徐吟亞

(武漢市華潤武鋼總醫(yī)院檢驗(yàn)科 430081)

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·臨床研究·

核抗體熒光免疫檢測質(zhì)量控制方法的建立和應(yīng)用研究

徐吟亞

(武漢市華潤武鋼總醫(yī)院檢驗(yàn)科 430081)

目的 研究核抗體熒光免疫檢測質(zhì)量控制的方法及臨床應(yīng)用。方法 質(zhì)控品標(biāo)準(zhǔn)的確定，同批號質(zhì)控品在常規(guī)抗核抗體檢測時，與待檢患者的血清標(biāo)本分別平行檢測9次，計(jì)算出各質(zhì)控品的熒光強(qiáng)度值和變異系數(shù)，根據(jù)結(jié)果作為質(zhì)控品標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析。質(zhì)控分析標(biāo)準(zhǔn)的確定，在3種不同熒光強(qiáng)度下，模擬實(shí)驗(yàn)室條件調(diào)整熒光圖像的采集時間，分別測定A組300份待檢測血清的熒光強(qiáng)度結(jié)果進(jìn)行比較。針對檢測方法在實(shí)施質(zhì)量分析過程中，主要是通過血清稀釋法以及熒光強(qiáng)度法完成B組(300份)抗核抗體陽性血清標(biāo)本的具體檢測。其中熒光強(qiáng)度分析法主要指的是對熒光強(qiáng)度進(jìn)行有效控制，使其有效確保在患者血清平行檢測質(zhì)控品需要控制的熒光強(qiáng)度的具體范圍之內(nèi)，檢測血清標(biāo)本中抗核抗體的滴度。血清稀釋法，抗核抗體陽性的血清標(biāo)本按照100、1 000、10 000稀釋判斷熒光可見的最高稀釋滴度。結(jié)果 質(zhì)控品標(biāo)準(zhǔn)：同一批號的質(zhì)控品各9次檢測熒光強(qiáng)度的平均值為106.7±10.2，變異系數(shù)的平均值為4.5%。在質(zhì)控有效控制的范圍之內(nèi)，常規(guī)組、強(qiáng)光組以及弱光組三種情況下測定的熒光強(qiáng)度值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。同時采用熒光檢測法和血清稀釋法檢測B組的300份血清標(biāo)本，其中熒光強(qiáng)度分析法用質(zhì)控品標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)的熒光強(qiáng)度106.7±10.2，兩種方法測定抗核抗體的滴度符合率較高，均在99%以上。結(jié)論 熒光強(qiáng)度分析法在對血清標(biāo)本進(jìn)行檢測的過程中表現(xiàn)了非常高的重復(fù)性，并且最終的結(jié)果也能有效完成測定。

抗核抗體； 熒光強(qiáng)度分析法； 質(zhì)量控制

自身免疫性疾病(AID)是機(jī)體對自身抗原發(fā)生的一系列免疫反應(yīng)的疾病[1]。抗核抗體在自身免疫性疾病的患者血清中可檢出，檢測血清中抗核抗體的水平是診斷自身免疫性疾病的重要手段，同時也可反映在治療過程中療效情況，也是自身免疫性疾病患者預(yù)后評估的重要指標(biāo)[2]。熒光免疫檢測法(IIF)是檢測抗核抗體最早應(yīng)用于臨床的方法，通常實(shí)驗(yàn)室都會采用熒光免疫檢測法作為篩查試驗(yàn)。但是當(dāng)前仍然沒有有效的質(zhì)量控制體系，在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室的相關(guān)操作方面，都表現(xiàn)了顯著的差異。本次研究主要采用熒光強(qiáng)度分析法針對熒光強(qiáng)度實(shí)施數(shù)字化處理，分析在進(jìn)行熒光免疫檢測質(zhì)量控制的過程中，熒光強(qiáng)度對其產(chǎn)生的影響，以獲得最有效的質(zhì)量控制方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本次研究對象為收集2013年1～12月來本院就診的抗核抗體陽性的患者血清標(biāo)本600份，入選標(biāo)本均為熒光核型且為均質(zhì)型、斑點(diǎn)型和均質(zhì)型斑點(diǎn)混合型，每型標(biāo)本200份；600份標(biāo)本分為A組、B組兩組，每組標(biāo)本300份。采用不加附加劑的真空采血管抽取患者靜脈血，低速離心機(jī)離心15 min，提取50 μL加入卵育緩沖液，所有標(biāo)本在-20 ℃環(huán)境中冷凍保存。

1.2 儀器與試劑 儀器為熒光顯微鏡由日本NIKON提供，連接熒光顯微鏡的電腦需安裝數(shù)碼成像系統(tǒng)和專用圖像分析軟件，數(shù)碼成像系統(tǒng)由美國SPOT32提供。研究試劑為抗核抗體檢測試劑盒為ANA檢測試劑盒，批號為T30222D，并采用同批號的ANA質(zhì)控品，抗核抗體質(zhì)控品。整個儀器和試劑操作均嚴(yán)格按照儀器和試劑說明書的要求進(jìn)行。

1.3 研究方法 質(zhì)控品標(biāo)準(zhǔn)的確定，同批號質(zhì)控品在常規(guī)抗核抗體檢測時，與待檢患者的血清標(biāo)本分別平行檢測9次，計(jì)算出各質(zhì)控品的熒光強(qiáng)度值和變異系數(shù)，根據(jù)結(jié)果作為質(zhì)控品熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析。質(zhì)控分析標(biāo)準(zhǔn)的確定，在3種不同熒光強(qiáng)度下，模擬實(shí)驗(yàn)室條件調(diào)整熒光圖像的采集時間，分別測定A組300份待檢測血清的熒光強(qiáng)度結(jié)果進(jìn)行比較。常規(guī)組：激發(fā)濾光片ND4和ND16，曝光時間4 s。強(qiáng)光組：激發(fā)濾光片ND16，曝光時間1.5 s。弱光組：激發(fā)濾光片ND4、ND8、ND16，曝光時間6 s。檢測方法的質(zhì)量分析，采用血清稀釋法和熒光強(qiáng)度分析法對B組(300份)抗核抗體陽性血清標(biāo)本完成相關(guān)的檢測。熒光強(qiáng)度分析法，熒光強(qiáng)度控制在與待檢血清平行檢測的質(zhì)控品的熒光強(qiáng)度范圍內(nèi)，檢測血清標(biāo)本中抗核抗體的滴度。在質(zhì)控的環(huán)境下，對比在三種情況下完成測定后熒光強(qiáng)度值的情況，主要分為常規(guī)組、強(qiáng)光組以及弱光組，對三組的熒光強(qiáng)度進(jìn)行系統(tǒng)分析。血清稀釋法，抗核抗體陽性的血清標(biāo)本按照100、1 000、10 000稀釋判斷熒光可見的最高稀釋滴度。并比較熒光檢測法和血清稀釋法檢測抗核抗體的滴度符合率。

2 結(jié) 果

2.1 質(zhì)控品標(biāo)準(zhǔn) 同一批號的質(zhì)控品各9次檢測熒光強(qiáng)度的平均值為106.7±10.2，變異系數(shù)的平均值為4.5%。

表1 各組熒光強(qiáng)度結(jié)果比較±s)

2.2 熒光強(qiáng)度結(jié)果的比較 同時采用熒光檢測法和血清稀釋法對B組的血清標(biāo)本進(jìn)行相關(guān)檢測，在實(shí)施熒光強(qiáng)度分析的過程中，主要利用質(zhì)控品熒光強(qiáng)度值106.7±10.2范圍內(nèi)的熒光強(qiáng)度，A、B兩組在常規(guī)、強(qiáng)光、弱光情況下測定的熒光強(qiáng)度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

2.3 熒光檢測法和血清稀釋法檢測抗核抗體的滴度符合情況 見表2，結(jié)果顯示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 熒光檢測法和血清稀釋法檢測抗核抗體的滴度符合率

3 討 論

自身免疫性疾病臨床癥狀多種多樣，且癥狀表現(xiàn)復(fù)雜，主要為感染性疾病和系統(tǒng)性疾病的相似性，該種疾病在診斷和鑒別上存在許多難點(diǎn)[3]?？购丝贵w在血清中的滴度成為診斷自身免疫性疾病的金標(biāo)準(zhǔn)，能否精準(zhǔn)地檢測抗核抗體滴度是檢驗(yàn)學(xué)專家面臨的重大問題。

抗核抗體是可識別的細(xì)胞核組分，其在某些特定疾病中具有特征性?？购丝贵w過去被認(rèn)為是抗細(xì)胞核抗原成分的自身抗體。有報(bào)道顯示，抗核抗體通常可以分為下列幾種類型(按細(xì)胞內(nèi))：抗DNA抗體，具體包括抗單鏈以及抗雙鏈DNA抗體；抗組蛋白抗體以及抗非組蛋白抗體，主要包括抗著絲點(diǎn)抗體、抗ENA抗體以及抗核仁抗體；其余細(xì)胞成分的抗體[4]?？购丝贵w血清陽性與多種自身免疫性疾病具有相關(guān)性[5-6]。

檢測抗核抗體的方法較多，目前實(shí)驗(yàn)室多采用的檢驗(yàn)?zāi)Ｊ綖橄韧ㄟ^熒光免疫法進(jìn)行篩選實(shí)驗(yàn)，再通過酶聯(lián)免疫法和免疫印跡法完成二次的實(shí)驗(yàn)確認(rèn)[7]。熒光免疫檢測法在檢測抗核抗體中的應(yīng)用是最早的也是臨床應(yīng)用最廣泛的，但是由于每個實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的熒光顯微鏡、操作人員技術(shù)、結(jié)果判定等存在很多差異，會給熒光檢測抗核抗體滴度的準(zhǔn)確性帶來許多困難，現(xiàn)急需解決的是建立和完善熒光檢測抗核抗體滴度的質(zhì)量控制體系，保證熒光免疫檢測法檢測抗核抗體在血清中滴度的結(jié)果準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。有國外學(xué)者曾經(jīng)報(bào)道，可通過建立熒光強(qiáng)度分析針對熒光圖像完成具體的定量分析，最終能夠有效確定抗核抗體的滴度，在完成數(shù)字化處理的過程中站在熒光強(qiáng)度的角度，可以有效將質(zhì)量控制系統(tǒng)具有的準(zhǔn)確性以及重復(fù)性排除[8]。實(shí)驗(yàn)室間結(jié)果可比性的基礎(chǔ)被判定為質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，完成實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)的建立后，有效完成實(shí)驗(yàn)室間熒光免疫法的質(zhì)量控制體系的建立，能夠有效避免實(shí)驗(yàn)室中產(chǎn)生諸多的誤差，將實(shí)驗(yàn)室間結(jié)果表現(xiàn)的差異有效縮小，最終成功將抗核抗體血清滴度檢測結(jié)果表現(xiàn)出的準(zhǔn)確性以及重復(fù)性提高[9-10]，從而有效將實(shí)驗(yàn)室之間具有的可比性增強(qiáng)，臨床意義極其廣泛。

本次研究通過質(zhì)控品熒光強(qiáng)度值標(biāo)準(zhǔn)確定，同批號質(zhì)控品在實(shí)施常規(guī)抗核抗體檢測的過程中，同將要實(shí)施檢測患者的血清標(biāo)本完成檢測9次(平行檢測)，最終準(zhǔn)確計(jì)算出各質(zhì)控品次檢測熒光強(qiáng)度的平均值為106.7±10.2，變異系數(shù)的平均值為4.5%，根據(jù)結(jié)果作為質(zhì)控品標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析。結(jié)果證實(shí)熒光強(qiáng)度分析法在對血清標(biāo)本進(jìn)行檢測的過程中，表現(xiàn)了較高的重復(fù)性，并且最終獲得的結(jié)果表現(xiàn)了準(zhǔn)確穩(wěn)定的特點(diǎn)，利用質(zhì)控品對熒光強(qiáng)度值進(jìn)行控制的做法可在實(shí)驗(yàn)室間質(zhì)量控制中大范圍推廣。使用不同的熒光顯微鏡造成了實(shí)驗(yàn)室間熒光免疫檢測法結(jié)果的差異性，本次研究設(shè)計(jì)了不同熒光顯微鏡的條件，并且采用抗核抗體陽性的血清標(biāo)本采用血清稀釋法進(jìn)行對比檢測。本次研究結(jié)果證明，雖然實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的熒光顯微鏡在型號配置上存在差異，或者在同一實(shí)驗(yàn)室內(nèi)熒光顯微鏡的使用壽命、激發(fā)光強(qiáng)弱存在差異。但檢驗(yàn)人員可根據(jù)質(zhì)控品的熒光強(qiáng)度調(diào)節(jié)具體的曝光時間，在質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的調(diào)整下熒光免疫法測定血清中抗核抗體滴度在不同實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果應(yīng)該是相同的。為了進(jìn)一步驗(yàn)證質(zhì)量控制方法的可行性，本次研究采用熒光分析法和血清稀釋法分別檢測抗核抗體血清滴度，結(jié)果顯示同時采用熒光檢測法和血清稀釋法對B組血清標(biāo)本(300份)進(jìn)行檢測，其中熒光強(qiáng)度分析法用質(zhì)控品熒光強(qiáng)度值106.7±10.2范圍內(nèi)的熒光強(qiáng)度，兩種方法測定抗核抗體的滴度符合率較高，均在99%以上。大量的標(biāo)本檢測證實(shí)采用質(zhì)控品可以得到客觀準(zhǔn)確的結(jié)果。避免了重復(fù)檢查導(dǎo)致過多的浪費(fèi)資源，與此同時還能夠有效將檢查的經(jīng)濟(jì)費(fèi)用降低，站在衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)學(xué)角度來看，表現(xiàn)了重要的意義。

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10.3969/j.issn.1672-9455.2015.02.048

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