三氧化二砷誘導(dǎo)骨肉瘤U2OS細(xì)胞凋亡的作用

葉　榮，張曉峰，汪　淵

1.210028，武警江蘇總隊(duì)南京醫(yī)院骨科；2.441300　隨州，湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬隨州醫(yī)院病理科

三氧化二砷誘導(dǎo)骨肉瘤U2OS細(xì)胞凋亡的作用

葉榮1，張曉峰1，汪淵2

1.210028，武警江蘇總隊(duì)南京醫(yī)院骨科；2.441300隨州，湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬隨州醫(yī)院病理科

【摘要】目的探討三氧化二砷(arsenic trioxide, AS2O3)誘導(dǎo)骨肉瘤U2OS細(xì)胞凋亡的作用。方法將AS2O3按不同濃度(0、4、8 μmol/L)作用于細(xì)胞24 h后，分別通過光鏡、MTT法、Hochst33342染色檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況，另以8 μmol/L的AS2O3作用細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀分別在8、16、24 h后，觀察細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果AS2O3可抑制骨肉瘤U2OS細(xì)胞的增殖，濃度越大，抑制越強(qiáng)，4 μmol/L的AS2O3作用細(xì)胞24 h后，增殖率為(66.32±5.15)%，8 μmol/L的AS2O3作用細(xì)胞24 h后，增殖率為(26.73±9.36)%，并且作用時(shí)間越長，抑制作用越強(qiáng)，8 μmol/L的AS2O3作用于U2OS細(xì)胞8、16、24 h后，凋亡率分別為21.16%，36.15%，47.13%。結(jié)論AS2O3可誘導(dǎo)骨肉瘤U2OS細(xì)胞的凋亡，抑制腫瘤的增殖。

【關(guān)鍵詞】三氧化二砷；骨肉瘤；凋亡

【中國圖書分類號(hào)】R738.1

A study of arsenic trioxide to induce apoptosis of osteosarcoma U2OS cells

YE Rong1, ZHANG Xiaofeng1， and WANG Yuan2.1.Orthopaedic Department, Nanjing Armed Police Force Hospital, Nanjing 210028, China；2.Pathology Department,Suizhou Hospital, Hubei University of Medicne,Suizhou 441300,China

【Abstract】ObjectiveTo study the effect of arsenic trioxide on inducing apoptosis of osteosarcoma U2OS cells in vitro. MethodsOsteosarcoma U2OS cells were treated with arsenic trioxide at different concentrations(0，4 μmol/L，8 μmol/L) for 24 h, respectively, then were observed under microscope,by MTT assay and Hochst33342 staining method. U2OS cells were treated with arsenic trioxide at 8 μmol/L and then detected by flow cytometry at 8 h, 16 h and 24 h. ResultsAS2O3could inhibit U2OS cells growth, the U2OS cells proliferation rate was (66.32±5.15)% after treatment with arsenic trioxide at 4umol/L concentration, and (26.73±9.36)% at 8 μmol/L concentration. The U2OS cells apoptosis rate was 21.16%，36.15%，47.13%respectively at 8 h, 16 h, 24 h after treatment with AS2O3. The effect of arsenic trioxide on inhibiting U2OS cells growth is dependent on time and concentration. ConclusionsAS2O3can induce apoptosis of osteosarcoma U2OS cells and inhibit the cells growth.

【Key words】arsenic trioxide; osteosarcoma; apoptosis

AS2O3最早用于急性早幼粒細(xì)胞白血病的治療，目前隨著對(duì)其研究的深入，發(fā)現(xiàn)對(duì)于其他系腫瘤細(xì)胞也有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用[1,2]。有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AS2O3對(duì)于骨肉瘤可抑制其生長并誘導(dǎo)其凋亡[3]，在臨床中已有學(xué)者利用AS2O3作為治療Ⅲ期骨肉瘤的化療藥物[4]。本研究初步探討了AS2O3對(duì)于U2OS骨腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。

1材料與方法

1.1材料U2OS細(xì)胞采購自中科院上海細(xì)胞庫，三氧化二砷(北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司)，溶于胎牛血清 (Gibco公司)培養(yǎng)液中，AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco公司)，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT Sigma公司)，Hochst33342試劑(碧云天生物技術(shù)研究所)，電子顯微鏡、免疫熒光顯微鏡(日立公司，日本)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(NUAIRE公司，美國)，流式細(xì)胞儀(BD公司，美國)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)U2OS細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中(含10%胎牛血清、1%青霉素及鏈霉素)，置于37 ℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，2~3 d傳代1次。

1.2.2形態(tài)學(xué)觀察0.25%胰酶消化對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，計(jì)數(shù)后，按5×104/ml將細(xì)胞接種于24孔板，待細(xì)胞貼壁后，將AS2O3按濃度(0、4、8 μmol/L)作用于細(xì)胞24 h后，電鏡下觀察細(xì)胞增殖情況，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.2.3MTT法檢測(cè)0.25%胰酶消化對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，計(jì)數(shù)后，按5×104/ml將細(xì)胞接種于24孔板，待細(xì)胞貼壁后，將AS2O3按濃度(0、4、8 μmol/L)作用于細(xì)胞24 h后，加入MTT液20 μl繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去上清液，每孔加DMSO150 μl避光震蕩10 min，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490 nm波長下檢測(cè)各孔吸光度值。細(xì)胞增殖率(%)=AS2O3作用組OD值/對(duì)照組OD值×100%。

1.2.4Hochst33342染色檢測(cè)將蓋玻片于70%酒精中浸泡5 min后，PBS洗3遍，再用細(xì)胞培養(yǎng)液洗1遍，置于6孔板內(nèi)，0.25%胰酶消化對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，計(jì)數(shù)后，按5×104/ml將細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁后，將AS2O3按濃度(0、4、8 μmol/L)作用于細(xì)胞24 h后，吸去上清液，加入0.5 ml 4%多聚甲醛固定，過夜后，吸去固定液，PBS洗2遍，加入0.5 ml Hochst33342染色液染色5 min，PBS洗2遍，滴1滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細(xì)胞的蓋玻片。免疫熒光顯微鏡檢測(cè)，激發(fā)波長在350 nm左右，發(fā)射波長在460 nm左右。

1.2.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)0.25%胰酶消化對(duì)數(shù)生

長期細(xì)胞，計(jì)數(shù)后，按5×104/ml將細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁后，將AS2O3按濃度8 μmol/L作用于細(xì)胞。分別于作用8 、16 、24 h后，收集細(xì)胞，按照AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

2結(jié)果

2.1AS2O3對(duì)U2OS細(xì)胞形態(tài)的影響未加入AS2O3的U2OS細(xì)胞貼壁良好，呈上皮形。而加入AS2O3的U2OS細(xì)胞貼壁較少，細(xì)胞數(shù)量較少，可見較多的細(xì)胞凋亡，而且這種凋亡存在濃度依賴性，藥物劑量越大，細(xì)胞生長越受抑制(圖1)。

圖1　不同濃度AS2O3作用U2OS細(xì)胞24 h后的細(xì)胞形態(tài)(×40)

2.2MTT結(jié)果不同濃度AS2O3(0、4、8 μmol/L)作用于U2OS細(xì)胞24 h后的細(xì)胞增殖率分別為(91.22±6.28)%，(66.32±5.15)%，(26.73±9.36)%，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，細(xì)胞的增殖率隨著藥物濃度的上升而下降 (圖2)。

圖2　不同濃度AS2O3作用U2OS細(xì)胞24 h后，

2.3Hochst33342染色檢測(cè)結(jié)果不同濃度AS2O3(0、4、8 μmol/L)作用于U2OS細(xì)胞24 h后， Hochst33342染色后，高濃度AS2O3作用U2OS細(xì)胞后，可見不少凋亡細(xì)胞，細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)濃縮，細(xì)胞染色加深，低濃度AS2O3作用U2OS細(xì)胞后，可見相對(duì)少一點(diǎn)的凋亡細(xì)胞，而未加入AS2O3的U2OS細(xì)胞中凋亡細(xì)胞較少(圖3)。

2.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果AS2O3可以誘導(dǎo)U2OS細(xì)胞的凋亡，細(xì)胞凋亡率隨著AS2O3作用時(shí)間的延長而增加，8 μmol/L的AS2O3作用于U2OS細(xì)胞8 、16 、24 h后，凋亡率分別為21.16%，36.15%，47.13%(圖4)。

圖3　不同濃度AS2O3作用于U2OS細(xì)胞24 h后的Hochst染色熒光檢測(cè)(×40)

圖4　流式細(xì)胞儀檢測(cè)U2OS細(xì)胞凋亡率

3討論

AS2O3可通過Bax，Bcl-2，Bcl-xl等多種信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[5,6]。本研究發(fā)現(xiàn)，AS2O3對(duì)于骨肉瘤細(xì)胞的抑制具有明顯的時(shí)間和劑量依賴性，當(dāng)AS2O3濃度為4 μmol/L時(shí)，即可抑制腫瘤細(xì)胞增殖；當(dāng)濃度達(dá)到8 μmol/L時(shí)，可更加明顯抑制腫瘤細(xì)胞增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著作用時(shí)間的延長，AS2O3對(duì)于骨肉瘤細(xì)胞有明顯的抑制。本研究利用流式細(xì)胞儀測(cè)試了在8 μmol/L濃度的AS2O3作用下，從8 h到24 h可見U2OS細(xì)胞凋亡率明顯增加。既往研究發(fā)現(xiàn)小劑量AS2O3主要抑制腫瘤細(xì)胞增殖，大劑量才能對(duì)腫瘤細(xì)胞有殺傷作用，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和體外研究亦發(fā)現(xiàn)，對(duì)于實(shí)體的惡性腫瘤，只有增加AS2O3的濃度才能達(dá)到治療效果[7]。目前的研究認(rèn)為，AS2O3抑制腫瘤細(xì)胞增殖的機(jī)制在于誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡[8]，對(duì)白血病的作用機(jī)制體現(xiàn)在其可下調(diào)腫瘤細(xì)胞Bcl-2的表達(dá)，或者選擇性地與腫瘤細(xì)胞結(jié)合蛋白結(jié)合，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡[9]，對(duì)于骨肉瘤細(xì)胞的抑制主要體現(xiàn)在AS2O3抑制了Hedgehog通路的激活導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡[10]，AS2O3可阻止膠質(zhì)瘤(glioma-associated oncogene homolog，GLI)相關(guān)癌基因靶基因的轉(zhuǎn)錄，而GLI1和GLI2可上調(diào)Bcl-2和Bcl-xl的表達(dá)[11]，從而誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。另外有研究[12]在利用AS2O3抑制尤文肉瘤細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，AS2O3可直接與GLI靶基因結(jié)合從而抑制GLI的轉(zhuǎn)錄?；钚匝?reactive oxygen species， ROS)是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中一個(gè)重要的因子，ROS的積聚可導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡，實(shí)驗(yàn)證明暴露于AS2O3的腫瘤細(xì)胞可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS水平的上升，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[8, 13,14]。過氧化物酶可以通過轉(zhuǎn)化過氧化氫為氧分子和水分子，從而降低細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，是清除細(xì)胞內(nèi)ROS和維持細(xì)胞生存很重要的機(jī)制，過氧化物酶受抑制可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)清除高水平ROS的能力的降低。AS2O3誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用體現(xiàn)在抑制過氧化物酶，引起ROS積聚[8]。

有研究表明，AS2O3可抑制核轉(zhuǎn)錄因子kappa B表達(dá)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[15]，這可能存在爭(zhēng)論。另有研究[16]認(rèn)為，AS2O3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與JNK或者NF kappa B沒有必然聯(lián)系，AS2O3可以增加JNK的磷酸化，但是予以JNK抑制藥并不會(huì)影響腫瘤細(xì)胞的生長，而AS2O3并不會(huì)影響NF kappa B的活化[10]。

本研究只是初步探討了AS2O3對(duì)于U2OS系骨肉瘤細(xì)胞的抑制作用，初步證實(shí)了AS2O3對(duì)骨肉瘤細(xì)胞有誘導(dǎo)凋亡的作用，并且存在劑量時(shí)間依賴性，而AS2O3的作用機(jī)制尚需要后期進(jìn)一步的深入研究。

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(2015-02-15收稿2015-04-27修回)

(責(zé)任編輯張楠)

作者簡(jiǎn)介：葉榮，本科學(xué)歷，主治醫(yī)師，E-mail:yerong76@139.com通訊作者：張曉峰，E-mail:zxfzxf1983@aliyun.com