賴丹黃非覃綱

·實驗研究·

維生素C與過氧化氫對老年豚鼠耳蝸外毛細胞大電導(dǎo)鈣激活鉀通道電流的影響△

賴丹1黃非2覃綱1

目的 研究過氧化氫（H2O2）及維生素C對老年豚鼠耳蝸外毛細胞大電導(dǎo)鈣激活鉀通道（large conductance Ca2+-activated potassium channels，BKCa channels）電流的影響及其機制。方法 采用急性酶分離方法分離25只老年豚鼠耳蝸外毛細胞，以膜片鉗全細胞記錄方式觀察BKCa通道電流（5只豚鼠）；記錄到穩(wěn)定、正常的BKCa通道電流后，向新鮮分離貼壁外毛細胞的2 ml浴槽的浴液中加入H2O2稀釋液40μl，使浴液中H2O2濃度為4μmol／L，觀察H2O2對BKCa通道電流的影響（5只豚鼠）；再分組加入維生素C溶液10、20、40μl（各組5只豚鼠），使浴液中維生素C終濃度分別為25、50、100μg／ml，觀察H2O2和維生素C聯(lián)合作用對BKCa通道電流的影響。結(jié)果 ①膜片鉗全細胞記錄模式下，記錄到一串幅值較大、快速激活、幾乎不失活的電流，激活電壓大于-40～-30 m V，電流隨膜電位的增加而增強，并表現(xiàn)出外向整流的特性；加入BKCa通道特異性阻斷劑伊比利亞毒素（iberiotoxin，Ib TX）100 nmol／L后，通道活動完全阻斷，證實為BKCa通道電流。②加入H2O2后，用藥3分鐘內(nèi)，當(dāng)VT為+50 m V時，BKCa通道峰值電流密度最大值從22.09±0.27 p A／p F升至43.53±1.09 p A／p F，增幅97.06%。H2O24μmol／L+25、50、100μg／ml維生素C時，BKCa通道電流表現(xiàn)濃度依賴性抑制，電流幅值和峰值電流密度隨著維生素C濃度增加而減小，I-V曲線下降，洗脫后仍不能恢復(fù)至加藥前正常水平。結(jié)論 老年豚鼠耳蝸外毛細胞存在氧自由基／BKCa途徑，而維生素C可減輕氧自由基對外毛細胞BKCa通道的影響。

大電導(dǎo)鈣激活鉀通道； 外毛細胞； 氧自由基； 維生素C； 過氧化氫

1991年，Atkinson等［1］首次由果蠅中克隆出大電導(dǎo)鈣激活鉀通道（large conductance Ca2+-activated potassium channels，BKCa channels）。Ca2+與Ca2+結(jié)合區(qū)結(jié)合或電壓作用于通道的電壓感受器都可引起B(yǎng)KCa通道的激活，因此BKCa通道被胞內(nèi)Ca2+激活，也被膜電位去極化激活。BKCa通道的特點為：在膜電位-40～-60 m V時激活，激活速度快（0.2～0.4 ms）；單通道電導(dǎo)大（75～250 ps）；被除極電位和胞內(nèi)Ca2+激活。因其電導(dǎo)大、對Ca2+敏感、電壓依賴性及獨特的藥理特性而區(qū)別于其他離子通道。當(dāng)BKCa通道開放時，K+離子外流，膜電位更負，調(diào)制許多重要的生理過程；研究發(fā)現(xiàn)，在耳部，BKCa通道和K（v）型鉀通道一起參與耳蝸感受器電位的形成［2］，調(diào)節(jié)耳蝸毛細胞頻率發(fā)放及神經(jīng)遞質(zhì)的釋放等［3，4］。在聽覺形成過程中K+通道發(fā)揮著關(guān)鍵作用，故本研究擬通過觀察氧自由基供體之一H2O2及抗氧化劑維生素C對老年豚鼠耳蝸外毛細胞大電導(dǎo)鈣激活鉀通道的影響，探討是否存在氧自由基／BKCa途徑調(diào)節(jié)外毛細胞乃至內(nèi)耳的功能，為臨床防治老年性聾的研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 實驗動物和分組 選用無耳毒性藥物接觸史、無長期噪聲環(huán)境暴露史的雜色健康36月齡豚鼠25只（由瀘州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心購買），體重1 000～1 500 g，雌雄不拘。

5只豚鼠用來觀察BKCa通道的特性及鑒定，5只用來觀察H2O2對BKCa通道的作用（4μmol／L H2O2組，對照組），15只用來觀察4μmol／L H2O2和不同濃度維生素C（20、50、100μg／ml）對BKCa通道的作用（每組5只，分別為：4μmol／L H2O2+ 25μg／ml維生素C組、4μmol／L H2O2+50μg／ml維生素C組、4μmol／L H2O2+100μg／ml維生素C組）。

1.2 實驗藥物及設(shè)備 細胞外液（mmol／L）：NaCl 137，KCl 5.4，MgCl21，CaCl21.8，HEPES 10，Glucose 10，NaOH調(diào)節(jié)PH至7.4。電極液（mmol／L）：NaCl 12，KCl 128，MgCl24，HEPES 10，EGTA（ethylenebis（oxyethylenenitrilo）tertraacetic acid，乙二醇-雙（2-氨基乙基）四乙酸0.05，KOH調(diào)節(jié)PH至7.2。浴液（mmol／L）：NaCl 137，KCl 5.9，MgCl21.2，CaCl21.8，HEPES 10，Glucose 14，NaOH調(diào)節(jié)PH至7.4。1 mol／L過氧化氫（hydrogen peroxide）：H2O2，國產(chǎn)。維生素C（Vitamin C，Ascorbic Acid）：C6H8O6，國產(chǎn)分析純。膜片鉗放大器（AXOPATCH 200B Axon Instruments，USA），A／D-D／A轉(zhuǎn)換器（Digital-1200 Axon Instruments，USA），離子通道計算機分析系統(tǒng)（Pclamp9.0 Axon instrument，USA）。記憶示波器（VC-11 Nihon Konden，Japan），三通道刺激器（SEN-7203 Nihon konden，Japan）。微管電極拉制器（PP-83 Narishige，Japan），微電極拋光儀（MF-83 Narishige，Japan），三維操縱器（WN203 Narishige，Japan），倒置相差顯微鏡（IMT -2，Olympus，Japan）。

1.3 豚鼠耳蝸外毛細胞的分離方法 將豚鼠快速斷頭，取出顳骨聽泡，迅速打開聽泡，將耳蝸置人已充氧的冷細胞外液中；解剖顯微鏡下仔細剔除耳蝸骨殼，盡量保持膜迷路完整；斷開蝸軸，將去除蝸殼的剩余耳蝸移入含Ⅳ型膠原酶的細胞外液中消化12分鐘；然后移入裝有浴液并預(yù)先用纖維連接純化蛋白處理底部1小時的浴槽中終止消化。解剖鏡下撕碎可見的基底膜組織，輕輕吹打后靜置20～30分鐘，選擇貼壁良好、立體感強、表面光滑、胞核接近底部、胞內(nèi)無布朗運動顆粒、胞膜完整有雙折射現(xiàn)象的單離外毛細胞進行觀察和實驗。

1.4 BKCa通道電流的記錄方法和鑒定方法

1.4.1 BKCa通道電流的記錄方法 采用膜片鉗全細胞記錄模式記錄豚鼠耳蝸外毛細胞BKCa通道的活性。選擇鉗制電壓（VH）為-60 m V，以10 m V為一個階躍，指令電壓（VT）從-50 m V起除極至+ 50 m V，刺激持續(xù)時間400 ms，激活BKCa通道，記錄其電流。記錄在屏蔽防震工作臺上進行。

1.4.2 BKCa通道電流的鑒定 在上述溶液中，膜片鉗全細胞記錄方式下記錄到穩(wěn)定的電流后，觀察BKCa通道特異性阻斷劑伊比利亞毒素（iberiotoxin，Ib TX）對BKCa通道電流的影響，以鑒定是否為BKCa通道電流。

1.5 觀察H2O2和維生素C對BKCa通道電流的影響 5只豚鼠的耳蝸外毛細胞用來觀察H2O2對BKCa通道的作用。在2 ml浴槽內(nèi)加入H2O2稀釋液40μl，使浴液中的H2O2濃度達到4μmol／L，觀察H2O2對BKCa通道的作用；在2 ml浴槽內(nèi)加入H2O2稀釋液40μl，使浴液中的H2O2濃度達到4 μmol／L，再分組加入維生素C液10、20、40μl，使浴液中的維生素C濃度分組達到25、50、100μg／ml（三組，每組5只豚鼠），觀察4μmol／L H2O2和不同濃度維生素C對BKCa通道的作用。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗記錄的電流數(shù)據(jù)采用PClamp 9.0專用軟件進行分析處理。采用電流幅值（current amplitude）、電流密度（current density）、電流-電壓關(guān)系曲線（I-V curve）作為分析指標(biāo)，實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，顯著性檢驗采用配對t檢驗及方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BKCa通道電流的特性 BKCa通道電流為一串幅值較大、快速激活（激活時間約0.2～0.4 ms）、幾乎不失活的電流（圖1），此外向電流激活電壓大于-40～-30 m V，其電流幅度以零電流水平至除極化末之間的電流大小表示。圖2示BKCa通道電流-電壓（I-V）關(guān)系曲線，隨著測試電壓由-50 m V向+50 m V變化，BKCa電流隨膜電位的增加而增強，電流幅值不斷增大，并表現(xiàn)出外向整流的特性，記錄的電流無“rundown”現(xiàn)象（即隨著記錄時間的延續(xù)，通道電流逐漸降低的現(xiàn)象）。

2.2 BKCa通道電流的鑒定結(jié)果 當(dāng)溶液中加入Ib TX時，外向電流的幅值和峰值電流密度立即明顯減小，I-V曲線迅速下降。加入Ib TX濃度達到100 nmol／L時，BKCa通道活動完全阻斷，BKCa通道電流消失（圖3），證實該外向電流確實是大電導(dǎo)鈣激活鉀通道電流。

2.3 H2O2對BKCa通道的影響 在H2O2濃度為4μmol／L時，BKCa通道電流比0μmol／L對照組（電流圖同圖1）表現(xiàn)明顯的興奮，電流幅值和峰值電流密度增大（圖4）。用藥3分鐘內(nèi)，當(dāng)VT為+50 m V時，4μmol／L組比對照組從22.09±0.27 p A／p F升至43.53±1.09 p A／p F，增幅為97.06%。

圖1 老年豚鼠耳蝸外毛細胞BKCa通道電流

圖2 老年豚鼠耳蝸外毛細胞BKCa通道電流-電壓曲線（I-V曲線）

圖3 使用Ib Tx（100 nmol／L）后的老年豚鼠耳蝸外毛細胞BKCa通道電流

圖4 加入H2O2濃度為4μmol／L時的BKCa通道電流

2.4 H2O2、維生素C聯(lián)合應(yīng)用對BKCa通道的影響 在H2O2濃度為4μmol／L時，當(dāng)加入的維生素C濃度分別為25、50、100μg／ml條件下，BKCa通道電流表現(xiàn)為濃度依賴性抑制，電流幅值和峰值電流密度隨著維生素C濃度的增加而減?。▓D5，對照組見圖4），I-V曲線下降（圖6）。用藥3分鐘內(nèi)，當(dāng)VT為+50mV時，各組對比對照組BKCa通道峰值電流密度最大值見表1，各濃度維生素C+4μmol／LH2O2組與對照組相比，BKCa通道峰值電流密度幅值差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；但以上濃度維生素C均不改變BKCa通道的激活電位（-40～-30mV），且洗脫后無法恢復(fù)至正常電流水平。

圖5 H2O2、維生素C聯(lián)合應(yīng)用時老年豚鼠耳蝸外毛細胞BK-Ca通道電流

圖6 H2O2、維生素C聯(lián)合應(yīng)用對老年豚鼠耳蝸外毛細胞BKCa通道I-V曲線的影響

表1 VT為+50mV時各組耳蝸外毛細胞BKCa通道峰值電流密度幅值（±s）

表1 VT為+50mV時各組耳蝸外毛細胞BKCa通道峰值電流密度幅值（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；△與50μg／ml維生素C+4 μmol／LH2O2組比較，P＜0.05；＃與100μg／ml維生素C+4μmol／LH2O2組比較，P＜0.01

BKCa通道峰值電流增幅組別密度幅值（／）（）PAPF% 4μmol／LH2O2組（對照組）43.53±1.09——25μg／ml維生素C+4μmol／LH2O2組34.85±0.49*△＃-19.94 50μg／ml維生素C+4μmol／LH2O2組30.63±0.56**＃-29.64 100μg／ml維生素C+4μmol／LH2O2組25.79±0.58**-40.75

3 討論

已有確切證據(jù)表明，BKCa通道動力學(xué)特性是毛細胞特征頻率的決定因素，除產(chǎn)生電調(diào)諧外，BKCa通道也參與調(diào)節(jié)突觸部位神經(jīng)遞質(zhì)釋放［5，6］。Langer等［7］發(fā)現(xiàn)小鼠內(nèi)耳毛細胞的聽力損失與大、快電導(dǎo)的鉀通道的表達一致，認為很可能是BKCa通道調(diào)節(jié)內(nèi)耳毛細胞的功能。本實驗引出一串快速激活（激活時間約0.2～0.4ms）、幅值較大、幾乎不失活的電流，此外向電流激活電壓大于-40～-30 mV，隨著測試電壓由-50mV向+50mV變化，電流隨膜電位的增加而增強，電流幅值不斷增大，當(dāng)VT為+50mV時，電流幅值A(chǔ)m達到峰值；I-V關(guān)系曲線呈上升型，記錄的電流無“rundown”現(xiàn)象，表現(xiàn)出大電導(dǎo)、電壓依賴性（通道開放、開放概率和電流幅值以及通道平均開放時間隨著膜電位的增加而相應(yīng)增加，通道平均關(guān)閉時間隨著膜電位的增加而逐漸減少）、快速激活、鉀離子選擇性及外向整流的特性，提示可能為BKCa通道電流。

伊比利亞毒素（iberiotoxin，IbTX）是BKCa通道的特異性阻斷劑，IbTX對通道的阻斷作用呈濃度依賴性。從文中結(jié)果看，當(dāng)溶液中加入IbTX時，外向電流的幅值和峰值電流密度立即明顯減小，加入IbTX濃度達到100nmol／L時，通道活動完全阻斷，通道電流消失，再次證實本實驗記錄到的外向電流確實是BKCa通道電流。

本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，H2O2對BKCa通道呈濃度依賴性的激活作用，即電流幅值、峰值電流密度增加，提示H2O2產(chǎn)生的外源性氧自由基能夠通過作用于BKCa通道蛋白的氨基酸殘基，氧化修飾多肽鏈骨架和側(cè)鏈，顯著改變氨基酸的性質(zhì)，從而改變整個蛋白質(zhì)的功能。維生素C可在胞外防止氧自由基損害，捕獲包括過氧化作用最強的羥自由基等各種自由基，還有明顯提高谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPx）的作用［8］。維生素C不僅促使雙硫基（-S—S -）還原為巰基（-SH），使巰基在體內(nèi)與其它抗氧化物質(zhì)一起清除自由基，還能防止維生素A、維生素E以及不飽和脂肪酸的氧化，阻止體內(nèi)的氧化損傷過程。維生素C作為細胞內(nèi)抗氧化劑，對與突變、癌變有關(guān)的DNA氧化損傷具有重要的保護作用［9］。本實驗加入維生素C后，BKCa通道電流表現(xiàn)濃度依賴性的抑制作用，推測維生素C通過捕獲包括過氧化作用最強的羥自由基等各種自由基，并明顯提高谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的活性而發(fā)揮效應(yīng)；另外，在洗脫及加入維生素C后BKCa通道電流不能恢復(fù)到加藥前正常水平，推測氧化作用不能完全迅速消失，或部分H2O2滲透過胞膜進入胞質(zhì)，從而繼續(xù)表現(xiàn)出通道激活狀態(tài)。

現(xiàn)在仍不完全清楚氧化還原劑如何調(diào)節(jié)BKCa通道活性的機制。BKCa通道中半胱氨酸殘基的氧化使整個通道門控活性改變可能如下：接近鈣結(jié)合區(qū)的1個或多個硫氫基（Sulfhydryl）基團被DTNB、標(biāo)準(zhǔn)乙基嗎啉（NEM）氧化成二硫化物，負電荷減少而降低與Ca2+的親和力［10］。氧自由基與其他調(diào)節(jié)物如蛋白激酶不同，其作用無特異的靶氨基酸，氧自由基大量產(chǎn)生時，加快氨基酸殘基的氧化。BKCa通道蛋氨酸殘基氧化，將增大BKCa通道活性，促進膜復(fù)極化，限制過量Ca2+進入細胞內(nèi)，抑制神經(jīng)遞質(zhì)尤其是興奮性氨基酸的釋放，從而保護神經(jīng)細胞免受損傷［11］。

綜上所述，推測當(dāng)病理條件（如老齡耳蝸缺血再灌注損傷）下，耳蝸氧自由基等代謝產(chǎn)物可大量增加，過量Ca2+進入毛細胞內(nèi)，造成鈣超載現(xiàn)象，從而促使神經(jīng)細胞的神經(jīng)遞質(zhì)尤其是興奮性氨基酸大量釋放，造成神經(jīng)細胞（包括毛細胞）損傷。而此時機體可激活BKCa通道，并通過H2O2／BKCa途徑，促進膜復(fù)極化，限制過量Ca2+進入細胞內(nèi)，抑制神經(jīng)遞質(zhì)釋放，避免神經(jīng)細胞的損傷。氧自由基的細胞毒性可導(dǎo)致細胞死亡、基因突變、染色體畸變等，需要借助內(nèi)源性抗氧化酶系統(tǒng)和非酶性抗氧化系統(tǒng)來清除，而長期給予外源性的抗氧化劑無疑將增強耳蝸抗氧化的能力，從而有效延緩老年性聾的發(fā)病。臨床上應(yīng)用抗氧化劑如維生素C、維生素E、α-硫辛酸預(yù)防老年性聾，也有一定的療效，也支持上述機制存在的可能性。

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（2014-06-30收稿）

（本文編輯 雷培香）

Effects of Vitamin C and Hydrogen Dioxide on the Electric Current of Large-conductance Calcium-activated Potassium Channels in lsolated Outer Hair Cells of Old Guinea Pigs’Cochlears

Lai Dan*，Huang Fei，Qin Gang
（*Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery，The affiliated Hospital of Luzhou Medical College，Luzhou，646000，China）

Objective To study the effects of hydrogen dioxide（oxygen free radical donator）and vitamin C（oxygen free radical scavenger）on the electric current of large conductance calcium-activated potassium channels（BKCa channels）in isolated outer hair cells in aging guinea pigs.Methods Acute enzyme was used to isolat outer hair cells of aging guinea pigs，in which of BKCa channel＇s electric current was observed and recorded by whole-cell recording mode of patch-clamp.After recording the stable and normal electric current of BKCa channels，added H2O2dilution（0.2 mmol／L）40μl in the 2 ml chambers within freshly isolated outer hair cells so that the concentration of H2O2in the balneum would be 4μmol／L.The groups（n＝5）received individually vitamin C solution（5 mg／ml）0，10，20，40μl in the 2 ml chambers within freshly isolated outer hair cells so that the concentration of vitamin C in the balneum would be 0，25，50，100μg／ml，observing and recording the effects of different concentrationof vitamin C to electric current of BKCa channels.Results ①In the whole-cell mode of patch-clamp，the rapid activation and non-deactivation electric current with a string of large amplitude was recorded，above-40～-30 m V activation voltage.The electric current increased with the increasing membrane potential.The amplitude increased continuously and performed characteristics of outward rectification.When the concentration of Ib TX was 100 nmol／L，the activity of the channel was completely blocked and confirmed BKCa channel＇s electric current.②Medication within three minutes，when VTwas+50 m V，the BKCa channels＇the maximum peak current densities of 4μmol／L H2O2group rose from 22.09±0.27 PA／PF to 43.53±1.09 PA／PF，amplification was 97.06%.In H2O24μmol／L+vitamin C with different concentrations as 25，50，100μg／ml groups，the BKCa channels＇electric current performed about concentration-dependent inhibition，and electric current＇s amplitude and peak current density decreased with the increasing concentration of vitamin C，the I-V curves were reduced.However，this still could not be recovered to the normal levels.Conclusion The oxygen free radical／BKCa exists in the process.The vitamin C as oxygen free radical scavenger can reverse the process to a large extent.

Large-conductance calcium-activated potassium channel； Outer hair cell； Oxygen free radical； Vitamin C； H2O2

10.3969／j.issn.1006-7299.2015.02.015

時間：2015-3-3 14：40

R764

A

1006-7299（2015）02-0181-05

△ 四川省衛(wèi)生廳科學(xué)研究項目（130358）資助

1 瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科（瀘州 646000）； 2 宜賓市第一人民耳鼻咽喉科

賴丹，女，四川人，碩士，副教授，主要研究方向為聽力學(xué)臨床與基礎(chǔ)。

賴丹（Email：lz_ld@126.com）

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／42.1391.R.20150303.1440.039.html