周媛媛，曾凡軍，熊曉琦，阮玉姝，萬(wàn)曉蓉，宋新宇

(三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院宜昌市中心人民醫(yī)院，湖北宜昌443000)

肺性腦病是慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者嚴(yán)重的并發(fā)癥，病死率高達(dá)60%左右［1］。其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，神經(jīng)元自噬可能是其發(fā)病機(jī)制之一，β-葡糖腦苷酶(β-GBA)、Atg7、p62為神經(jīng)元自噬相關(guān)標(biāo)志物［2］。2012年1月～2014年1月，我們觀察了肺性腦病患者腦脊液β-GBA、Atg7、p62水平變化，并探討其臨床意義。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 宜昌市中心人民醫(yī)院收治的COPD合并肺性腦病者50例(觀察組)及單純COPD患者50例(對(duì)照組)，均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)會(huì)COPD診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］;排除合并結(jié)核性胸膜炎、病毒或寄生蟲(chóng)感染者，既往有中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害及惡性腫瘤患者。觀察組男33例、女17例，年齡(66.8± 6.3)歲;合并消化道出血2例、代謝紊亂8例。對(duì)照組男29例、女21例，年齡(67.2±7.1)歲;合并消化道出血1例、代謝紊亂2例。兩組基本資料具有可比性，患者或家屬簽署知情同意書(shū)，并經(jīng)宜昌市中心人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 檢測(cè)方法 患者均行腰椎穿刺采集腦脊液，離心后采用ELISA法檢測(cè)β-GBA、Atg7蛋白，試劑盒購(gòu)自美國(guó)SIGMA公司，按說(shuō)明操作。Western blot法檢測(cè)p62蛋白:運(yùn)用全蛋白提取試劑盒提取兩組細(xì)胞蛋白，－80℃凍存?zhèn)溆谩?0%的SDS-PAGE膠分離相應(yīng)蛋白，采用濕法轉(zhuǎn)膜45 min，5%脫脂奶粉封閉1 h后加入1∶1 000稀釋的兔抗人p62一抗，4℃孵育過(guò)夜，次日PBS洗膜后加入稀釋比例為1∶5 000的山羊抗兔二抗，室溫孵育1 h，PBS洗膜后行ECL發(fā)光。選用β-actin蛋白為內(nèi)參蛋白對(duì)照，以蛋白灰度值表示其表達(dá)量。

1.2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用s表示，兩組比較用t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

兩組腦脊液β-GBA、Atg7、p62水平比較，見(jiàn)表1。

表1 兩組腦脊液β-GBA、Atg7、p62水平比較(s)

表1 兩組腦脊液β-GBA、Atg7、p62水平比較(s)

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.05。

組別 n β-GBA(pg/mL) Atg7(pg/mL)p62觀察組 50 34.6±6.8* 12.4±3.2*0.35±0.05對(duì)照組50 15.5±3.6 2.8±0.6 0.23±0.03

3 討論

COPD患者合并感染時(shí)常會(huì)出現(xiàn)低氧及CO2潴留，極易并發(fā)肺性腦病，患者常表現(xiàn)為淡漠、反應(yīng)遲鈍、嗜睡、譫妄或昏迷等意識(shí)障礙。

肺性腦病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，缺氧是核心因素。神經(jīng)元缺氧可致自噬死亡或凋亡。長(zhǎng)期以來(lái)，自噬被認(rèn)為是神經(jīng)元的一種保護(hù)性作用，在維持缺血、缺氧等應(yīng)激狀態(tài)下細(xì)胞存活、清除細(xì)胞內(nèi)衰老細(xì)胞器及錯(cuò)誤折疊蛋白中起重要作用。近年發(fā)現(xiàn)，在某些條件下細(xì)胞自噬也能導(dǎo)致細(xì)胞死亡。自噬作為一種重要的物質(zhì)代謝方式，它的發(fā)生受到嚴(yán)格的調(diào)節(jié)和控制。自噬的調(diào)控通路可分為mTOR調(diào)節(jié)途徑和mTOR途徑不依賴(lài)性調(diào)節(jié)途徑［4］。在缺血缺氧情況下，自噬的發(fā)生主要由mTOR途徑調(diào)控。p62與自噬密切相關(guān)，p62偶聯(lián)于微管相關(guān)蛋白輕鏈3，參與自噬體的構(gòu)成，是一種調(diào)節(jié)因子，在自噬中、晚期會(huì)降解［5］。通常情況下，細(xì)胞內(nèi)p62表達(dá)水平與自噬活性存在負(fù)相關(guān)。例如，在饑餓誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬缺陷狀態(tài)下，Mizushima等［6］觀察到p62的蓄積。研究證實(shí)，細(xì)胞內(nèi)p62的表達(dá)水平與多種自噬相關(guān)因子關(guān)系密切［7］，但細(xì)胞自噬不是p62惟一的降解途徑［8］。本研究發(fā)現(xiàn)，COPD合并肺性腦病患者，腦脊液中p62蛋白水平顯著增高，表明肺性腦病患者中樞神經(jīng)元自噬增強(qiáng)。自噬增強(qiáng)有助于提高在缺氧及CO2潴留的病理狀態(tài)下，提高神經(jīng)元對(duì)缺氧及高CO2致?lián)p傷的耐受力，起到一定的保護(hù)性效應(yīng)。

β-GBA是一種水解酶，存在于溶酶體內(nèi)。最初發(fā)現(xiàn)與戈謝病相關(guān)，基因突變導(dǎo)致β-GBA減少或缺乏，致使巨噬細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖腦苷脂不能被水解，蓄積在溶酶體中，導(dǎo)致細(xì)胞功能受到影響。隨后發(fā)現(xiàn)，β-GBA與帕金森病相關(guān)［9］。本研究發(fā)現(xiàn)，β-GBA與肺性腦病相關(guān)，肺性腦病患者，腦脊液中β-GBA水平升高。由于自噬與溶酶體相關(guān)，肺性腦病誘發(fā)的自噬效應(yīng)，是否與β-GBA有直接或間接關(guān)系，尚需進(jìn)一步研究。

目前，研究發(fā)現(xiàn)自噬體的形成至少需要16種Atg基因的參與。Atg1是第一個(gè)被成功克隆的自噬基因［10］，Atg1缺乏時(shí)自噬發(fā)生受到抑制［11］。Atg7是一種泛素E1樣連接酶，可以激活泛素樣蛋白Atg12和Atg8。Atg7可以激活哺乳動(dòng)物中的所有3種Atg8，即GATE-16、GABARAP和LC3。自噬體的形成需要一個(gè)泛素樣連接體系，其中Atg12和Atg5共價(jià)結(jié)合，并定位到自噬體囊泡中。Atg7是泛素樣蛋白通路中位置上游的關(guān)鍵基因，為自噬泡形成的必需蛋白質(zhì)分子［12］。有研究證實(shí)，在阻斷小鼠L929細(xì)胞中Atg7的表達(dá)后，可以顯著降低自噬性細(xì)胞死亡的發(fā)生率［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，肺性腦病患者腦脊液Atg7水平顯著升高，可能是神經(jīng)元損傷后部分神經(jīng)元裂解后蛋白釋放到蛛網(wǎng)膜中。

綜上所述，COPD肺性腦病患者腦脊液β-GBA、Atg7、p62蛋白水平升高，而Atg7及其參與的泛素樣蛋白通路可能是肺性腦病患者神經(jīng)元自噬發(fā)生的一條重要通路。通過(guò)這一研究，我們可更進(jìn)一步了解肺性腦病神經(jīng)元自噬發(fā)生的分子機(jī)制，從而為肺性腦病的診治尋找到新靶點(diǎn)。

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