李錦秀楊琨吳莎華清泉

·實驗研究·

長期注射水楊酸鈉對大鼠聽皮層酪氨酸受體激酶B及c-fos基因表達的影響*

李錦秀1楊琨1吳莎1華清泉1

目的 通過觀察長期注射水楊酸鈉后大鼠聽皮層中酪氨酸受體激酶B（Trk B）及c-fos基因的表達，探討其在水楊酸鈉耳毒性機制中的作用。方法 健康成年Wistar大鼠36只，分為正常組（不做任何處理）、慢性組（肌肉注射水楊酸鈉175 mg／kg，2次／天，時間間隔8小時，連續(xù)注射14天）、慢性恢復組（前期處理同慢性組，停藥后恢復28天），每組12只。造模結(jié)束后各組大鼠均行聽性腦干反應（ABR）檢測，然后斷頭處死并迅速取出聽皮層，運用實時熒光定量PCR技術(shù)及Western-blot技術(shù)分別檢測三組大鼠聽皮層中TrkB及c-fos的表達。結(jié)果正常組ABR反應閾為36±2.23 dB SPL，慢性組反應閾升高為41.3±3.31 dB SPL，與正常組比較，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；慢性恢復組ABR反應閾為38.6±5.51 dB SPL，與正常組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。慢性組聽皮層c-fos mRNA表達為1.24±0.09，蛋白的表達為0.70±0.12，慢性恢復組聽皮層c-fos mRNA的表達為1.23±0.04，蛋白的表達為0.68±0.08，兩組均高于正常組（分別為1.12±0.05、0.50±0.04），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。慢性組聽皮層TrkB mRNA表達為1.26±0.10，蛋白的表達為1.85±0.17，慢性恢復組聽皮層Trk B m RNA表達為1.23±0.07，蛋白的表達為1.80±0.08，均高于正常組（分別為1.11±0.03，1.53 ±0.16），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論 長期注射水楊酸鈉后大鼠聽皮層c-fos基因表達升高，可能與聽覺中樞神經(jīng)活動增強有關(guān)；長期注射水楊酸鈉可能通過上調(diào)大鼠聽皮層Trk B的表達，增強聽皮層神經(jīng)營養(yǎng)因子的功能促進聽皮層功能重塑。

水楊酸鈉； 酪氨酸受體激酶B； c-fos基因

水楊酸鈉制劑在臨床上被廣泛用于治療慢性炎性疾病，但其大劑量使用時可產(chǎn)生明顯的耳毒性副作用。長期以來學者們對水楊酸鈉的耳毒性進行了大量的研究，從聽覺系統(tǒng)的不同層面（包括中樞和外周）探討了水楊酸鹽耳毒性及其導致耳鳴的機制［1～3］。前期研究發(fā)現(xiàn)，急性水楊酸鈉注射后動物畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射（DPOAE）幅值出現(xiàn)可逆性降低，而長期水楊酸鈉注射的耳鳴模型動物DPOAE幅值逐漸升高且為可逆性的［4］，耳蝸神經(jīng)電生理活動平均譜（ASECA）幅值逐漸上升［5］；慢性注射水楊酸鈉使大鼠耳蝸prestin表達上調(diào)［6］。這些研究從外周機制上對慢性注射水楊酸鈉致耳鳴的機制作了深入探討。然而，水楊酸鈉的中樞效應同樣不可忽視。研究表明，水楊酸鈉能引起動物聽覺通路神經(jīng)元電活動的一系列改變［7～9］，同時，在對耳鳴患者的研究中也發(fā)現(xiàn)了聽皮層神經(jīng)元代謝活動增加和功能重組的證據(jù)［3］，說明聽覺中樞尤其是聽皮層功能活動的變化可能在耳鳴的產(chǎn)生中具有更為重要的作用。因此，本研究采用長期大劑量注射水楊酸鈉建立耳鳴動物模型，通過觀察其聽皮層中與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能可塑性密切相關(guān)的c-fos基因以及與神經(jīng)元修復再生密切相關(guān)的酪氨酸受體激酶B（Trk B）的表達及變化，進一步探討水楊酸鈉耳毒性的中樞機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 水楊酸鈉購自美國Sigma公司，以生理鹽水溶解，配成10%溶液；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit購自美國Thermo公司；定量PCR試劑盒購自日本TOYOBO公司；Trk B、c-fos多克隆抗體均購自美國Santa公司，HRP標記山羊抗兔二抗購自KPL公司；ECL（enhanced chemiluminescence）化學發(fā)光底物購自武漢谷歌生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物分組及處理 選擇健康成年Wistar大鼠36只（由湖北省預防科學院動物實驗中心提供），雌雄不限，體重200～300 g，耳廓反射靈敏，無中耳感染、強噪聲暴露及耳毒性藥物應用史。適應性飼養(yǎng)一周后，將實驗動物隨機分為慢性組、慢性恢復組，正常對照組，每組12只。實驗前均進行ABR檢測，排除ABR反應閾大于40 dB SPL的動物。將水楊酸鈉（Sigma公司，S2679）溶于生理鹽水中配成10%溶液，慢性組動物肌肉注射水楊酸鈉175 mg／kg，2次／天，時間間隔8小時，連續(xù)注射14天；慢性恢復組大鼠前期處理同慢性組，注射14天后停藥，并恢復28天；正常對照組不予任何處理。造模結(jié)束后，檢測各組大鼠ABR反應閾，然后斷頭處死并迅速剝離下丘，其中每組6只用于檢驗Trk B及c-fos mRNA的變化，另外6只用于檢測Trk B及c-fos蛋白的改變。

1.2.2 ABR檢測 大鼠經(jīng)2%戊巴比妥鈉50 mg／kg腹腔注射麻醉后，保持肛溫37℃并置于隔聲屏蔽室內(nèi)進行檢測。選用短聲（click）作為刺激聲，單耳刺激，耳機發(fā)聲窗距外耳道口1 cm，刺激速率為21次／秒，帶通濾波100～3 000 Hz，觀察時程為10 ms，疊加次數(shù)1 024次。記錄電極置于兩側(cè)外耳道口與顱正中線交叉處皮下，參考電極置于同側(cè)耳乳突皮下，接地電極置于鼻尖正中皮下。測試聲強從110 dB SPL開始，以5 dB逐次遞減，以波Ⅲ最后消失的上一強度作為ABR反應閾。

1.2.3 RT-PCR檢測聽皮層Trk B及c-fos表達 各組大鼠處死剝離的聽皮層立即放入液氮中，隨后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存。樣品收集完后采用Trizol法分別提取總RNA，紫外分光光度計測定其濃度計純度。根據(jù)Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書進行cDNA的合成，反應條件為：42℃30分鐘，80℃5分鐘，將c-DNA產(chǎn)物置于-20℃保存。在Genbank數(shù)據(jù)庫中查找大鼠TrkB及c-fos基因序列，使用primer5.0軟件設計大鼠目的基因及內(nèi)參β-action引物，交由Invitrogen公司合成（表1）。RT-PCR反應擴增

條件為：95℃預變性1分鐘，95℃變性15秒，58℃退火15秒，72℃延伸20秒，進行40個循環(huán)。各基因表達變化采用比較閾值法即2-△△Ct法計算。

表1 大鼠Trk B及c-fosβ-action引物序列

1.2.4 Western blot檢測聽皮層Trk B及c-fos蛋白表達 標本分別加入適當體積組織裂解液后冰上徹底勻漿，離心后取上清液。采用Bradford方法測定蛋白濃度，各組取總蛋白40μg上樣經(jīng)10% SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉液室溫封閉1小時，將PVDF膜分別浸泡于兔抗鼠Trk B多克隆抗體（1：1 000）、兔抗鼠GABAAα1多克隆抗體（1： 1 000）、兔抗鼠c-fos多克隆抗體（1：1 000）4℃過夜，TBST洗滌5 min×3次，加入HRP標記羊抗兔二抗（1：3 000）室溫下孵育30分鐘，TBST洗滌5 min×3次，在暗室內(nèi)加入ECL化學發(fā)光底物曝光，最后用顯影、定影試劑進行顯影和定影。選用βaction的表達量為參照標準，并用Alpha軟件處理系統(tǒng)分析結(jié)果，以光密度比值作為相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內(nèi)比較采用配對樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 ABR檢測結(jié)果 造模完成后，慢性組ABR反應閾升高為41.3±3.31 dB SPL，與正常組比較，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；慢性恢復組ABR反應閾為38.6±5.51 dB SPL，與正常組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表2）。

表2 三組大鼠ABR反應閾、c-fos和TrkB mRNA及其蛋白的表達（±s）

表2 三組大鼠ABR反應閾、c-fos和TrkB mRNA及其蛋白的表達（±s）

注：與正常組比較，△P＜0.01，*P＜0.05

組別ABR反應閾（dB SPL）c-fos mRNA c-fos蛋白TrkB mRNA TrkB 蛋白正常組36.0±2.23 1.12±0.05 0.50±0.04 1.11±0.03 1.53±0.16慢性組41.3±3.31△1.24±0.09*0.70±0.12*1.26±0.10*1.85±0.17*慢性恢復組38.6±5.51 1.23±0.04*0.68±0.08*1.23±0.07*1.80±0.08*

2.2 聽皮層TrkB及c-fos mRNA表達 三組大鼠聽皮層中均可檢測到Trk B、c-fos m RNA的表達，慢性組及慢性恢復組聽皮層中c-fos及Trk B m RNA的表達均高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表2）。

2.3 聽皮層c-fos及Trk B蛋白表達情況 Western blot結(jié)果顯示，慢性組及慢性恢復組聽皮層cfos及Trk B蛋白的表達量均高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖1，表2）。

3 討論

動物學實驗證實，長期注射水楊酸鈉是一種建立耳鳴動物模型的有效方法［10，11］。本研究結(jié)果顯示，慢性水楊酸鈉注射后動物ABR反應閾升高，而慢性恢復組動物ABR反應閾與正常組比較差異無統(tǒng)計學意義，表明本實驗所采用的慢性造模方法能夠引起實驗動物可逆性的聽力損失。Hu等［11］運用與本研究類似的方法（長期腹腔注射水楊酸鈉，200 mg／kg，2次／天，間隔8小時）建立動物模型后，應用聽覺驚跳反射的間隔前沖動抑制（gap pre-pulse inhibition of acoustic startle，GPIAS）法對大鼠進行耳鳴行為學檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，慢性腹腔注射水楊酸鈉3、7和14天后的動物有耳鳴行為學表現(xiàn)。

c-fos基因是一種快反應基因，c-fos基因的表達可以反映中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能活動的變化［12］；在靜止細胞受到各種刺激時c-fos迅速表達，已證實異常感覺刺激或神經(jīng)元的異常電活動可以導致中樞相應功能區(qū)c-fos基因表達增多，并認為與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能可塑性有關(guān)［13］。本研究結(jié)果顯示，長期注射水揚酸鈉的慢性組大鼠聽皮層中c-fos的表達增加，結(jié)合類似造模方法的動物行為學研究文獻［10，11］，推測長期大劑量注射水楊酸鈉能夠引起動物聽覺中樞神經(jīng)元活動增強，并出現(xiàn)類似耳鳴的表現(xiàn)。慢性恢復組中c-fos表達仍高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），說明長期注射水楊酸鈉

導致的聽力損失恢復后，聽皮層有可能仍然處于興奮狀態(tài)，從而表現(xiàn)出耳鳴的持續(xù)存在，此有待進一步實驗驗證。

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中最重要的一員，酪氨酸受體激酶B（Trk B）是Trk受體的一種，BDNF與神經(jīng)元細胞膜特異性受體Trk B結(jié)合，導致受體二聚化和自身磷酸化，使受體具有生物活性，從而激發(fā)細胞內(nèi)信號瀑布，包括絲裂源活化蛋白激酶通路（MAPK）、磷酸肌醇-3-激酶（PI3K）通路等，這些通路均在突觸活動相關(guān)蛋白翻譯與轉(zhuǎn)運過程中起著關(guān)鍵作用［14］。因此，BDNF-Trk信號傳導通路被認為對神經(jīng)元的存活、生長、形態(tài)和功能的可塑性等起著重要的作用。本研究結(jié)果顯示，慢性注射水楊酸鈉組Trk B mRNA及蛋白的表達均高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），說明長期注射水楊酸鈉后，聽皮層中出現(xiàn)更多的Trk B受體，通過與BDNF結(jié)合，可能參與中樞重塑的過程。

有研究發(fā)現(xiàn)，大劑量注射水楊酸鈉后，聽皮層中低頻特異性調(diào)諧區(qū)域的神經(jīng)元細胞上移，而高頻特異性調(diào)諧區(qū)域的神經(jīng)元細胞下移，從而導致聽皮層中頻代表區(qū)域（10～20 k Hz）擴大，表現(xiàn)出功能的重組，而這種重組與水楊酸鈉引起的可覺察耳鳴的頻率一致［15］。結(jié)合本研究結(jié)果，推測在給動物慢性注射水楊酸鈉過程中，可能有更多的BDNF與神經(jīng)元軸突末梢Trk B結(jié)合并逆行運輸至胞體，維持神經(jīng)元的生理功能及突觸傳遞，并促進聽皮層神經(jīng)元功能重塑，其具體機制有待進一步設計更加完善的實驗加以驗證。

1 Chen G，F(xiàn)eng L，Liu Z，et al.Both central and peripheral auditory systems are involved in salicylate-induced tinnitus in rats：a behavioral study［J］.PLoS One，2014，30：e108659.

2 Chen GD，Radziwon KE，Kashanian N，et al.Salicylate-induced auditory perceptual disorders and plastic changes in nonclassical auditory centers in rats［J］.Neural Plast，2014，doi：10.1155／2014／658741.

3 Sheppard A，Hayes SH，Chen GD，et al.Review of salicylate -induced hearing loss，neurotoxicity，tinnitus and neuropathophysiology［J］.Acta Otorhinolaryngol Ital，2014，34：79.

4 Huang ZW，Luo Y，Wu Z，et al.Paradoxical enhancement of active cochlear mechanics in long-term administration of salicylate［J］.J Neurophysiol，2005，93：2053.

5 Cazals Y，Horner KC，Huang ZW.Alterations in average spectrum of cochleoneural activity by long-term salicylate treatment in the guinea pig：a plausible index of tinnitus［J］.J Neurophysiol，1998，80：2113.

6 Yang K，Huang ZW，Liu ZQ，et al.Long-term administration of salicylate enhances prestin expression in rat cochlea［J］. Int J Audiol，2009，48：18.

7 Jung da J，Han M，Jin SU，et al.Functional mapping of the auditory tract in rodent tinnitus model using manganese-enhanced magnetic resonance imaging［J］.Neuroimage，2014，100：642.

8 Holt AG，Bissig D，Mirza N，et al.Evidence of key tinnitusrelated brain regions documented by a unique combination of manganese-enhanced MRI and acoustic startle reflex testing［J］.PLoS One，2010，5：e14260.

9 Paul AK，Lobarinas E，Simmons R，et al.Metabolic imaging of rat brain during pharmacologically-induced tinnitus［J］. Neuroimage，2009，44：312.

10 陳抗松，廖華，楊希林，等.水楊酸致耳鳴大鼠的行為學及聽性腦干反應改變［J］.聽力學及言語疾病雜志，2013，21：163.

11 Hu SS，Mei L，Chen JY，et al.Expression of immediateearly genes in the inferior colliculus and auditory cortex in salicylate-induced tinnitus in rat［J］.Eur J Histochem，2014，58：2294.

12 Panford-Walsh R，Singer W，Rüttiger L，et al.Midazolam reverses salicylate-induced changes in brain-derived neurotrophic factor and arg3.1 expression：implications for tinnitus perception and auditory plasticity［J］.Mol Pharmacol，2008，74：595.

13 Wallh?usser-Franke E，Cuautle-Heck B，Wenz G，et al. Scopolamine attenuates tinnitus-related plasticity in the auditory cortex［J］.Neuroreport，2006，17：1487.

14 Wahle P，Di Cristo G，Schwerdtfeger G，et al.Differential effects of cortical neurotrophic factors on development of lateral geniculate nucleus and superior colliculus neurons：anterograde and retrograde actions［J］.Development，2003，130：611.

15 Stolzberg D，Chen GD，Allman BL，et al.Salicylate-induced peripheral auditory changes and tonotopic reorganization of auditory cortex［J］.Neuroscience，2011，180：157.

（2014-10-10收稿）

（本文編輯 雷培香）

Effects of Long Term Administration of Sodium Salicylate on the Expression of TrkB and c-fos in Rat Auditory Cortex

Li Jinxiu，Yang Kun，Wu Sha，Hua Qingquan
（The Department of Otolarygology Head and Neck Surgery，Renmin Hospital of Wuhan University，Whuhan，430060，China）

Objective To study the expression of TrkB and c-fos in rat auditory cortex after long-term administration of sodium salicylate and the mechanisms of salicylate ototoxiclty.Methods Normal adult rats were divided into three groups：normal group without any treatment，long-term treatment group given i.m.injections，175 mg／kg，twice daily at 9：00 am and 6：00 pm for consecutive 14 days and the recovered group using the same method as the chronic group except that they were sacrificed 28 days after salicylate treatment ceased.After the detection of ABR，rats were sacrificed after deep anesthesia，and the auditory cortexes were dissected rapidly.Realtime PCR and Western-blot were explored to detect the expression of TrkB and c-fos.Results The average ABR threshold of normal rats was 36±2.23 dB SPL.The average ABR threshold of long-term group was 41.3±3.31 dB SPL，which was significantly increased than normal group（P＜0.01）.The average ABR threshold of the recovered

Sodium salicylate； Receptor tyrosine kinase pathway（TrkB）； c-fos

10.3969／j.issn.1006-7299.2015.03.016

時間：2015-3-3 14：39

R764.5

A

1006-7299（2015）03-0276-04

* 國家自然科學基金青年基金（81100712）資助

1 武漢大學人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（武漢 430060）

李錦秀，女，湖北人，主治醫(yī)師，在職碩士，主要研究方向為耳科學。

華清泉（Email：hqqrm@sina.com）；楊琨（Email：bluee_kyoung@163.com）

網(wǎng)絡出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／42.1391.R.20150303.1439.019.html

group was 38.6±5.51 dB SPL.There were no differences between the recovered group and normal group（P＞0. 05）.The expression of c-fos mRNA（1.24±0.09）and protein（0.70±0.12）in the long-term group were significantly increased，when compared with the normal group.The c-fos m RNA（1.23±0.04）and protein（0.68±0.08）expression in the recovered group were also significantly increased compared with the normal group.The expression of Trk B mRNA（1.26±0.10）and protein（1.85±0.17）in the long-term group were significantly increased，when compared with the normal group.The TrkB m RNA（1.23±0.07）and protein（1.80±0.08）expression in the recovered group were also significantly increased compared with the normal group.Conclusion The inereased expression of c-fos in the long-term group may be related to the enhancement of central auditory function.The inereased expression of Trk-B in the long-term group might be involved in instability of synaptic plasticity in tinnitus.