王自力，蔣會(huì)會(huì)，張翥，魏學(xué)良，別應(yīng)堂，張家驊

(1．西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，重慶400715；2．重慶市光大集團(tuán)有限公司，重慶 400020)

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川芎嗪對(duì)LPS致傷奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的TLR4和BNBD4 mRNA表達(dá)的影響

王自力1，2，蔣會(huì)會(huì)1，張翥1，魏學(xué)良1，別應(yīng)堂2，張家驊1

(1．西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，重慶400715；2．重慶市光大集團(tuán)有限公司，重慶 400020)

為探討脂多糖(LPS)對(duì)奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞TLR4和BNBD4 mRNA表達(dá)的影響及川芎嗪的調(diào)控作用，體外培養(yǎng)奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，并分為對(duì)照組、LPS組、川芎嗪組(高、中、低濃度)，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法對(duì)各組細(xì)胞TLR4和BNBD4 mRNA表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明：LPS可顯著刺激奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞TLR4及BNBD4 mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.05)，川芎嗪可抑制LPS誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞TLR4升高作用，并能促進(jìn)BNBD4 mRNA表達(dá)。提示川芎嗪可干預(yù)LPS誘導(dǎo)的奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)，并促進(jìn)其分泌β-防御素起到改善子宮內(nèi)膜炎的作用。

川芎嗪；脂多糖；子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞；表達(dá)

奶牛子宮內(nèi)膜炎是奶牛產(chǎn)后常見疾病，主要原因是病原微生物如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等感染奶牛子宮內(nèi)膜，導(dǎo)致奶牛子宮內(nèi)膜發(fā)生炎性反應(yīng)，引起子宮內(nèi)膜充血、炎性物分泌增多，造成繁殖障礙引起經(jīng)濟(jì)損失[1]。研究表明，LPS是大腸桿菌的細(xì)胞壁重要組成成分之一，可誘導(dǎo)嚴(yán)重的組織炎癥過程；Toll樣受體是介導(dǎo)先天免疫的受體(TLRs)，其中TLR4是介導(dǎo)LPS誘發(fā)和加重組織炎癥反應(yīng)的重要受體；防御素是一種高效抗菌多肽，可直接殺菌，抵御入侵機(jī)體的病原微生物，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答、組織創(chuàng)傷修復(fù)，在介導(dǎo)獲得性免疫反應(yīng)過程中起著重要作用，而BNBD4是β-防御素中的重要成員之一[2]。川芎具有活血祛瘀、行氣止痛功效，常用于治療奶牛子宮內(nèi)膜炎等產(chǎn)科疾病。為了探討其治療奶牛子宮內(nèi)膜炎的作用機(jī)制，本文通過體外培養(yǎng)奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，研究川芎的主要有效成分川芎嗪對(duì)LPS致傷奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的TLT4和BNBD4 mRNA表達(dá)的影響，以探討川芎嗪在奶牛子宮內(nèi)膜炎防治中的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 川芎嗪(批號(hào)110817-201006)，中國(guó)藥品生物制品檢定所；RPMI-1640培養(yǎng)基(批號(hào)1621404)，胎牛血清(批號(hào)1315148)，均購自GIBCO公司；LPS(O55:B5)(批號(hào)L2880)、青鏈霉素溶液(批號(hào)20150513)，DMSO(批號(hào)BCBJ4508V)，MTT(批號(hào)410C0516)，均購自Sigma公司； TRIZOL(批號(hào)A9507-1)、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)AK3101)，購自大連TakaRa公司；SYBRGreen MIX液(批號(hào)172-5271)，購自BIO-RAD公司；TLR4、BNBD4引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2 儀器設(shè)備 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)BIO-RAD)，酶標(biāo)儀(680型，美國(guó)BIO-RAD)，臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(日本HITACHI)，梯度PCR儀(美國(guó)Eppendorf)。

1.3 方法

1.3.1 奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞培養(yǎng) 參照文獻(xiàn)[3]方法培養(yǎng)奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞。無菌手術(shù)采集3歲齡荷斯坦空懷經(jīng)產(chǎn)奶牛子宮粘膜層，剪成1 mm3大小，于37 ℃0.1%的Ⅱ型膠原酶溶液中振蕩消化40 min后，經(jīng)過200目細(xì)胞篩過濾，濾液經(jīng)1000 r/min離心5 min后，將所得細(xì)胞經(jīng)RPMI1640完全培養(yǎng)基清洗和懸浮3次，臺(tái)盼藍(lán)計(jì)算細(xì)胞活性，培養(yǎng)和純化細(xì)胞。

1.3.2 奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞增殖 采用MTT法檢測(cè)奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的增殖。將純化后的奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞用0.5%胰酶消化后，將5×104個(gè)/mL的細(xì)胞液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，分為對(duì)照組、川芎嗪組(分別為5、10、20、40 μg/mL濃度組)，每孔100 μL，各組設(shè)10個(gè)重復(fù)，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h后吸棄培養(yǎng)基。

分別向各孔加入含川芎嗪液，使之終濃度分別為0、5、10、20、40 μg/mL，各孔體積為100 μL，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)48 h后，加入5 mg/mL 的MTT液20 μL培養(yǎng)4 h后，吸棄培養(yǎng)基后加入150 μL DMSO震蕩溶解10 min后，于490 nm測(cè)定OD值。

1.3.3 奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞TLR4及BNBD4 mRNA的表達(dá) 將純化培養(yǎng)的奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞調(diào)整為5×104個(gè)/mL，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)48 h后，吸棄培養(yǎng)基后，向各孔細(xì)胞內(nèi)加入無血清RPMI1640培養(yǎng)基，分別向各低、中、高濃度組細(xì)胞加入川芎嗪溶液，參照細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果，使川芎嗪終濃度分別為5、10、20 μg/mL(簡(jiǎn)稱低、中、高劑量組)，對(duì)照組和模型組不添加任何藥物，每組5個(gè)重復(fù)。

各組細(xì)胞于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)6 h后，分別向除對(duì)照組外的各孔細(xì)胞內(nèi)加入LPS溶液以使終濃度為1 μg/mL，對(duì)照組加入相同體積的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，于相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h后吸棄培養(yǎng)上清液， HBSS液沖洗細(xì)胞1次后，TRIZOL抽提各孔細(xì)胞總RNA，并按照試劑盒說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)物保存于-20 ℃條件保存。

1.3.4 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)GenBank中牛TLR4、BNBD4及β-actin基因序列，由上海生工生物工程股份有限公司合成。各基因引物序列如表1所示。

表1 各基因引物序列表

1.3.5 奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中TLR4和BNBD4 mRNA的檢測(cè) 提取奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)擴(kuò)增目標(biāo)基因序列，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 min，95 ℃變性5 s，退火(TLR4 56 ℃、BNBD4 54 ℃)30 s，65 ℃延伸5 s，共進(jìn)行39個(gè)循環(huán)，95 ℃延伸30 s。

2 結(jié)果與分析

2.1 川芎嗪對(duì)奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞增殖的影響 由圖1可知，分別向奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)基中加入5、10、20、40 μg/mL的川芎嗪，均對(duì)各孔奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的增殖無顯著影響(P>0.05)。

圖1 川芎嗪對(duì)奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞增殖的影響(n=10)(各組之間相比，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同)

2.2 川芎嗪對(duì)奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞TLR4 mRNA表達(dá)的影響 由表2可知，含有1 μg/mL LPS組及低劑量組的奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞TLR4 mRNA表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而中劑量組、高劑量組細(xì)胞TLR4 mRNA表達(dá)均顯著低于LPS組及對(duì)照組(P<0.05)。

表2 川芎嗪對(duì)奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞TLR4 mRNA表達(dá)的影響(n=5)

2.3 川芎嗪對(duì)奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞BNBD4 mRNA表達(dá)的影響 由表3可知，LPS組及低劑量組奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞BNBD4 mRNA表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，中劑量組、高劑量組細(xì)胞BNBD4 mRNA均顯著低于LPS組及對(duì)照組(P<0.05)。

表3 川芎嗪對(duì)奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞BNBD4 mRNA表達(dá)的影響(n=5)

3 討論與小結(jié)

川芎具有活血行氣、祛風(fēng)止痛功效，常用于難產(chǎn)、胎衣不下等產(chǎn)科疾病[4]。川芎嗪是傘形科藁本屬植物川芎根提取的生物堿成分，是川芎的主要有效成分之一，常用于防治腦缺血、缺氧再灌注損傷及腦梗死等，具有改善微循環(huán)、抗血栓、改善血液流變學(xué)、清除氧自由基、減輕和抑制哮喘的氣道炎癥、抗癌等功效[5]。

本研究表明，5、10、20、40 μg/mL的川芎嗪均對(duì)奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞增殖無明顯影響，即均對(duì)奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞無細(xì)胞毒性。因此，本研究選用5、10、20 μg/mL三個(gè)濃度的川芎嗪進(jìn)行后續(xù)研究。同時(shí)，本研究表明10、20 μg/mL的川芎嗪可顯著抑制奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞TLR4 mRNA的表達(dá)，可抑制LPS誘導(dǎo)的奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞炎性反應(yīng)的發(fā)生，且5、10、20 μg/mL的川芎嗪均能顯著促進(jìn)奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞BNBD4 mRNA 的表達(dá)(P<0.05)?，F(xiàn)有研究表明，川芎嗪治療急性冠狀動(dòng)脈綜合征中具有抗炎及促纖溶作用，可有效降低血漿C反應(yīng)蛋白、血清淀粉樣蛋白及纖溶酶原抑制劑-1的濃度[6]。

研究表明，TLR4可識(shí)別病原體，可向胞內(nèi)傳遞信號(hào)激活NF-κB和AP-1等轉(zhuǎn)錄因子而促使細(xì)胞啟動(dòng)一系列免疫炎癥反應(yīng)，清除入侵的病原微生物，例如產(chǎn)生許多可擴(kuò)大免疫炎癥反應(yīng)、增強(qiáng)殺菌作用的細(xì)胞因子IL-1，IL-6，IL-8，IL-12及TNF-α等引發(fā)和加重炎癥反應(yīng)[7]。現(xiàn)有研究表明，川芎嗪能抑制大鼠動(dòng)脈粥樣硬化形成中TLR4表達(dá)而達(dá)到抗炎以及動(dòng)脈粥樣硬化的功效[8]。因此，結(jié)合本研究結(jié)果可知，川芎嗪可通過干預(yù)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞TLR4 受體的表達(dá)，進(jìn)而控制TLR4下游的炎性信號(hào)通路及炎性細(xì)胞因子的表達(dá)和分泌，參與控制局部炎癥反應(yīng)，起到防治子宮內(nèi)膜炎的作用。

由本研究可知，LPS可誘導(dǎo)奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞BNBD4 mRNA的表達(dá)增加，川芎嗪可進(jìn)一步促使BNBD4的表達(dá)，而BNBD4是β-防御素的重要成員之一。研究表明，β-防御素可由皮膚、黏膜、氣道等上皮細(xì)胞產(chǎn)生，分布在宿主機(jī)體與環(huán)境的界面位置，構(gòu)成機(jī)體抵御細(xì)菌、炎性細(xì)胞因子等侵襲的第一道化學(xué)屏障，其功能的失活與病原微生物定植、集落于皮膚和黏膜上皮而導(dǎo)致嚴(yán)重的感染關(guān)系非常密切[9]，對(duì)保護(hù)上皮細(xì)胞和黏膜免受感染起著屏障防御的作用[10]，且對(duì)G+、G-、包膜病毒和真菌均具有強(qiáng)烈的殺傷作用，且對(duì)動(dòng)物組織細(xì)胞無殺傷作用[11-12]。

綜上所述，川芎嗪具有控制LPS誘導(dǎo)的奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞炎性反應(yīng)的作用，并能促進(jìn)奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞分泌β-防御素，起到控制子宮內(nèi)膜炎癥的作用，初步闡釋了川芎在奶牛子宮內(nèi)膜炎中的作用效果及可能機(jī)制，但其分子信號(hào)機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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(編輯：侯向輝)

Effects ofLigustrazineon TLR4 and BNBD4 mRNA Expression Level of Endometrial Epithelial Cells in Cow Injured with LPS

WANG Zi-li1,2,JIANG Hui-hui1,ZHANG Zhu1,WEI Xue-liang1,BIE Ying-tang2,ZHANG Jia-hua1

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,SouthwestUniversity,Chongqing400715，China; 2.ChongqingGondaGroupCo.,Ltd,Chongqing400020，China)

In order to investigate the effects ofLigustrazineon the TLR4 and BNBD4 mRNA expression level of endometrial epithelial cells in cow injured with LPS,the endometrial epithelial cells are cultured in vitro,and then be divided into 3 groups: control group,LPS group,Ligustrazinegroup.And then the TLR4 and BNBD4 mRNA expression level in bovine endometrial epithelial cells were menstruated with real-time PCR.The results show that the LPS could raise the TLR4 and BNBD4 mRNA expression level in bovine endometrial epithelial cells in significantly,while theLigustrazinecould decrease the TLR4 mRNA expression level and increase the BNBD4 mRNA expression level in bovine endometrial epithelial cells in significantly.Therefore,Ligustrazinecould control the inflammatory reaction caused by LPS in bovine endometrial epithelial cells throughdecreasing the TLR4 mRNA expressing level and increasing the β- defensin’s expression.

Ligustrazine；LPS；endometrial epithelial cells；expression

重慶市應(yīng)用開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(cstc2014yykfB10001)；重慶市博士后特別資助項(xiàng)目(XM20120050)；中央高校基本業(yè)務(wù)經(jīng)費(fèi)(XDJK2016C098)

王自力，博士，副教授，從事中獸醫(yī)學(xué)及中藥免疫藥理學(xué)研究。

2015-11-12

A

1002-1280 (2015) 12-0032-04

S853.72