張鑫，吳劍平，李丹妮，嚴鳳，曹瑩，顧欣

(上海市動物疫病預防控制中心，上海 201103)

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UPLC-MS/MS檢測七種動物源食品中四環(huán)素類藥物殘留量的研究

張鑫，吳劍平，李丹妮，嚴鳳，曹瑩，顧欣*

(上海市動物疫病預防控制中心，上海 201103)

研究并優(yōu)化了七種不同動物源食品中四環(huán)素、土霉素、金霉素、多西環(huán)素殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。選用Na2EDTA-McIlvaine緩沖溶液作為提取液，超聲提取七種動物源食品中四環(huán)素類殘留，C18固相萃取小柱凈化，脫溶劑后用甲醇水溶解，在超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜上進行檢測。結(jié)果顯示，豬肉、雞肉、雞蛋、魚肉、牛奶中四環(huán)素類藥物殘留的最低定量限(LOQ)為10 μg/kg，豬腎、豬肝最低定量限(LOQ)為20 μg/kg，在定量限到2倍最大殘留限量(MRL)的添加范圍內(nèi)，回收率為75%±25%,RSD<10%，可以滿足農(nóng)業(yè)部235號公告的要求。

獸藥殘留；四環(huán)素類；優(yōu)化；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

隨著人民生活水平的提高，消費者對畜產(chǎn)品的需求更加多樣化，對食品質(zhì)量安全的要求也更高，四環(huán)素類等抗生素在動物性食品中的殘留問題受到關(guān)注。四環(huán)素類藥物是一類廣譜抗生素，在畜禽、水生生物等產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用此類藥物可對動物進行診斷、預防和治療疾病，同時促進動物生長、提高飼料轉(zhuǎn)化率，帶來可觀的經(jīng)濟效益。養(yǎng)殖中濫用四環(huán)素類藥物會導致動物體內(nèi)該類藥物的殘留，人們長期食用這種動物食品及其制品，會危及身體健康。農(nóng)業(yè)部在235號公告中規(guī)定了四環(huán)素類藥物在動物性食品中最高殘留限量(MRL)，以監(jiān)管養(yǎng)殖業(yè)規(guī)范用藥。目前已發(fā)布的檢測標準(農(nóng)業(yè)部958號公告-2-2007及GB/T 5009.116-2003)及文獻方法多為液相色譜法[1-2]，檢測限及靈敏度受到檢測器的局限。已發(fā)布的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測標準有兩個，GB/T 21317-2007中方法檢測限定為50 μg/kg，且未涉及雞蛋中四環(huán)素類殘留量的檢測方法，農(nóng)業(yè)部1025號公告-12-2008僅適用于豬肉、雞肉組織中四環(huán)素、土霉素及金霉素殘留量的檢測。已發(fā)表的相關(guān)文獻[3-5]針對不同基質(zhì)給出的檢測方法各異，給實際監(jiān)測工作帶來了不便。本文在已有工作的基礎(chǔ)上，針對我國消費量較大的豬肉、雞肉、雞蛋、魚肉、牛奶、豬肝、豬腎等7種組織，制定出相對統(tǒng)一的檢測方法，通過考察前處理操作和儀器條件對結(jié)果的影響，優(yōu)化檢測方法，為實現(xiàn)動物源性食品中四環(huán)素藥物殘留的確證檢測、有效監(jiān)控四環(huán)素類藥物的使用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Waters TQ Xevo串聯(lián)四極桿質(zhì)譜(ESI+)、固相萃取小柱(Waters HLB 3mL/60mg)、C18色譜柱(100 mm×3.0 mm，1.8 μm)；高速冷凍離心機(Allegra X-22R，美國Beckman Coulter)；水浴控溫氮吹儀(N-EVAP，上海安譜公司)。標準品：土霉素(純度98.5%)、四環(huán)素(純度96.5%)、金霉素(純度92%)、多西環(huán)素(純度98.7%)，均為SIGMA公司生產(chǎn)。乙腈、甲醇、甲酸(色譜純，德國Merk)；去離子水(自制，電阻率≥18 MΩ·cm)；草酸、磷酸二氫鈉、乙二胺四乙酸二鈉、檸檬酸，為化學純；高純氮、高純氬(純度均為99.999%，上海佳杰特種氣體公司)。

標準溶液的配置：精密稱取土霉素、四環(huán)素、金霉素、多西環(huán)素標準品各10 mg，用甲醇溶解制成1 mg/mL的標準貯備液。取土霉素、四環(huán)素、金霉素、多西環(huán)素貯備液適量，用甲醇配制成混合標準工作液，并用甲醇/水溶液(50:50，V/V)稀釋成濃度為1、10、20、50、100 ng/mL的標準曲線。

1.2 方法

1.2.1 液相色譜方法 色譜柱：C18柱(100 mm×3.0 mm，1.8 μm)；柱溫35 ℃；流速0.3 mL/min；流動相：A為乙腈，B為0.1%甲酸，采用梯度洗脫：20%A起始，4 min時變化至50%A，保持0.5 min，5 min時變化至20%A。

1.2.2 質(zhì)譜方法 離子源：ESI+；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測MRM；電離電壓3.2 kV；源溫150 ℃；霧化溫度500 ℃；錐孔氣流速50 L/h；霧化氣流速800 L/h。定性、定量離子對及錐孔電壓、碰撞電壓見表1。

表1 四環(huán)素類藥物的定性、定量離子對及錐孔電壓、碰撞電壓的參考值

1.2.3 前處理方法 提取方法：①豬肉、雞肉、雞蛋、魚肉：稱取5.00 g試樣于50 mL離心管中，準確加入15 mL提取液(McIlvaine- Na2EDTA緩沖液[2])，充分振蕩5 min，然后于0 ℃離心5 min(離心力8000 g)，轉(zhuǎn)移至另一潔凈離心管中，準確加入15 mL提取液重復提取一次，合并上清液備用。②豬肝、豬腎：稱取5.00 g試樣于50 mL離心管中，準確加入25 mL提取液，5%三氯乙酸5 mL，充分振蕩10 min，于0 ℃離心5 min，上清液備用。③牛奶：稱取5.00 g牛奶于50 mL離心管中，準確加入提取液定容至30 mL，充分振蕩5 min，0 ℃離心5 min，上清液備用。

凈化方法：HLB固相萃取小柱依次用甲醇、水、提取液各3 mL活化。取備用液6 mL過柱，用3 mL 5%甲醇水淋洗，抽干，用0.01 mol/L草酸甲醇溶液4 mL洗脫，收集洗脫液，60 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用1 mL甲醇/水溶液(50:50,V/V)溶解，過0.22 μm濾膜后上機測定。若待測樣品濃度超出線性范圍，用甲醇/水溶液(50:50,V/V)稀釋至線性范圍后上機測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系 土霉素、四環(huán)素、金霉素、多西環(huán)素標準曲線見圖1，數(shù)據(jù)表明在1～100 ng/mL范圍內(nèi)，四種藥物的線性相關(guān)系數(shù)R>0.999，線性良好。

圖1 四環(huán)素類標準曲線(曲線濃度范圍為1～100 ng/mL)(A：土霉素；B：四環(huán)素；C：金霉素；D：多西環(huán)素)

2.2 方法回收率 在確定樣品預處理方法后，選擇豬的肌肉、肝臟、腎臟，雞肉、雞蛋，牛奶，魚肉作為測試對象，進行加標回收率實驗，添加四環(huán)素類濃度為方法定量限、1/2MRL、MRL、2MRL四個濃度的試樣的樣品，考察方法的準確性和精密度。同一濃度做6次平行實驗，平均回收率R及標準偏差RSD見表2，結(jié)果表明，土霉素、金霉素、多西環(huán)素回收率達到70%～100%，四環(huán)素回收率達到50%～80%，RSD<10%，表明該方法對不同基質(zhì)樣品中不同含量的四環(huán)素類藥物的測定均有較好的準確度(圖2)。

表2 四環(huán)素類檢測準確性和精密度數(shù)據(jù)結(jié)果表

圖2 基質(zhì)添加回收MRM譜圖(A四環(huán)素類藥物標準品20 ng/mL；B空白豬肉中添加20 ng/g； C空白牛奶中添加20 ng/g； D空白豬腎中添加20 ng/g)

2.3 靈敏度、檢測限和定量限 UPLC-MS/MS對四環(huán)素類藥物的檢測靈敏度低至1 ng/mL(圖3)，信噪比S/N(Peak to Peak)均遠大于10，根據(jù)前處理方法的稀釋倍數(shù)為1，推測方法定量限可定為1 μg/kg，檢出限可以更低，但由于存在基質(zhì)干擾，1 μg/kg添加回收率超出100%，定量不準，因此本方法不能簡單用S/N>3來確定檢測限，S/N>10來確定定量限，考慮到添加回收實驗的結(jié)果，豬肉、雞肉、雞蛋、魚肉、牛奶中四環(huán)素類藥物殘留的最低定量限(LOQ)為10 μg/kg，豬腎、豬肝最低定量限(LOQ)為20 μg/kg，信噪比見圖4所示。

3 討論與小結(jié)

3.1 流動相的選擇 通過比較四種流動相甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸、乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.01 mol/L三氟乙酸梯度洗脫，發(fā)現(xiàn)流動相中未加入0.1%甲酸的情況下，四環(huán)素類藥物的電離效果較差，峰型對稱性差，在加入一定比例的0.1%甲酸后，得到了改善，0.01 mol/L三氟乙酸也有類似的效果，考慮到0.1%甲酸更適合質(zhì)譜，最終選擇乙腈∶0.1%甲酸作為流動相。

圖3 四環(huán)素類標準品MRM圖(濃度為1 ng/mL)

圖4 添加回收樣品MRM圖信噪比(A豬肉中四環(huán)素類藥物添加濃度10 μg/kg；B豬肝中四環(huán)素類藥物添加濃度20 μg/kg)

3.2 工作液稀釋溶劑的選擇 嘗試選擇溶劑分別為0.2%甲酸、0.2%甲酸/甲醇(80/20,V/V)、0.01 mol/L三氟乙酸/乙腈(50/50,V/V)、甲醇/水(20/80,V/V)、甲醇/水(50/50,V/V)等作為最終進樣前的樣品溶劑進行實驗，發(fā)現(xiàn)溶劑pH值對樣品的影響較大，而甲醇與水的比例對樣品的影響較小，但高有機相比例的溶劑對樣品殘渣的溶解性較好，為保持一致，標準品的稀釋溶劑選擇甲醇/水(50/50,V/V)。

3.3 提取溶劑的選擇 使用McIlvaine-Na2EDTA緩沖液、5%高氯酸溶液、乙腈三種提取溶劑，對四環(huán)素類藥物添加量為20 μg/kg的豬肉樣品進行提取，比較回收率發(fā)現(xiàn)，5%高氯酸溶液、乙腈對四種藥物的提取效率均在53%～70%之間，當提取溶劑為McIlvaine-Na2EDTA緩沖液時多西環(huán)素和金霉素的提取效率有明顯提高，分別達到74.8%和100.2%，而土霉素和四環(huán)素變化較小，分別為69.0%和65.3%，這主要是McIlvaine-Na2EDTA緩沖液競爭結(jié)合金屬離子，一定程度上減少了四環(huán)素類藥物與金屬離子的螯合反應(yīng)，保證藥物的游離性，有利于藥物在SPE柱上保留。

3.4 定量方法的選擇 根據(jù)前處理實驗情況發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過凈化后，絕對回收在50%～60%，嘗試選擇去甲基金霉素作為內(nèi)標，發(fā)現(xiàn)內(nèi)標與四環(huán)素類藥物的回收率不一致，因此仍選擇外標法定量，通過改進前處理方法以提高回收率。

3.5 去除蛋白方法的選擇 使用三氯乙酸(5%)、硅鎢酸(5%)、高氯酸(1%，2%，5%，10%)、正己烷去脂、濾紙過濾等凈化方法對豬肝樣品(添加量為20 μg/kg)的提取液進行凈化，比較回收率發(fā)現(xiàn)，對于不同基質(zhì)，結(jié)果有所不同。對于豬肉、雞肉、魚肉、牛奶、雞蛋等，加去蛋白或去脂的試劑意義不大，但對于豬肝、豬腎等，此步驟可以提高回收。使用三氯乙酸(5%)、高氯酸(1%或2%)可得到相對較高的回收率，其中土霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素和金霉素的回收率最高可達79.0%、68.2%、79.0%和98.5%。對于豬肝、豬腎樣品，實驗室可根據(jù)實際情況選擇三氯乙酸(5%)、高氯酸(1%或2%)作為凈化試劑。

3.6 固相萃取柱的選擇 比較了Waters HLB、BondElut C18、Agilent OPT固相萃取小柱的凈化效率，后兩者比HLB小柱略低，三種型號沒有明顯差異，C18填料的固相萃取小柱均可以滿足要求。同時，比較規(guī)格為3mL/60mg和6mL/150mg的HLB固相萃取小柱，發(fā)現(xiàn)相同的上樣量，6 mL小柱需要兩倍體積以上的溶劑洗脫才能與3 mL的小柱回收率相當，增加工作量及成本，而回收率沒有顯著差別，因此選擇規(guī)格為3mL/60mg的小柱。

3.7 固相萃取方法的選擇 C18填料的固相萃取小柱，通常使用甲醇、水活化，但是，四環(huán)素類藥物在弱酸性環(huán)境中更穩(wěn)定，因此使用提取液(McIlvaine- Na2EDTA緩沖液)提供弱酸性柱上環(huán)境，發(fā)現(xiàn)回收率提高10%。同時，提取液上樣量應(yīng)與SPE填料量相匹配，考察了對3mL/60mgWaters HLB固相萃取小柱上樣量分別為3、6、10 mL對回收率的影響，發(fā)現(xiàn)3 mL和10 mL均低于上樣量為6 mL時的回收率。

實驗結(jié)果顯示，本方法具有靈敏度高、準確性好的優(yōu)點，通過優(yōu)化前處理和儀器條件，提高了回收率。本文考察了該方法對多種基質(zhì)的適用性，并提出改進方案，給出不同基質(zhì)的定量限，是對現(xiàn)有標準的改進和補充，可為動物源食品中的四環(huán)素類殘留的檢測提供可靠的確證方法。

[1] 龐國芳,曹彥忠,張進杰,等.高效液相色譜法同時測定禽肉中土霉素、四環(huán)素、金霉素、強力霉素殘留的研究[J].分析測試學報,2005,4:61-63.[2] 張鑫,顧欣,嚴鳳,等.高效液相色譜法檢測畜禽肉中四環(huán)素類藥物殘留的條件優(yōu)化[J].化學分析計量,2010,5:55-58.

[3] 孫雷,張驪,劉琪,等.豬肉組織中四環(huán)素類藥物殘留檢測——高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法研究[J].中國獸藥雜志,2008,2:27-29.

[4] 劉艷華,張純萍,門立強,等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定雞肌肉組織中的四環(huán)素類藥物殘留[J].色譜,2006,2:171-173.

[5] 李月歡,劉志權(quán),陳硯朦,等．UPLC-ESI-MS/MS檢測畜、禽肉中土霉素、四環(huán)素、金霉素殘留量[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2008,1:96-98.

[6] 洪武興,孫良娟,劉益鋒,等.液質(zhì)聯(lián)用法檢測水產(chǎn)品中四環(huán)素類殘留[J].現(xiàn)代食品科技,2010,7:756-758.

[7] 賈薇,孫璐,史向國,等.液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定牛奶中4種四環(huán)素類藥物殘留量[J].沈陽藥科大學學報,2002,2:96-100.

[8] 岳振峰,邱月明,林秀云,等.高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定牛奶中四環(huán)素類抗生素及其代謝產(chǎn)物[J].分析化學,2006,9:1255-1259.

(編輯：侯向輝)

Optimized Determination of Tetracyclines in Seven Kinds of Animal Derived Food by UPLC/MS/MS

ZHANG Xin,WU Jian-ping,LI Dan-ni,YAN Feng,CAO Ying,GU Xin*

(ShanghaiAnimalDiseaseControlCenter，Shanghai201103，China)

A UPLC/MS/MS method for determination of the residues of tetracyclines(tetracycline，oxytetracycline，chlortetracycline and doxycycline)in seven different kinds of animal derived food was studied and optimized.The tetracyclines in seven kinds of animal derived food were pretreated with extraction by Na2EDTA-McIlvaine buffer solution，purification by C18 SPE column,dissolution by CH3OH/H2O(50/50,V/V) after desolvation，and then determined by UPLC/MS/MS.The results showed that the recoveries were in the range of 50%～100% when blank samples spiked with tetracyclines in 10 μg/kg or 20 μg/kg～2MRL,and the relative standard deviation was less than 10%.The method could satisfy the request of legislation on maximum residue limits in the ministry of agriculture 235 announcement.

veterinary residue；tetracyclines；optimize；UPLC/MS/MS

上海市市級農(nóng)口系統(tǒng)青年人才成長計劃(滬農(nóng)青字(2014)第2-5號)；上海市科技興農(nóng)重點攻關(guān)項目(滬農(nóng)科攻字(2013)第6-9號)

張鑫，碩士，畜牧師，從事獸藥殘留分析研究。

顧欣。E-mail：guxun@sh163.net

2015-10-27

A

1002-1280 (2015) 12-0036-07

S859.84