilinProvinceforZoonosisPreventionandControl,Changchun130122,China)

The purpose of this study was to explore the horizontal transmission properties of NDM-1 plasmids in superbugs.Acinetobacterlwoffiiof cat origin andAcinetobactercalcoaceticusof human origin were used as donor strains,Escherichiacolistrain DH5α and four attenuated strains(twoE.colistrains and twoSalmonellastrains)were used as recipient strains, and conjugation experiment was conducted to explore the cross-species transferability of NDM-1 mediated by plasmids. The results showed NDM-1 plasmid of cat origin was able to transfer into DH5α, and then toSalmonellacholeraesuis C500 strain mediated by DH5α. NDM-1 plasmid of human origin was able to transfer to DH5α, but failed to transfer to other strains. Furthermore, NDM-1 plasmids in C500 could be more stably inherited than inE.coliDH5α. The plasmid transferred didn’t influence the growth properties of the host strains. This study indicated that NDM-1 plasmids were able to cross the genetic boundaries and transfer to other strains mediated byE.coli,which may shed some light on the horizontal transmission of NDM-1.

NDM-1;conjugation;horizontal transfer

科技部傳染病防治重大專項(xiàng)(2013ZX10004217)；863項(xiàng)目(2012AA022006)；吉林省科技計(jì)劃項(xiàng)目(20140101032JC，20150101110JC)

劉果，碩士研究生，從事細(xì)菌耐藥性研究。

馮書章,E-mail: shuzhangfeng@qq.com；孫洋,E-mail：sunyang10@hotmail.com

2015-07-17

A

1002-1280 (2015) 10-0015-07

S852.61