黃漢輝++++++鄭師明++++++荊冬冬++++++劉少志++++++梁+++穎++++++關(guān)秉恩+嚴(yán)鵬科

[摘要] 目的 探討血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）對(duì)細(xì)胞鈣庫的應(yīng)激效應(yīng)及替米沙坦對(duì)此的拮抗作用。 方法 預(yù)防性實(shí)驗(yàn)分組：正常對(duì)照組、AngⅡ 0.1 μmol/L組和替米沙坦60、300、1000 μg/L預(yù)處理組；治療性實(shí)驗(yàn)分組：正常對(duì)照組、AngⅡ 0.1 μmol/L組和AngⅡ+替米沙坦60、300、1000 μg/L組。分別檢測各組試驗(yàn)前胞內(nèi)鈣離子濃度，記為0 h。體外培養(yǎng)的人大動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞預(yù)防性給予替米沙坦60、300、1000 μg/L培育30 min后，加入AngⅡ 0.1 μmol/L；或AngⅡ 0.1 μmol/L培育30 min后，再加入替米沙坦60、300、1000 μg/L，分別于共同作用0.5、2、8和24 h采用激光共聚焦掃描顯微鏡成像法檢測胞漿游離鈣離子濃度。 結(jié)果 預(yù)防性實(shí)驗(yàn)：與正常對(duì)照組相比，替米沙坦60、300、1000 μg/L作用細(xì)胞30 min對(duì)胞漿游離鈣離子濃度無明顯影響，加入AngⅡ 0.1 μmol/L后，胞漿游離鈣離子濃度立即（0 h）顯著升高，均顯著高于正常對(duì)照組（P < 0.05），但顯著低于AngⅡ組，并且替米沙坦預(yù)處理濃度越高抑制作用越強(qiáng)（P < 0.05），作用時(shí)間對(duì)此無影響。治療性實(shí)驗(yàn)：AngⅡ 0.1 μmol/L先誘導(dǎo)30 min后，再加入替米沙坦60 μg/L對(duì)升高的胞漿游離鈣離子濃度無抑制作用；替米沙坦300 μg/L作用2 h或替米沙坦1000 μg/L作用0.5 h才顯示其抑制作用（P < 0.05），但均顯著高于同一時(shí)間點(diǎn)的正常對(duì)照組。替米沙坦的作用時(shí)間對(duì)此無影響。 結(jié)論 AngⅡ能誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫向胞漿釋放游離鈣離子，而替米沙坦能有效拮抗AngⅡ?qū)?nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激作用及促使胞漿游離鈣離子重新被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)重吸收。預(yù)防性給予替米沙坦的拮抗作用較治療性給予的拮抗作用顯著。

[關(guān)鍵詞] 替米沙坦；血管內(nèi)皮細(xì)胞；血管緊張素Ⅱ；鈣離子

[中圖分類號(hào)] R972.4 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2015）01（c）-0011-05

高血壓、動(dòng)脈硬化、冠心病等心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展過程中均存在著以內(nèi)皮細(xì)胞所分泌的一氧化氮（NO）減少而致血管舒張反應(yīng)下降為主要特征的血管內(nèi)皮系統(tǒng)功能障礙[1]。導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的因素中，腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAAS），尤其是局部RAAS所產(chǎn)生的血管緊張素Ⅱ（angiotensin ，AngⅡ）在病理生理方面起著重要的作用[2]。異常升高的AngⅡ可通過與血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的AT1受體結(jié)合，引起細(xì)胞鈣超載并啟動(dòng)一系列的細(xì)胞凋亡信息轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。替米沙坦（Telmisartan）是新型的長效AngⅡ受體拮抗劑，其作用機(jī)制主要是與AT1受體結(jié)合，阻斷AngⅡ?qū)T1受體的激動(dòng)作用，作為臨床一線降壓藥被廣泛應(yīng)用。以往的研究顯示，替米沙坦對(duì)由高糖或AngⅡ等因素所致的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用[3-6]。靜息生理狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)鈣離子主要儲(chǔ)存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，使細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子保持在極低的水平約1×10-7mol/L，細(xì)胞內(nèi)外的鈣離子濃度差大約為一萬倍[7]。當(dāng)遇到相應(yīng)的刺激時(shí)，細(xì)胞會(huì)通過多種途徑瞬間提高胞內(nèi)局部或全部的鈣離子濃度。其中主要的途徑包括胞外鈣離子的內(nèi)流和胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激釋放儲(chǔ)存在其的鈣離子。細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度在細(xì)胞死亡過程中有變化，并且這種變化與許多病理狀態(tài)相關(guān)。已有的研究報(bào)道中，在探討替米沙坦對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞胞內(nèi)游離鈣離子濃度影響時(shí)，較少區(qū)分引起胞內(nèi)鈣離子濃度變化的途徑或給予限制，本文通過采用無鈣離子細(xì)胞培養(yǎng)基，消除細(xì)胞應(yīng)激后鈣離子從胞外內(nèi)流的途徑，探討AngⅡ刺激后胞內(nèi)鈣離子的變化，觀察替米沙坦對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)源游離鈣離子濃度的調(diào)控作用，以細(xì)化這兩類物質(zhì)（藥物）對(duì)胞內(nèi)鈣離子影響及其誘發(fā)細(xì)胞凋亡的基礎(chǔ)研究。

1 材料與方法

1.1 材料

人大動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株（VEC），PriCell公司；替米沙坦，森瑞化工有限公司；Ang Ⅱ，Sigma公司；胎牛血清，美國Hyclone公司；高糖DMEM培養(yǎng)基，美國Hyclone公司；無鈣DMEM培養(yǎng)基，美國Hyclone公司；Fluo-3/AM，Sigma公司。替米沙坦和AngⅡ均用無鈣無血清DMEM培養(yǎng)液溶解配成10 mg/L和2 μmol/L母液，用時(shí)以無鈣無血清DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)節(jié)終末濃度。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

常規(guī)復(fù)蘇血管內(nèi)皮細(xì)胞株，以含血清DMEM培養(yǎng)基（90%高糖DMEM培養(yǎng)基，10%胎牛血清）制備濃度為1×105/mL的血管內(nèi)皮細(xì)胞懸浮液。取10 mL血管內(nèi)皮細(xì)胞懸浮液置于75 cm2無菌培養(yǎng)瓶內(nèi)，在5%CO2、37℃、濕度95%的條件中孵化培養(yǎng)，隔天置換培養(yǎng)液。當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞長至80%～90%融合時(shí)，以0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA混合液消化傳代。當(dāng)細(xì)胞傳至第3代時(shí)，將細(xì)胞接種于35 mm激光共聚焦玻璃底細(xì)胞培養(yǎng)皿中，細(xì)胞密度為5×104個(gè)/mL，置回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿后進(jìn)入分組、Fluo-3/AM負(fù)載及干預(yù)試驗(yàn)程序。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理

根據(jù)健康人體口服40、80、120 mg替米沙坦片測得的血漿藥物峰濃度（Cmax）[8]，實(shí)驗(yàn)藥物濃度設(shè)計(jì)為60、300、1000 μg/L。

1.3.1 預(yù)防性實(shí)驗(yàn) 將接種于35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中的血管內(nèi)皮細(xì)胞分為5組：正常對(duì)照組、替米沙坦60、300、1000 μg/L預(yù)處理組和AngⅡ 0.1 μmol/L組。試驗(yàn)添加藥物前每組分別測定初始鈣離子濃度（0 h），設(shè)為T0。隨后，各組培養(yǎng)基中分別加入培養(yǎng)液10 μL（正常對(duì)照組）、濃度為0.036 g/L的替米沙坦10 μL（60 μg/L替米沙坦組）、濃度為0.18 g/L的替米沙坦10 μL（300 μg/L替米沙坦組）、濃度0.60 g/L的替米沙坦10 μL（1000 μg/L替米沙坦組）和培養(yǎng)液10 μL（AngⅡ 0.1 μmol/L組）。替米沙坦預(yù)處理30 min后檢測細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度（T1），除正常對(duì)照組外，其余組均加入濃度2 μmol/L的AngⅡ10 μL，并分別繼續(xù)共同培養(yǎng)，于AngⅡ加入后瞬時(shí)（T2）、0.5 h（T3）、2 h（T4）、8 h（T5）和24 h（T6）抽樣檢測細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度。

1.3.2 治療性實(shí)驗(yàn) 將接種于35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中的血管內(nèi)皮細(xì)胞分為5組：正常對(duì)照組、AngⅡ 0.1 μmol/L組，AngⅡ+替米沙坦60、300、1000 μg/L組。試驗(yàn)添加藥物前每組分別測定初始鈣離子濃度（0 h），設(shè)為T0。隨后，除正常對(duì)照組外，其余各組加入 0.1 μmol/L的AngⅡ 10 μL培養(yǎng)30 min后檢測細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度（T1），再加入替米沙坦（加入濃度和體積同“1.3.1”項(xiàng)下），并分別繼續(xù)共同培養(yǎng)，于替米沙坦加入后瞬時(shí)（T2）、0.5 h（T3）、2 h（T4）、8 h（T5）和24 h（T6）抽樣檢測細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度。

1.4 胞漿游離鈣離子濃度測定[9]

按照檢測時(shí)間，分別取各組細(xì)胞應(yīng)用激光共聚焦掃描顯微鏡調(diào)節(jié)激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為526 nm，置負(fù)載Fluo-3的內(nèi)皮細(xì)胞于鏡下，于每個(gè)檢測時(shí)點(diǎn)，每組隨機(jī)選取活細(xì)胞8個(gè)，各細(xì)胞共掃描16次，每次掃描間隔時(shí)間為2 s，取16次掃描測得的平均熒光強(qiáng)度數(shù)值作為該內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 替米沙坦預(yù)處理對(duì)AngⅡ?qū)е碌难軆?nèi)皮細(xì)胞胞內(nèi)游離鈣離子濃度的影響

替米沙坦預(yù)處理加入AngⅡ 0.1 μmol/L后，胞漿游離鈣離子濃度立即（0 h）顯著升高，均顯著高于正常對(duì)照組（P < 0.05），但顯著低于AngⅡ組，并且替米沙坦預(yù)處理濃度越高抑制作用越強(qiáng)（P < 0.05），作用時(shí)間對(duì)此無影響。見表1。

2.2 替米沙坦對(duì)AngⅡ?qū)е碌难軆?nèi)皮細(xì)胞胞內(nèi)游離鈣離子濃度的影響

與正常對(duì)照組相比，AngⅡ 0.1 μmol/L誘導(dǎo)30 min，鈣離子濃度顯著升高（P < 0.05）。與AngⅡ 0.1 μmol/L相比，加入替米沙坦60 μg/L作用24 h，對(duì)升高的胞漿游離鈣離子濃度無抑制作用；替米沙坦300 μg/L作用2 h或替米沙坦1000 μg/L作用0.5 h才顯示其抑制作用（P < 0.05），均顯著高于同一時(shí)間點(diǎn)的正常對(duì)照組；替米沙坦的作用時(shí)間對(duì)此無影響。見表2。

3 討論

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，AngⅡ能誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫向胞漿釋放游離鈣離子，而替米沙坦具有效拮抗AngⅡ?qū)?nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激作用及促使胞漿游離鈣離子重新被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)重吸收。血管內(nèi)皮細(xì)胞具有物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、自分泌、旁分泌等多重功能，是易受損的功能性界面，對(duì)各種不同的病理生理干預(yù)均可發(fā)生形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)方面的改變。多種心血管病變均可引起內(nèi)源性AngⅡ分泌增加，超生理濃度的AngⅡ可通過與血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的AT1受體結(jié)合，激動(dòng)G蛋白，使4，5-二磷酸磷脂酰肌醇水解生成三磷酸肌醇（IP3），生成的IP3激動(dòng)細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)IP3受體（IP3敏感型鈣庫），致使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向胞漿釋放大量游離Ca2+，同時(shí)損害內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵（endoplasmic reticulum Ca2+ ATPase，SERCA）的活力，影響其對(duì)細(xì)胞質(zhì)游離鈣離子的重新吸收，引起細(xì)胞鈣超載并啟動(dòng)一系列的細(xì)胞凋亡信息轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[10-12]，這一系列的改變將進(jìn)一步引起細(xì)胞骨架降解，導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)自溶反應(yīng)[13-15]。而血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡是動(dòng)脈粥樣硬化病變的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[1]。

替米沙坦是新型的AngⅡ受體拮抗劑，其作用機(jī)制主要是與AT1受體結(jié)合，阻斷AngⅡ?qū)T1受體的激動(dòng)作用。Selman等[11]對(duì)心肌細(xì)胞的研究中觀察到，替米沙坦能在一定程度上阻斷IP3對(duì)IP3受體的激動(dòng)作用，并在進(jìn)一步的動(dòng)物試驗(yàn)中觀察到，長期給高血壓大鼠灌服替米沙坦可令I(lǐng)P3受體的數(shù)量下調(diào)。Abiko等[10]等Maczewski等[14]研究表明，AngⅡ、甲狀腺素等作用內(nèi)皮細(xì)胞后，SERCA mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)顯著下降且和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)攝取Ca2+的能力下降相關(guān)，咪達(dá)普利和替米沙坦干預(yù)后，SERCA mRNA表達(dá)無明顯變化，但可顯著提高SERCA的活力。

從本試驗(yàn)的預(yù)防性和治療性試驗(yàn)觀察到，血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)替米沙坦預(yù)處理30 min后均能有效拮抗AngⅡ引起的胞漿游離鈣離子濃度上升。這可能與替米沙坦為AngⅡ受體拮抗劑，經(jīng)替米沙坦預(yù)處理30 min后，藥物優(yōu)先占據(jù)AngⅡ的AT1受體結(jié)合位點(diǎn)，阻礙或（和）減弱了AngⅡ?qū)Y(jié)合位點(diǎn)的激動(dòng)作用及由于受體激動(dòng)后所誘發(fā)的連鎖反應(yīng)。替米沙坦的預(yù)防作用也可能與其阻斷IP3對(duì)IP3受體的激動(dòng)作用，部分阻斷鈣庫內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子的釋放有關(guān)。

AngⅡ預(yù)先誘導(dǎo)30 min的試驗(yàn)中，300 μg/L替米沙坦作用2 h或1000 μg/L替米沙坦作用0.5 h才顯示其抑制胞漿游離鈣離子濃度的作用。這可能由于AT1受體被AngⅡ預(yù)先占據(jù)并激動(dòng)，而AngⅡ在細(xì)胞和組織中的半衰期為15～30 min，在此期間AT1受體等結(jié)合位點(diǎn)依然被AngⅡ所占據(jù)但由于替米沙坦與AngⅡ競爭相同的作用位點(diǎn)。因此，替米沙坦同樣起到一定的拮抗作用，以至于抑制了胞內(nèi)游離Ca2+的持續(xù)上升（與AngⅡ模型組比較）。隨著AngⅡ被活細(xì)胞逐漸代謝，原先被AngⅡ占據(jù)的結(jié)合位點(diǎn)重新暴露并被替米沙坦占據(jù)。其后胞內(nèi)游離鈣離子濃度的降低可能與沙坦類藥物同時(shí)抑制多種細(xì)胞內(nèi)氧化反應(yīng)[16-21]，或替米沙坦提高了SERCA的活力，促使胞漿游離鈣離子重新被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器重吸收有關(guān)。

從觀察到的結(jié)果可以得出，替米沙坦對(duì)AngⅡ引起的胞漿游離鈣離子濃度的上升拮抗作用具有劑量相關(guān)性，高濃度的替米沙坦拮抗作用明顯優(yōu)于低濃度。但基于受體具有飽和性，組織或細(xì)胞中含有某種受體的數(shù)目是相對(duì)固定的，當(dāng)受體與配體結(jié)合達(dá)到飽和時(shí)，生物效應(yīng)并不會(huì)因?yàn)榕潴w數(shù)目的增加而又有增強(qiáng)。故此，替米沙坦或許存在拮抗AngⅡ受體外的其他保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用機(jī)制，如阻斷鈣離子從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中釋放、提高SERCA的活力加快胞內(nèi)游離鈣離子的重吸收等，以終止和（或）延緩細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。

綜上所述，替米沙坦可通過影響AT1受體、IP3受體及SERCA的活力等保護(hù)降低內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子水平，減少細(xì)胞鈣超載，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。

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（收稿日期：2014-10-28 本文編輯：程 銘）