黃 震，遲秀文，蒲 榮，束振華，孫俊生，王 前

(1.廣東省深圳市龍崗中心醫(yī)院 518116；2.廣東醫(yī)學(xué)院護(hù)理學(xué)院,廣東東莞 523808；3.廣東省東莞市第三人民醫(yī)院 523326；4.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院,廣州 510515)

?

·論 著·

幽門螺桿菌ssDNA適配子的篩選及其應(yīng)用

黃 震1，遲秀文2，蒲 榮3，束振華1，孫俊生1，王 前4△

(1.廣東省深圳市龍崗中心醫(yī)院 518116；2.廣東醫(yī)學(xué)院護(hù)理學(xué)院,廣東東莞 523808；3.廣東省東莞市第三人民醫(yī)院 523326；4.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院,廣州 510515)

目的 通過富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(SELEX)篩選出與幽門螺桿菌(HP)菌體具有高親和性適配子，并且利用其檢測組織和活體內(nèi)HP的感染。方法 培養(yǎng)HP細(xì)菌，利用SELEX篩選獲得HP菌體的適配子。在HP感染患者活檢組織驗(yàn)證其結(jié)合。結(jié)果 從第6輪篩選所得ssDNA中篩選出一條高結(jié)合力的適配子命名為HP1，將適配子HP1區(qū)別于其他篩選出的適配子，并檢測其與幽門螺旋桿菌的親和力。結(jié)論 初步獲得了針對HP菌體篩選出高親和性適配子，為開發(fā)HP診斷試劑奠定了基礎(chǔ)。

幽門螺桿菌； 配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)； 適配子； 診斷

目前幽門螺桿菌(HP)全球范圍內(nèi)感染率高達(dá)50%以上，而在我國平均感染率約為59%,且存在著地域差異[1-2]。因此，對其早期快速診斷是治療的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的方法主要分為侵入型和非侵入型診斷。鑒于傳統(tǒng)檢測方法靈敏度、特異度不高、誤診率高等缺點(diǎn)，亟待開發(fā)一種能夠快速、簡便、特異性較高的診斷方法，從而對HP感染進(jìn)行診斷。本試驗(yàn)選用SELEX是一種成熟的應(yīng)用到各種靶標(biāo)篩選的技術(shù)，包括金屬離子、藥物、氨基酸、細(xì)胞因子、抗菌藥物、全菌體、多肽等，其中蛋白質(zhì)類靶分子最多[3]。有學(xué)者曾報(bào)道，以結(jié)核分枝桿菌H37Rv的菌體為靶標(biāo)，篩選獲得能夠與之特異性結(jié)合的ssDNA，該適配子能夠用于診斷并阻斷H37Rv感染[4]。此外經(jīng)SELEX篩選獲得的特異性結(jié)合靶分子的適配子與傳統(tǒng)意義上抗體相比，具有相對分子質(zhì)量小，無抗原性，能夠穩(wěn)定合成，同時(shí)便于熒光、生物素等多種修飾等特點(diǎn)，是極具應(yīng)用前景的新型生物制劑[5]。

1 材料與方法

1.1 材料來源

1.1.1 菌株 HP標(biāo)準(zhǔn)菌株NCTC11637由中國疾病控制中心傳染病預(yù)防控制所提供。

1.1.2 試劑及儀器 引物由上海生物有限公司合成：用于克隆構(gòu)建的主要試劑BamHI、EcoRI、T4 DNA連接酶等分子生物學(xué)試劑購自Fermentas公司；核酸蛋白檢測儀(德國Eppendorf公司)；紫外透射儀(Bioimaging System 美國UVP公司)；pUC19質(zhì)粒、DH5a菌由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 隨機(jī)單鏈 DNA(ssDNA)文庫的構(gòu)建和引物合成 隨機(jī)(ssDNA 文庫的構(gòu)建和引物合成構(gòu)建了長度為 78 nt的 ssDNA 文庫,兩端為固定序列,中間40個(gè)核苷酸為隨機(jī)序列,庫容量約為 1014～1015。兩個(gè)引物中分別含有 EcoR Ⅰ和 BamH Ⅰ的酶切位點(diǎn),隨機(jī)ssDNA 5-GCG GAA TTC AAC AGT CCG AGC C-N40-GGG TCA ATG CGT CAT A-3。引物 1:′5-GCG GAA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ACA GTC CGA GCC-3′ (劃線部分為EcoR Ⅰ酶切位點(diǎn));引物 2:′5-GCG GGA TCC TAT GAC GCA TTG ACC C-3′ (劃線部分為BamH Ⅰ酶切位點(diǎn))。隨機(jī) ssDNA文庫和引物由上海生物有限公司合成。

1.1.4 標(biāo)本來源 由深圳市龍崗中心醫(yī)院消化科內(nèi)窺鏡室提供。其中HP診斷標(biāo)準(zhǔn)為：(1)患者有典型的臨床癥狀；(2)H-E染色檢出彎曲螺旋狀桿菌；(3)HP培養(yǎng)陽性；(4)快速尿素酶法檢測陽性。其中任意兩項(xiàng)為陽性均判為陽性。

1.2 方法

1.2.1 HP的培養(yǎng) 布氏培養(yǎng)基加入去離子水800 mL，NaOH 調(diào)節(jié)pH值至7.7后補(bǔ)充去離子水至1 L，121 ℃高壓滅菌20 min。使用時(shí)按照體積比5∶1加入胎牛血清和終濃度為20%的葡萄糖。在密閉的生化培養(yǎng)箱中38 ℃培養(yǎng)，氧氣∶氮?dú)狻枚趸?5∶85∶10。

1.2.2 ssDNA文庫及雙鏈 DNA (dsDNA)的擴(kuò)增 將合成的ssDNA文庫擴(kuò)增為dsDNA文庫：10×Taq DNA 聚合酶buffer、單鏈寡核苷酸文庫(0.165 μg/μL)、引物Primer1(25 μmol/L)、引物Primer2(25 μmol/L)、dNTP mix(2.5 mmol/L)、Taq 酶、ddH2O 95 ℃預(yù)變性5 min,再進(jìn)行95 ℃ 36 s,60 ℃ 36 s，72 ℃ 84 s，共15個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min，行3%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。并以擴(kuò)增所得 dsDNA文庫為模板，下游引物P2不對稱擴(kuò)增出下一輪篩選的 ssDNA 文庫。反應(yīng)條件同上，向PCR 產(chǎn)物中加入1/10體積預(yù)冷的3 mol/L的NaAc，混勻后，再向體系中加入2倍體積的冰預(yù)冷的無水乙醇，充分混勻后，置于-80 ℃沉淀4 h。

1.2.3 SELEX 篩選 取106cfu HP，加入潔凈的EP管中再加入200 μL篩選緩沖液(20 mmol/L HEPES，pH=7.4),37 ℃孵育2 h。5 000 g離心5 min棄去上清液，篩選緩沖液洗滌5次后加入200 L滅菌雙蒸水，于95 ℃加熱10 min；吸取孔中加熱后的雙蒸水做常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。為了提高篩選適配子的親和力，采用梯度篩選的方式進(jìn)行，即前3輪投入106cfu HP，第4～6輪投入104cfu HP；為了提高篩選的特異性，從第2輪篩選開始通過胃黏膜細(xì)胞和其他細(xì)菌(大腸桿菌、鏈球菌、腸球菌、乳酸桿菌)進(jìn)行反向篩選，將第6輪dsDNA庫，割膠回收。將dsDNA和空載pUC19用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ進(jìn)行雙酶切，用割膠回收DNA片段的方法，純化回收酶切產(chǎn)物，測定濃度后，進(jìn)行連接反應(yīng)置于16 ℃，作用16 h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5中，挑取單克隆，提取質(zhì)粒并進(jìn)行酶切鑒定。

1.2.4 相對親合力的檢測 (1)不同適配子庫與HP的親和力測定:以每輪的dsDNA庫為模板，加入以生物素標(biāo)記的P1引物擴(kuò)增出生物素標(biāo)記的ssDNA適配子庫，用篩選緩沖液分散HP 106cfu/mL，37 ℃孵育2 h，按每管20 pmoL。每輪適配子庫做3個(gè)復(fù)孔。篩選緩沖液洗滌ssDNA-HP 3次，每次5 min，加入HRP標(biāo)記的鏈酶親和素(1∶2 000稀釋)，每孔100 μL，37 ℃作用45 min，PBST洗滌微孔板3次，每次5 min。加入TMB底物，37 ℃下作用1～3 min,觀察顏色變化，然后用2 mol/L濃硫酸終止。用酶標(biāo)儀讀出450 nm波長時(shí)的吸光度值。(2) 單克隆適配子庫與HP的親和力測定:以測序鑒定正確的質(zhì)粒為模板，以生物素標(biāo)記的P1引物擴(kuò)增出生物素標(biāo)記的單個(gè)適配子，方法同(1)，不同適配子庫與HP的親和力測定。

1.2.5 對臨床標(biāo)本的檢測 (1)適配子HP1檢測活檢組織中的HP：收集活檢組織經(jīng)臨床現(xiàn)有方法診斷為HP感染。共計(jì)選擇確診陽性患者27例，反復(fù)多次抗菌藥物治療患者18例，男16例，女11例，年齡26～67歲，每例標(biāo)本分成兩份，一份進(jìn)行臨床檢測，一份進(jìn)行適配子免疫組織化學(xué)檢測。將活檢組織標(biāo)本涂布于潔凈的載玻片，固定后，使用FITC標(biāo)記的適配子HP1與之孵育，37 ℃ 2 h，PBS洗滌除去未結(jié)合的FITC標(biāo)記的適配子3次，每次5 min，在熒光顯微鏡下觀察視野。

2 結(jié) 果

2.1 DNA文庫及篩選產(chǎn)物的 PCR 擴(kuò)增 化學(xué)合成的起始ssDNA 隨機(jī)文庫,經(jīng)Klenow片段擴(kuò)增為dsDNA文庫,然后經(jīng)不對稱PCR擴(kuò)增得到的ssDNA 隨機(jī)文庫，結(jié)果顯示 dsDNA 庫片段大小在 DNA marker分子100 bp附近,與預(yù)期片段大小 (78 bp)相符。通過SELEX篩選技術(shù)篩選獲得特異性結(jié)合HP的6輪ssDNA適配子庫，將各輪單鏈適配子庫行3%的DNA瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果顯示，隨著篩選輪數(shù)的增高，其條帶逐漸集中，說明其起始ssDNA文庫中的復(fù)雜多樣的二級結(jié)構(gòu)，經(jīng)SELEX篩選后，特異性結(jié)合HP靶標(biāo)的ssDNA二級結(jié)構(gòu)趨于一致的適配子被保留。

2.2 不同輪數(shù)適配子庫及不同克隆單適配子相對親合力的檢測 將起始文庫和篩選的6輪適配子與HP的親和力進(jìn)行比較，結(jié)果顯示第六輪具有最高親和力(圖1A)，考慮到適配子文庫的豐富性隨將第6輪文庫擴(kuò)增的dsDNA文庫克隆至pUC19質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入DH5α后在經(jīng)過氨芐青霉素抗性篩選后，挑取單克隆菌落，提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定和測序鑒定正確的16個(gè)不同序列的單克隆適配子與HP的親和力比較，結(jié)果顯示7號適配子具有最高親和力，將結(jié)合力最高的7號適配子命名為HP1(圖1B)。

注：A為不同輪數(shù)的適配子文庫的親和力的比較；B為不同單克隆適配子的親和力的比較。

圖1 不同輪數(shù)適配子文庫親和力及不同單克隆適配子親和力的比較

2.3 對臨床標(biāo)本的檢測 FITC標(biāo)記的適配子HP1與活檢組織中HP特異性結(jié)合，在患者活檢組織中能夠清晰可見短桿狀的黃綠色熒光，而在正常組織對照組無熒光。經(jīng)過對27例患者的活檢組織的檢出陽性率與HE染色、培養(yǎng)、尿素酶法的比較，結(jié)果顯示，適配子法有較高的特異性(表1)。

表1 3種方法對HP感染患者的診斷

3 討 論

HP是一種消化道致病菌，其與胃部疾病密切相關(guān)。而目前臨床診斷技術(shù)存在各種不足[6]。因此，本課題采用SELEX技術(shù)篩選與HP具有高親和力、高特異性結(jié)合的ssDNA適配子。核酸適配子是一類新型的識別分子。與單克隆抗體相比，其相對分子質(zhì)量較低，沒有免疫源性，可通過化學(xué)合成制備及結(jié)構(gòu)改造以及熒光、生物素等多種功能標(biāo)記，化學(xué)穩(wěn)定性好，能可逆的變性與復(fù)性，可在常溫下保存和運(yùn)輸，這些優(yōu)點(diǎn)使適配子在臨床診斷及治療中具有良好的應(yīng)用前景[7]。

本研究采用SELEX技術(shù)經(jīng)過6輪篩選后，利用ELONA方法比較了各輪適配子庫與HP的結(jié)合能力，并從親和力最高的第6輪適配子擴(kuò)增為雙鏈庫并構(gòu)建到pUC19的載體質(zhì)粒中篩選出適配子HP1，將其應(yīng)用于患者活檢組織的HP檢測中，結(jié)果顯示適配子HP1能夠在復(fù)雜的組織標(biāo)本中特異性的識別結(jié)合HP，從而為臨床診斷提供依據(jù)。而本次研究仍是基于活檢組織開展，雖然適配子HP1表現(xiàn)出較高的靈敏度和特異度，但是仍有悖于本研究的初衷，即口服修飾的熒光標(biāo)記的核酸適配子與HP在體內(nèi)結(jié)合后，提供體外紅外熒光檢測其是否有HP感染，以及根據(jù)熒光強(qiáng)度評判感染的嚴(yán)重程度從而預(yù)測HP導(dǎo)致胃部疾病的風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，也有研究表明適配子與靶標(biāo)菌體的結(jié)合能夠阻斷細(xì)菌對宿主細(xì)胞的感染。因此，本研究篩選出的適配子HP1對HP侵襲胃黏膜細(xì)胞是否發(fā)揮作用，也值得進(jìn)一步探討。

綜上所述，運(yùn)用SELEX技術(shù)成功地篩選到高親和力及高特異性結(jié)合HP的ssDNA適配子，為HP感染所致疾病的鑒別診斷開辟了一條新的途徑，具有良好的應(yīng)用前景。

[1]Pan Q,Wang Q,Sun X,et al.Aptamer against mannose-capped lipoarabinomannan inhibits virulent Mycobacterium tuberculosis infection in mice and rhesus monkeys[J].Mol Ther，2014,22(5):940-951.

[2]Lee YY,Mahendra RS,Graham DY.Helicobacter pylori infection——a boon or a bane:lessons from studies in a low-prevalence population[J].Helicobacter,2013,18(5):338-346.

[3]Ellington AD,Szostak JW.In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands[J].Nature,1990,346(6287):818-822.

[4]Chen F,Zhou J,Lou F,et al.Aptamer from whole-bacterium SELEX as new therapeutic reagent against virulent Mycobacterium tuberculosis[J].Biochem Biophys Res Commun，2007,357(3):743-748.

[5]Stoltenburg R,Reinemann C,Strehlitz B.SELEX——a (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands[J].Biomol Eng,2007,24(4):381-403.

[6]Kim D,Jeong YY,Jon S.A drug-loaded aptamer-gold nanoparticle bioconjugate for combined CT imaging and therapy of prostate cancer[J].ACS Nano,2010,4(7):3689-3896.

[7]Miyakawa S,Fujiwara M,Nakamura Y.Aptamer therapeutics[J].Tanpakushitsu Kakusan Koso,2006,51(16):2521-2527.

Screening and application of ssDNA aptamers of Helicobacter pylori*

HUANGZhen1,CHIXiu-wen2,PURong3,SHUZhen-hua1,SUNJun-sheng1,WANGQian4△

(1.LongangCentralHospital,Shenzhen,Guangdong518116,China;2.NursingCollege,GuangdongMedicalCollege,Dongguan,Guangdong523808,China;3.DongguanMunicipalThirdPeople′sHospital,Dongguan,Guangdong523326,China;4.NanfangHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510515,China)

Objective To screen the high-affinity aptamers of Helicobacter pylori (HP) by systematic evolution of ligands by exponential enrichment(SELEX) and to apply this technique to detect HP infection in tissue and in vivo.Methods HP was cultured.SELEX was applied to conduct screening for obtaining theaptamers of HP.The aptamers were used to detect the HP infection in biopsies.Results The high affinity aptamer was screened from the 6th rounds selection,named HP1.The aptamer HP1 was used to distinguish the HP from non-HP and its binding force with HP was detected.Conclusion The high-affinity aptamers binding to HP is successfully selected from the initial ssDNA library,which lays a foundation for the development of HP infection diagnostic reagents.

helicobacter pylori; SELEX; aptamer; diagnosis

廣東省深圳市科技計(jì)劃非資助項(xiàng)目(201203315)。

黃震，男，在職博士，副主任檢驗(yàn)師,主要從事臨床免疫檢驗(yàn)研究?！?/p>

,E-mail:nfyywangqian@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.14.012

A

1672-9455(2015)14-2006-03

2015-02-20

2015-03-20)