于遵波，張艷，吳銀良*

(1．中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；2.寧波市農業(yè)科學研究院，浙江寧波 315040)

?

克倫特羅在豬體內立體選擇性降解行為研究

于遵波1，張艷2，吳銀良2*

(1．中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；2.寧波市農業(yè)科學研究院，浙江寧波 315040)

為了解克倫特羅在豬體內是否存在立體選擇性降解行為，手性分離制備了克倫特羅單一對映體，然后對生豬進行飼喂含有克倫特羅外消旋體(2.0 mg/kg)和單一對映體(1.0 mg/kg)的飼料，7 d后進行屠宰，定期采集豬的肌肉、肝臟、腎臟、心臟、肺臟和尿液，測定克倫特羅對映體含量。結果表明，克倫特羅在豬體內存在立體選擇性降解行為，肝臟、腎臟和肺臟中對映體(右旋體/左旋體)比例較高，心臟和肌肉中的對映體比例相對較低；休藥3 d時，肝臟、腎臟、豬尿中的對映體比例均處于最高點。同時克倫特羅對映體在豬體內不存在相互轉化現(xiàn)象。該研究為科學評估動物性食品殘存的克倫特羅對人體健康造成的危害提供了科學依據(jù)。

克倫特羅；手性對映體；立體選擇性降解；液相色譜串聯(lián)質譜法

克倫特羅(Clenbuterol)俗稱“瘦肉精”，屬于選擇性β2-腎上腺素受體激動劑，生產中常用其外消旋體非法應用于畜牧業(yè)，用來提高酮體瘦肉率。然而，由于克倫特羅易在動物組織中形成殘留，曾多次發(fā)生嚴重的人畜中毒事故[1-2]。因此，克倫特羅在我國已禁止使用，但因其促生長效果好，違法使用的情況還時有發(fā)生。然而目前在評估克倫特羅對人體健康造成的危害時，對其是手性藥物這一特征未加以充分考慮，僅對該藥物作為純的單一化合物來看待[3-5]。而手性藥物不同異構體之間在毒性、致畸、致癌、致突變上往往存在差異，必然導致對其危害估計不是過高就是過低[6-8]。因此為更加科學評估該藥物對人體健康造成的危害，應對其進行立體選擇性降解行為進行研究。

隨著動物性食品安全得到全社會的重視，國際上對于獸用的手性藥物在動物體內的立體選擇性降解行為研究有所升溫，如Smith DJ分別對克倫特羅在雞和豬中的立體選擇性降解行為進行了研究，但豬體內豬肉樣品僅提供了0天的數(shù)據(jù)[9]，同時也未進行單一對映體飼喂試驗；Cristofol C等研究了牛靜脈注射阿苯噠唑后代謝產物阿苯噠唑亞砜在體液和組織中對映異構體比例隨時間變化情況[10]；但這些研究對單一對映體在畜禽體內是否存在轉化現(xiàn)象缺乏進一步的研究。而在國內，對于手性藥物在動物體內的立體選擇性降解行為和機理研究較少，僅有周志強課題組對手性農藥在兔子和大鼠中的立體選擇性降解行為和機理進行了研究和探索，而對獸用手性藥物在使用對象(畜禽)體內的立體選擇性代謝規(guī)律的研究尚為空白。為進一步探明克倫特羅在豬肉中的立體選擇性降解行為和了解單一對映體在畜禽體內是否存在轉化現(xiàn)象，本研究在建立豬組織克倫特羅對映體殘留量分析方法的基礎上進行了克倫特羅在豬體內立體選擇性降解試驗。通過研究，首次明確克倫特羅單一對映體在豬體內不存在對映體轉化現(xiàn)象。

1 材料和方法

1.1 儀器、試劑和材料 Waters 2695 Quattro MicroTM API高效液相色譜串聯(lián)質譜儀(美國Waters公司)；固相萃取儀(美國SUPELCO公司)；Sigma離心機(北京博勵行儀器有限公司)；勻質器(德國IKA公司)，-Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司)。鹽酸克倫特羅(99%)購于中國藥品生物制品檢定所；鹽酸克倫特羅-D9(100 μg/L)購于德國Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇(色譜純)購于美國默克公司；甲酸(色譜純)購于美國天地有限公司；SCX (500 mg/3 mL)購于Supelco公司；其他試劑均為分析純試劑?？瞻棕i肉樣品購于寧波市江東區(qū)歐尚超市，實驗用肉豬為健康肉豬，體重70 kg左右，用藥前測定是否含克倫特羅。

1.2 標準溶液的配制

1.2.1 外消旋體標準儲備液(500 μg/mL) 準確稱取含100.0 mg克倫特羅的鹽酸克倫特羅標準品于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得克倫特羅標準儲備液，單一克倫特羅對映體濃度為500 μg/mL。

1.2.2 標準工作液 將外消旋體標準儲備液用流動相逐級稀釋成2、10、20、50、100、200 μg/L的標準溶液(每個標準溶液含內標濃度為25 μg/L)，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 方法

1.3.1 單一對映異構體的制備 對映異構體制備色譜分離條件：流動相：V(甲醇)：V(乙酸)：V(三乙胺)=99.98：0.01：0.01，進樣量50 μL，柱溫30 ℃。在此條件下，先出峰的為(-)-對映體，后出峰的為(+)-對映體，收集單一對映異構體。合并流出液，旋轉濃縮至干，加入甲醇溶解并定容至50 mL，根據(jù)上述色譜條件，在240 nm處測定兩對映異構體濃度。

1.3.2 動物試驗方法

1.3.2.1 飼料配制 將上述外消旋體儲備液和1.3.1項中兩對映異構體溶液分別和500 g經粉碎的豬配合飼料混合，振蕩混合2 h后，在60 ℃烘箱中烘干。再在動物試驗前，與養(yǎng)殖場提供的豬飼料混合，飼料中外消旋體的濃度為2.0 mg/kg，單一對映異構體的濃度為1.0 mg/kg。

1.3.2.2 喂藥和取樣時間 外消旋體實驗和單一對映體實驗的動物數(shù)均為6頭，用含有藥物的飼料連續(xù)飼喂7 d后進行屠宰，分別于0，3，7，14，21和28 d采集每頭豬的肌肉、肝臟、腎臟、心臟、肺臟和尿液。

1.3.3 測定方法 降解試驗樣品中克倫特羅對映體濃度的測定方法參考文獻[11]，所有組織樣品測定方法均一致，豬尿樣品取樣量為5.0 mL。整個方法中僅對流動相的流速作了調整，由1.0 mL/min改為0.5 mL/min。

2 結果與分析

2.1 單一對映異構體的制備 經測定，制備的單一對映異構體甲醇溶液中(-)-對映體和(+)-對映體的濃度分別為1499 μg/mL和1529 μg/mL，經計算質量分別為74.95 mg和76.45 mg。

2.2 外消旋體實驗結果 外消旋體的樣品測定實驗結果和對映異構體比例均詳見表1，從表1中可見，0 d時(-)-對映體和(+)-對映體的濃度均是豬尿中最高，然后(-)-對映體依次是肺臟、肝臟、腎臟、心臟和肌肉，(+)-對映體依次是肝臟、肺臟、腎臟、心臟和肌肉。28 d降解后，除肺臟中的(+)-對映體濃度高于1.0 μg/kg外，其余組織和尿液中的(-)-對映體和(+)-對映體濃度均低于1.0 μg/kg。同時從表中可見，肝臟、腎臟和肺臟中對映異構體比例較高，心臟和肌肉中的對映異構體比例相對較低；休藥3 d時，肝臟、腎臟、豬尿中的對映異構體比例均處于最高點。外消旋體實際樣品測定圖譜詳見圖1，從圖中可見(-)-對映體和(+)-對映體峰形和分離均較好。

表1 克倫特羅外消旋體樣品測定結果和對映體比例

圖1 鹽酸克倫特羅外消旋體0 d肺臟和0 d肝臟MRM色譜圖(1.(-)-克倫特羅-D9對映體；2.(+)-克倫特羅-D9對映體；3.(-)-克倫特羅對映體；4.(+)-克倫特羅對映體)

2.3 單一對映體實驗結果 單一對映體的樣品測定實驗結果詳見表2，從表2中可見，(-)-對映體和(+)-對映體單一實驗時，均不存在在豬體內轉化現(xiàn)象；同時從表2可知，(-)-對映體實驗時0 d測定結果肺臟中含量最高，其次是豬尿、肝臟、腎臟、心臟和肌肉，(+)-對映體實驗時0 d測定結果肝臟中含量最高，其次是肺臟、豬尿、腎臟、心臟和肌肉。28 d降解后，(-)-對映體實驗時，除肝臟樣品中的濃度為1.06 μg/kg外，其余樣品均低于1.0 μg/kg；(+)-對映體實驗時，除腎臟和肺臟樣品中的濃度分別為1.03 μg/kg和1.34 μg/kg外，其余樣品均低于1.0 μg/kg。

表2 克倫特羅單一對映體實驗樣品測定結果

續(xù)表

3 討論和小結

3.1 單一對映體的制備 目前市場上尚無法購買到單一克倫特羅對映體原料藥或標準品，為達到進行單一對映體實驗的需要，必須通過手性分離制備出克倫特羅單一對映體?？紤]到本實驗對單一對映體需要量不是特別大，本實驗采用對標準儲備液進行進樣，手性色譜柱(Astec CHIROBIOTICTMV)分離，分別收集兩個組分來制備單一對映體。

3.2 外消旋體實驗 對于β2-腎上腺素受體激動劑來說，引起副作用或急性毒性的主要成分是其左旋異構體，而通過外消旋體實驗可知，克倫特羅左旋異構體代謝較快，特別是在肝臟、腎臟和肺臟組織中所占比例較小，因此在科學評估肝臟、腎臟和肺臟組織中殘存的該藥物對人體健康造成的危害時，有必要對其進行對映異構體分析。從本實驗的肌肉中克倫特羅對映體實驗數(shù)據(jù)看，評估肌肉中殘存的該藥物對人體健康造成的危害時，對映異構體分析的必要性較小。從實驗數(shù)據(jù)看，外消旋體實驗的結果與Smith DJ等的實驗結果一致[9]；同時本實驗首次證明了肌肉樣品隨著消除時間的延長，肌肉中對映體比例波動較小。

3.3 單一對映體實驗 本研究首次通過單一對映體實驗明確了克倫特羅對映體在豬體內不存在對映體轉化現(xiàn)象。同時從0 d測定結果可知，豬內臟器官中肺臟和肝臟中克倫特羅含量最高，且不同個體之間兩者存在較大差異，有的肺臟中克倫特羅含量比肝臟中高，而有的個體肝臟中克倫特羅含量比肺臟中高。

本研究通過分離和制備了克倫特羅單一對映異構體，獲得的(-)-對映體和(+)-對映體質量分別為74.95、76.45 mg。通過飼喂含有鹽酸克倫特羅外消旋體、單一對映體的飼料，進行了外消旋體和單一對映體在豬體內的立體選擇性降解試驗，分析不同時間采集的樣品可知克倫特羅在豬體內代謝存在立體選擇性，其中左旋異構體代謝較快，特別是在肝臟、腎臟和肺臟組織中所占比例較小，因此在科學評估肝臟、腎臟和肺臟組織中殘存的該藥物對人體健康造成的危害時，有必要對其進行對映異構體分析；同時單一對映體在豬體內不存在轉化現(xiàn)象。

[1] Elliott C T,Crooks S R.Monitoring for clenbuterol abuse in N.Ireland 1989-1994 [J].Vet Q，1996,18(2):41-44.

[2] Martine Z,Navaari J E．Food poisoning related to consumption of illicit β-agonist in liver [J].Lancet,1990,336(8726):1311-1315.

[3] 黃顯會,蔡勤仁,劉 戎,等.克倫特羅在豬組織和尿液中殘留消除規(guī)律研究[J].動物毒物學,2003,18(1): 32-37.

[4] Smith D J,Paukson G D.Distribution,elimination,and residues of [14C]clenbuterol HCL in Holstein calves[J].J Anim Sci,1997,75:454-461.

[5] Malucdlli A,Ellebdorff F,Meyer H H D.Tissue distribution and residues of clenbuterol,salbutamol,and terbutaline in tissues of treated broiler chicks[J].J Anim Sci,1994,72:1555-1560.

[6] Rentsch K M.The importance of stereoselective determination of drugs in the clinical laboratory[J].J Biochem Bioph Meth，2002,54(1):l-9.

[7] Lu X M,Liu P,Chen H S,etal.Enantioselective pharmacokinetics of mabuterol in rats studied using sequential achiral and chiral HPLC[J].Biomed Chromatogr，2005,19(9):703-708.

[8] Awadallah B,Schmidt P C,Wahl M A.Quantitation of the enantiomers of ofloxacin by capillary electrophoresis in the parts per billion concentration range for in vitro drug absorption studies[J].J Chromatogr B，2003,988(1):135-143.

[9] Smith D J.Stereochemical composition of clenbuterol residues in edible tissues of swine[J].J Agri Food Chem,2000,48(12):6036-6043.

[10]Cristofol C,Virkel G,Alvarez L,etal.Albendazole sulfoxide enantiomeric ratios in plasma and target tissues after intravenous administration of ricobendazole to cattle[J].J Vet Pharmacol Ther，2001,24:117-124.

[11]陳國,劉勇軍,呂燕,等.液相色譜串聯(lián)質譜法測定豬肉中克倫特羅手性對映體殘留量[J].肉類研究,2015,29(5): 22-26.

(編輯：侯向輝)

Study on the Stereochemical Degradation of Clenbuterol in Swine Edible Tissues

YU Zun-bo,ZHANG Yan2,WU Yin-Liang2*

(1.ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China;2.TheNingboAcademyofAgriculturalSciences，Zhejiang，Ningbo315040,China)

Two single enantiomers had been acquired by chiral separation to investigate whether there is a stereochemical degradation behavior in swine tissues for clenbuterol.Then,experiments were carried out in swine by feeding diets with 2.0 mg/kg of clenbuterol and 1.0 mg/kg of its single clenbuterol enantiomer for consecutive 7 days,respectively.After 7 d,the swine tissues (muscle,heart,lung,liver and kidney) and urine samples were collected regularly,and the content of clenbuterol enantimers had been determined by LC-MS/MS.After residual data analysis,there is stereochemical degradation behavior in swine tissues for clenbuterol.The ratio of (+) stereoisomer/(-) stereoisomer is higher than 1.5 for most of liver,lung and kidney samples when the swine had been fed with clenbuterol diets; and the ratio of (+) stereoisomer/(-) stereoisomer is between 0.8 and 1.25 for muscle and heart samples.For liver,kidney and urine samples,the ratio of (+) stereoisomer/(-) stereoisomer is highest at 3 d interval.Moverover,there is not mutual transformation for clenbuterol enantiomer in swine tissues.Finally,the experiment provide scientific basis for scientific assessment of damage of residual clenbuterol in animal derived food.

clenbuterol; enantiomers; stereochemical degradation；liquid chromatography with tandem mass spectrometry

寧波市重大科技攻關項目(2013C11003)

于遵波，獸醫(yī)師，博士，從事獸藥安全性評估研究。

吳銀良。E-mail：wupaddyfield@sina.com

2015-10-12

A

1002-1280 (2015) 12-0027-05

S859.84