HBV微環(huán)DNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建及初步藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)

饒桂榮，張換敬，黃 彬，陳光明，王洪敏，楊富強(qiáng)

HBV感染慢性化的發(fā)生除HBV本身的生物學(xué)特性外，更重要的是取決于機(jī)體的免疫應(yīng)答狀態(tài)，因此建立一種不僅能預(yù)防HBV感染，更能有效免疫清除肝細(xì)胞內(nèi)病毒的治療性疫苗，是當(dāng)今這一醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)[1-3]。治療性DNA疫苗的作用機(jī)制是通過(guò)產(chǎn)生內(nèi)源性抗原提高機(jī)體特異性細(xì)胞免疫，打破患者免疫耐受狀態(tài)以清除病毒，該種疫苗是穩(wěn)定、安全、有效的理想疫苗之一[4-5]。

基因載體的選擇對(duì)DNA疫苗至關(guān)重要，一方面，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的骨架DNA成分均包括DNA復(fù)制起始位點(diǎn)及抗菌素抵抗基因等，這些成分會(huì)抑制目的基因表達(dá)，并且載體基因DNA可能插入宿主基因組，誘發(fā)插入突變和基因沉默的危險(xiǎn)；另一方面，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低，目的基因只能實(shí)現(xiàn)瞬間表達(dá)，其分子量較大，容易引發(fā)免疫反應(yīng)而被機(jī)體所清除。因此，安全、高效的表達(dá)是研究核酸DNA疫苗基因治療的關(guān)鍵[6]。Chen等[7]和Kay等[8]開(kāi)發(fā)的微環(huán)DNA載體技術(shù)有助于解決以上問(wèn)題。微環(huán)是一種環(huán)狀表達(dá)盒子，不含標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒中細(xì)菌骨架DNA，能在體內(nèi)長(zhǎng)期表達(dá)高水平的目的基因產(chǎn)物。微環(huán)在結(jié)構(gòu)、基因表達(dá)的持久性和細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性等方面與共價(jià)閉環(huán)DNA相同，使微環(huán)成為安全、高效的理想載體之一。微環(huán)DNA的制備方法是將含目的基因的親本質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入宿主菌ZYCY10P3S2T后，以阿拉伯糖誘導(dǎo)重組酶的表達(dá)，重組酶介導(dǎo)其識(shí)別位點(diǎn)發(fā)生重組，使親本質(zhì)粒重組形成含細(xì)菌骨架的質(zhì)粒和含目的基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA[9]。而宿主菌體內(nèi)聯(lián)合表達(dá)I－SceⅠ內(nèi)切酶可將含細(xì)菌骨架的質(zhì)粒酶切為線性DNA，繼而被降解掉，再采用常規(guī)質(zhì)粒提取分離方法即可獲得高純度的微環(huán)DNA。本文構(gòu)建了HBV的微環(huán)DNA質(zhì)粒pMCS2.S和pMCIIF，通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染獲得目的基因的高表達(dá)，并聯(lián)合在體電脈沖（electroporation,EP）技術(shù)注射健康小鼠以檢測(cè)到雙質(zhì)粒疫苗的特異性免疫效果，旨在為慢性HBV感染者DNA疫苗治療研究的進(jìn)一步應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 限制性內(nèi)切酶購(gòu)自美國(guó)NEB公司；pfu聚合酶和T4 DNA連接酶等均購(gòu)自日本Takara公司；COS－7細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑為美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品；“立可讀”乙型肝炎病毒表面抗體診斷試劑盒購(gòu)自上?？迫A生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒中提試劑盒購(gòu)自美國(guó)Qiagen公司；Mouse IFNγELISPOT Kit購(gòu)自BD公司；植物凝血素（PHA）、淋巴細(xì)胞分離液和牛血清蛋白均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2 質(zhì)粒和菌株 重組質(zhì)粒preS2.S/pcDNA3.1和hIL－2－IFN γ/pcDNA3.1 由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保存[10]；ZY781載體[7]和大腸桿菌ZYCY10P3S2T[8]由中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院陳志英教授饋贈(zèng)；大腸桿菌DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 主要試劑配制 培養(yǎng)液：將蛋白胨12 g、酵母提取物24 g和甘油4ml溶解在900ml水中，待各組分溶解后高壓滅菌，冷卻至60℃，再加入100ml經(jīng)高壓滅菌或用0.22μm濾膜過(guò)濾的170mmol/L KH2PO4和 0.72mol/L K2HPO4的混合液即得；Minicle Induction Mix：向 100ml LB（Lysogeny broth）中加入1mol/L的NaOH 4ml和20%的阿拉伯糖200μl，混合后經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾。

1.4 引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增目的片段 基于重組質(zhì)粒preS2.S/pcDNA3.1和hIL－2－IFNγ/pcDNA3.1的序列，在目的基因的增強(qiáng)子上游和polyA下游設(shè)計(jì)引物，用于擴(kuò)增含有目的基因及其上下游的增強(qiáng)子、啟動(dòng)子和polyA調(diào)控序列的DNA片段。設(shè)計(jì)的引物序列 F:5'－GAA GAT CTG GCG GGT TGA GAT TGA TTA TTG AGT AG －3'，R:5'－ACG CGT CGA CCGATAGAGCCCACCGGA T－3'。以質(zhì)粒 preS2.S/pcDNA3.1和 hIL－2－IFNγ/pcDNA3.1為模板，分別進(jìn)行以下 PCR 反應(yīng)：25μl體系中含 10×buffer2.5μl、dNTP（2.5mM）2 μl、上游引物（10pM）0.5 μl、下游引物（10pM）0.5 μl、模板 5 μl、DNA 聚合酶（2.5 U/μl）0.4μl、雙蒸水 14.1μl。PCR 擴(kuò)增程序：95℃ 5min；95 ℃ 50 s，55 ℃ 50 s，72 ℃ 60 s，共 30 個(gè)循環(huán)；72 ℃5min。

1.5 親本質(zhì)粒的構(gòu)建及重組成微環(huán)DNA 回收PCR目的產(chǎn)物后，使用BglⅡ和SalⅠ雙酶切目的片段和ZY781載體。按常規(guī)方法將目的片段分別克隆至載體ZY781的多克隆位點(diǎn)上，即得親本質(zhì)粒preS2.S/ZY781和 hIL－2－IFN γ/ZY781。轉(zhuǎn)化大腸桿菌ZYCY10P3S2T并進(jìn)行液體培養(yǎng)擴(kuò)增。經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序確定插入片段序列正確后，進(jìn)行以下親本質(zhì)粒重組成微環(huán)DNA的操作：按0.25‰的接種量分別將上述菌液接入含50μg/ml卡那霉素的培養(yǎng)液中，37℃，250 r/min過(guò)夜培養(yǎng)。取過(guò)夜培養(yǎng)的菌液Minicle Induction Mix按等體積混合，于32℃250 r/min反應(yīng)5 h，必要時(shí)可延長(zhǎng)反應(yīng)1～3 h。離心收集菌體，用質(zhì)粒提取試劑盒（Takara miniBEST Plasmid Purification kit ver 4.0,Code No.9760）提取質(zhì)粒，即為微環(huán)DNA質(zhì)粒。

1.6 微環(huán)質(zhì)粒體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染 按常規(guī)方法培養(yǎng)COS－7細(xì)胞株，用胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，重懸于含血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，按3×105個(gè)/孔接種于6孔板上，于37℃，5%CO2孵箱培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞融合度達(dá)90%～95%，分別取4μg pMCS2.S質(zhì)粒，參照 Invitrogen公司脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑 LipofectamineTM2000操作說(shuō)明進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，每個(gè)質(zhì)粒做2個(gè)平行孔，同時(shí)設(shè)無(wú)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞組、空載體組為對(duì)照。繼續(xù)培養(yǎng)，并于24、48、72 h時(shí)收集上清，按HBV表面抗原試劑盒和人白細(xì)胞介素（interleukin,IL）－2和干擾素（interferon,IFN）γ檢測(cè)試劑盒定量目的基因的表達(dá)水平。

1.7 EP輔助雙微環(huán)質(zhì)粒免疫健康的BALB/c小鼠 健康的 BALB/c小鼠 50只，18～20 g，4～6周齡，SPF級(jí)，隨機(jī)分組，每組10只。第1組為空載體（10μg/只）組，第 2組為微環(huán)質(zhì)粒 pMCS2.S（10μg/只）組，第 3組為微環(huán)雙質(zhì)粒 pMCS2.S┼pMCIIF（5μg/只┼5μg/只）組，第 4組為微環(huán)雙質(zhì)粒pMCS2.S┼pMCIIF（10μg/只┼10 μg/只）組，同時(shí)設(shè)0.9%氯化鈉溶液對(duì)照組。采用EP技術(shù)在小鼠雙側(cè)脛前肌注射。分別在接種的第2、4周采用眼球后靜脈叢穿刺法采血，以3000 r/min離心10 min分離血清并于－20℃保存，待最后一次性ELISA檢測(cè)HBsAb水平，計(jì)算抗體出現(xiàn)的陽(yáng)性小鼠數(shù)。接種4周后，處死小鼠取脾臟分離淋巴細(xì)胞進(jìn)行酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè)（enzyme－linked immunospotassay,ELISPOT）實(shí)驗(yàn)。ELISPOT檢測(cè)嚴(yán)格按BD公司試劑盒使用說(shuō)明書(shū)方法操作。判斷標(biāo)準(zhǔn)：①同一細(xì)胞密度條件下，ELISPOT檢測(cè)板中同一樣品的HBsAg刺激與非HBsAg刺激的各3個(gè)復(fù)孔斑點(diǎn)形成細(xì)胞（spot forming cell,SFC）均數(shù)的比值應(yīng)不小于2；②制劑免疫組樣品淋巴細(xì)胞密度為3×105/孔檢測(cè)時(shí)，HBsAg刺激與非HBsAg刺激各3個(gè)復(fù)孔SFC均數(shù)的差值不小于5，符合以上其中1項(xiàng)為陽(yáng)性。以此標(biāo)準(zhǔn)作為小鼠特異性細(xì)胞免疫的陽(yáng)性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)組小鼠的細(xì)胞免疫應(yīng)答陽(yáng)性率應(yīng)不低于60%。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間率的比較用Fisher確切概率法，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 親本質(zhì)粒 preS2.S/ZY781和 hIL-2-IFNγ/ZY781的構(gòu)建及重組成微環(huán)DNA 構(gòu)建流程見(jiàn)圖1和圖2，由親本質(zhì)粒preS2.S/ZY781重組成微環(huán)質(zhì)粒pMCS2.S，由親本質(zhì)粒hIL-2-IFNγ/ZY781重組成微環(huán)質(zhì)粒pMCIIF。2種親本質(zhì)粒重組后大小均從約6.0 kbp變成約2.5 kbp，經(jīng)酶切后均出現(xiàn)約2 kbp和4 kbp兩條特異目的條帶，說(shuō)明親本質(zhì)粒酶切鑒定正確，并成功重組生成微環(huán)質(zhì)粒。結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖1 微環(huán)質(zhì)粒DNA構(gòu)建流程Figure 1 Construction process ofm inicircle DNA

圖2 微環(huán)質(zhì)粒的重組生成過(guò)程Figure 2 Generation ofm inicircle DNA

圖3 質(zhì)粒及酶切電泳圖譜1.DL2000；2.Vector ZY 781；3.pMCS2.S；4.preS2.S/ZY781；5.pMCS2.S被BglⅡ和 SalⅠ雙酶切；6.preS2.S/ZY781被 BglⅡ和 SalⅠ雙酶切；7.pMCIIF；8.hIL-2-IFN γ/ZY781；9.pMCIIF 被 BglⅡ和SalⅠ雙酶切；10.hIL-2-IFN γ/ZY781被 BglⅡ和SalⅠ雙酶切Figure 3 Identification of double m inicircle plasm ids digested by the restriction enzymes

2.2 微環(huán)質(zhì)粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果 微環(huán)質(zhì)粒pMCS2.S和pMCIIF轉(zhuǎn)染到COS-7細(xì)胞后，于轉(zhuǎn)染后24、48、72 h分別收集細(xì)胞上清液，如圖4所示，ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染24 h后即有目的基因的表達(dá)；在48 h時(shí)，HBsAg、IL-2和IFNγ表達(dá)水平為最高，分別為 （60.3±7.8）、（17.7±1.9）、（10.3±0.9）ng/ml；72 h時(shí)，這些目的蛋白的表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，且無(wú)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)照組均未檢測(cè)到目的產(chǎn)物。

圖4 微環(huán)質(zhì)粒pMCS2.S和pMCIIF的在COS-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染表達(dá)結(jié)果Figure 4 Protein expression of double m inicircles DNA(pMCS2.S and pMCIIF)transfected into COS-7

2.3 微環(huán)質(zhì)粒對(duì)BALB/c小鼠的初步免疫效果 血清HBsAb≥10m IU被認(rèn)為是機(jī)體保護(hù)性有效濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，0.9%氯化鈉溶液組和空載體組的小鼠血清HBsAb濃度＜10m IU，ELISA結(jié)果為陰性；pMCS2.S和pMCS2.S┼pMCIIF不同劑量組均能在2周即可部分誘導(dǎo)小鼠HBsAb產(chǎn)生，4周后產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫反應(yīng)，pMCS2.S聯(lián)合佐劑pMCIIF效果更顯著，10只小鼠血清HBsAb均陽(yáng)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果見(jiàn)表1，具體含量見(jiàn)表2。4周時(shí)取小鼠脾淋巴細(xì)胞進(jìn)行特異性IFNγELISPOT實(shí)驗(yàn)以檢測(cè)特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答。計(jì)算每組刺激孔和無(wú)刺激孔的斑點(diǎn)數(shù)，當(dāng)無(wú)刺激點(diǎn)數(shù)＞5時(shí)，刺激孔點(diǎn)數(shù)/無(wú)刺激點(diǎn)數(shù)≥2，判定為陽(yáng)性;當(dāng)無(wú)刺激點(diǎn)數(shù)≤5時(shí)，刺激孔點(diǎn)數(shù)－無(wú)刺激點(diǎn)數(shù)≥5，判定為陽(yáng)性。經(jīng)以上計(jì)算，最終得到每組IFNγSFC斑點(diǎn)數(shù)。見(jiàn)圖5。

表1 小鼠免疫后血清HBsAb及ELISPOT檢查結(jié)果（只）Table 1 Positive ratio of HBsAb ELISA and specific IFN γELISPOT after immunization(numbers)

表2 小鼠免疫后血清HBsAb濃度（10 m IU）及特異性IFN γELISPOT實(shí)驗(yàn)結(jié)果（x±s）Table 2 Concentration of HBsAb(10 m IU)and SFC of specific IFN γ ELISPOT after immunization （x±s）

3 討 論

HBV在全球范圍廣泛流行。HBV感染可引起急、慢性和重型肝炎，并與肝硬化、肝癌的發(fā)生密切相關(guān)，是嚴(yán)重危害人類健康的感染性疾病。目前為止，尚無(wú)理想的治療方法。基因疫苗（核酸DNA疫苗）的出現(xiàn)與發(fā)展，為慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB）的防治開(kāi)創(chuàng)了新思路。如乙型肝炎基因疫苗作為特異性細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)的治療手段，首次接種到10例CHB患者，發(fā)現(xiàn)能夠有效誘導(dǎo)CHB患者自身體內(nèi)HBV特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答[11]。韓國(guó)學(xué)者應(yīng)用多表位編碼基因構(gòu)建的DNA疫苗聯(lián)合拉米夫定治療12例CHB患者，療程和隨訪各52周，試驗(yàn)顯示在獲得細(xì)胞免疫應(yīng)答的6例患者中，未發(fā)生病毒學(xué)突破和反彈以及生化學(xué)突破[12]。以上臨床試驗(yàn)研究為乙型肝炎DNA疫苗有效提高患者特異性細(xì)胞免疫功能進(jìn)而清除病毒提供了有力的證據(jù)。

圖5 ELISPOT檢測(cè)的斑點(diǎn)圖（×200）A.PHA；B.Saline；C.Vector；D.pMCS2.S；E.pMCS2.S+pMCIIF（5 μg/只+5μg/只）；F.pMCS2.S+pMCIIF（10μg/只+10μg/只）。其中A、E和F均呈明顯的陽(yáng)性，D呈弱陽(yáng)性，而B(niǎo)和C幾乎無(wú)斑點(diǎn)，呈陰性Figure 5 Illustration of the ELISPOT assay （×200）

基因疫苗治療中，選用高效、安全的載體將目的基因轉(zhuǎn)移至真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)是最為關(guān)鍵的一步。目前用于基因治療的載體大多為非病毒載體（裸DNA質(zhì)粒載體），但這種質(zhì)粒載體的細(xì)胞轉(zhuǎn)染率低，結(jié)構(gòu)中含有細(xì)菌復(fù)制序列、抗性基因、未甲基化的CpG基序和一些可能隱藏的表達(dá)信號(hào)，在基因治療中可能引起嚴(yán)重的生物安全性問(wèn)題[6]。微環(huán)質(zhì)粒載體的出現(xiàn)，較好地解決了這個(gè)問(wèn)題。微環(huán)DNA是去除細(xì)菌序列和僅編碼治療基因的小超螺旋質(zhì)粒，較常規(guī)質(zhì)粒載體如pcDNA3系列、pVAX1、pCI等缺少細(xì)菌骨架序列，從而降低DNA疫苗的不良反應(yīng)，并且在基因表達(dá)的持久性和細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性等方面與共價(jià)閉環(huán)DNA相同，在DNA疫苗的構(gòu)建上具有很大優(yōu)勢(shì)[7]。Darquet等[13]和 Chen 等[7]在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中證明了微環(huán)DNA比親本質(zhì)?；蚱渌麛y帶相同基因的傳統(tǒng)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平都高3～10倍，大量體內(nèi)、外試驗(yàn)證明，微環(huán)DNA具有表達(dá)時(shí)間長(zhǎng)、表達(dá)效率高等特點(diǎn)。微環(huán)DNA的出現(xiàn)，為臨床研究提供了一個(gè)安全、高效的基因治療載體。

本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建了一種抗HBV治療性雙質(zhì)粒DNA疫苗[10]，已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)中，其結(jié)果令人鼓舞[4，14]。因此，本文在前期的基因治療研究基礎(chǔ)上，采用微環(huán)載體構(gòu)建雙質(zhì)粒DNA疫苗pMCS2.S和pMCIIF，經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定，微環(huán)雙質(zhì)粒疫苗的構(gòu)建完全正確，并轉(zhuǎn)染細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)目的基因的表達(dá)水平，結(jié)果表明目的基因的表達(dá)時(shí)間與原有載體preS2.S/pcDNA3.1和 hIL－2－IFN γ/pcDNA3.1的一致[15]，但表達(dá)水平大大提高。微環(huán)質(zhì)粒聯(lián)合EP技術(shù)進(jìn)行BALB/c小鼠免疫注射，結(jié)果顯示，微環(huán)DNA粒pMCS2.S在健康小鼠體內(nèi)能產(chǎn)生一定的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，佐劑微環(huán)質(zhì)粒pMCIIF可顯著增強(qiáng)pMCS2.S的免疫效果；低劑量即可誘導(dǎo)較強(qiáng)的免疫應(yīng)答，而大劑量的免疫效果相當(dāng)，但與空載體組或鹽水組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，微環(huán)載體構(gòu)建的雙質(zhì)粒DNA疫苗在小鼠體內(nèi)可誘導(dǎo)較強(qiáng)的免疫應(yīng)答，為后續(xù)進(jìn)一步藥物開(kāi)發(fā)提供有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為該微環(huán)DNA質(zhì)粒的規(guī)?；a(chǎn)制備提供可能，后續(xù)實(shí)驗(yàn)正在進(jìn)行中，結(jié)果待發(fā)表。

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