畢 艷，伊正君，付玉榮

（濰坊醫(yī)學(xué)院/山東省臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濰坊261031）

潛 伏 結(jié) 核 感 染（latent mycobacterium tuberculosis infection，LTBI）通常是指體內(nèi)（通常是肺）存在結(jié)核桿菌，但仍未出現(xiàn)明顯的癥狀且痰中也無(wú)結(jié)核菌，當(dāng)機(jī)體免疫力下降時(shí)可由潛伏感染轉(zhuǎn)化為活動(dòng)性結(jié)核感染。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，全球有將近三分之一的人感染過(guò)結(jié)核分枝桿菌，而全國(guó)第4次結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，中國(guó)感染結(jié)核桿菌的人數(shù)超過(guò)了5億，占總?cè)丝诳倲?shù)的44.5%［1］。潛伏性感染者如果不進(jìn)行治療，約有5%～10%將會(huì)發(fā)展成活動(dòng)性結(jié)核，在伴有免疫抑制疾病的人群中，這一比例更大［2］。免疫抑制劑（激素或者生物制劑TNF－α）已經(jīng)成為慢性炎癥性疾?。ㄈ珙愶L(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、或克羅恩病等）有效的治療方法。然而，接受免疫抑制劑患者誘發(fā)活動(dòng)性結(jié)核的風(fēng)險(xiǎn)將大幅增加。因此，對(duì)應(yīng)用免疫抑制劑患者進(jìn)行篩查和預(yù)防性治療是必不可少的。臨床上尚缺乏診斷潛伏性結(jié)核的“金標(biāo)準(zhǔn)”。結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)（TST）因以其成熟的檢測(cè)手段、低成本，成為目前高危人群潛伏性結(jié)核感染的檢測(cè)方法。但是多因素可影響TST的檢測(cè)結(jié)果，導(dǎo)致出現(xiàn)假陰性和假陽(yáng)性結(jié)果，如機(jī)體處于反應(yīng)前期、病毒和支原體感染性疾病、結(jié)核菌素保存不當(dāng)、劑量不足、注射過(guò)深、閱讀記錄偏差、與卡介苗發(fā)生交叉反映等［3，4］。近年來(lái)發(fā)展的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法T－SPOT.TB技術(shù)是一種基于抗原特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)的新型免疫檢測(cè)技術(shù)，為早期診斷結(jié)核潛伏感染提供了新的方向。為此，本文對(duì)T－SPOT.TB技術(shù)在應(yīng)用免疫抑制劑前患者潛伏結(jié)核感染篩查中的應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行評(píng)估。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2010年8月至2013年12月在某院風(fēng)濕免疫科住院治療患者162例，男89例，女7例，年齡（38.6±3.8）歲。結(jié)締組織病98例，其中風(fēng)濕或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎77例，皮肌炎4例，白塞綜合征7例，其中合并貝赫切特血管病5例且行外科手術(shù)治療；紅斑狼瘡10例；強(qiáng)直性脊柱炎54例；克羅恩病7例。排除確診的肺結(jié)核患者，肺結(jié)核確診要求：痰涂片或培養(yǎng)出結(jié)核分枝桿菌；或根據(jù)臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查臨床診斷為肺結(jié)核。免疫抑制劑的應(yīng)用納入標(biāo)準(zhǔn)：所有應(yīng)用免疫抑制劑的患者在應(yīng)用前均行T－SPOT.TB檢查，TST試驗(yàn)。

1.2 T－SPOT.TB檢測(cè) T－SPOT.TB檢測(cè)采用英國(guó) Oxford Immunotee公司生產(chǎn)的試劑盒。每個(gè)入選患者用BD公司生產(chǎn)的CPT真空采血管采集外周血8mL，室溫放置不超過(guò)4h，不得冷藏和冷凍。實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。顯微鏡或放大鏡進(jìn)行斑點(diǎn)計(jì)數(shù)。當(dāng)測(cè)試孔A或B達(dá)到以下標(biāo)準(zhǔn)則判定為陽(yáng)性結(jié)果：（1）陰性對(duì)照斑點(diǎn)數(shù)為0～5個(gè)，A或B孔斑點(diǎn)數(shù)－陰性孔斑點(diǎn)數(shù)為6個(gè)，判斷為陽(yáng)性（＋）；（2）陰性對(duì)照斑點(diǎn)數(shù)26，A或B孔斑點(diǎn)數(shù)22倍陰性孔，判斷為陽(yáng)性（＋）；若A、B孔斑點(diǎn)數(shù)不夠以上標(biāo)準(zhǔn)，且陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)良好，則為陰性（－）。若陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)超過(guò)10，陽(yáng)性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)低于20時(shí)，結(jié)果不能確定。陽(yáng)性結(jié)果說(shuō)明患者體內(nèi)存在針對(duì)結(jié)核桿菌的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，陰性結(jié)果提示患者可能不含針對(duì)結(jié)核桿菌的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞。

1.3 TST檢測(cè) 采用成都生物制品研究所生產(chǎn)人型結(jié)核菌素純蛋白衍生物（purified protein derivative，PPD）試劑，對(duì)所有入選患者以0.1mL PPD（含BCG－PPD 5IU）采用孟都氏法于左側(cè)前臂內(nèi)側(cè)皮內(nèi)注射，使局部形成皮丘。48～72h測(cè)量皮膚硬結(jié)直徑，硬結(jié)平均直徑＝（橫徑＋縱徑）/2。按照標(biāo)準(zhǔn)OT試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷，＜5mm陰性（－），5～＜10mm弱陽(yáng)性（＋），10～＜20mm陽(yáng)性（＋＋），≥20mm或出現(xiàn)破潰，水泡，雙圈強(qiáng)陽(yáng)性（＋＋＋）。

1.4 隨訪 對(duì)應(yīng)用T－SPOT.TB篩查陽(yáng)性的28例患者，在應(yīng)用抗TNF－α生物制劑治療前均給予預(yù)防性抗結(jié)核藥物治療4個(gè)月，并隨訪1年。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料用率表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 T－SPOT.TB及TST試驗(yàn)檢查應(yīng)用免疫抑制劑患者陽(yáng)性率比較 162例患者中，T－SPOT.TB陽(yáng)性例數(shù)為59例，陽(yáng)性率為36.4%；TST陽(yáng)性例數(shù)為46例，陽(yáng)性率為28.4%，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 T－SPOT.TB及TST試驗(yàn)陽(yáng)性率

2.2 T－SPOT.TB及TST試驗(yàn)檢查應(yīng)用免疫抑制劑患者確診率比較 59例T－SPOT.TB陽(yáng)性患者中，確診為結(jié)核感染56例，確診率為94.9%；46例TST陽(yáng)性患者中，確診為結(jié)核感染32例，確診率為69.6%；兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 T－SPOT.TB及TST試驗(yàn)確診率

2.3 T－SPOT.TB技術(shù)篩查后應(yīng)用免疫抑制劑患者管理 鑒于T－SPOT.TB陽(yáng)性患者爆發(fā)結(jié)核感染率較高（94.9%，56/59），有28例應(yīng)用抗TNF－α生物制劑治療且T－SPOT.TB陽(yáng)性患者被納入，對(duì)于LTBI患者，給予目標(biāo)性治療方案（包括單用異煙肼、異煙肼和利福平聯(lián)用、利福平和吡嗪酰胺聯(lián)用等，持續(xù)4個(gè)月。在藥物治療過(guò)程中嚴(yán)密監(jiān)測(cè)患者的肝功能，一旦出現(xiàn)肝炎臨床表現(xiàn)，立即停藥。28例患者應(yīng)用抗TNF－α生物制劑治療，治療前均給予預(yù)防性抗結(jié)核藥物治療4個(gè)月，在1年的隨訪過(guò)程中，28例患者其中2例爆發(fā)肝炎，停抗結(jié)核藥物治療，其中1例死于肝功能衰竭。所有患者均未發(fā)生結(jié)核感染。

3 討 論

結(jié)核病是全球主要的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一，嚴(yán)重危害人類的健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)全球約有1/3的人口接近2億人是潛伏性結(jié)核的感染者。我國(guó)是世界上22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，結(jié)核病患者數(shù)量居世界第2位，全國(guó)約有肺結(jié)核病患者450萬(wàn)人，每年因患結(jié)核病死亡的人數(shù)達(dá)到13萬(wàn)人［5］。因此早期發(fā)現(xiàn)及時(shí)確診結(jié)核病在控制結(jié)核病措施中顯得極為重要。目前臨床上免疫抑制劑制劑已經(jīng)成為慢性炎癥性疾病有效的治療方法。但是應(yīng)用免疫抑制劑，導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞免疫功能下降，包括淋巴細(xì)胞、單核、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞等功能的抑制，容易引發(fā)潛伏結(jié)核分支桿菌感染，引起活動(dòng)性結(jié)核。我國(guó)目前很多醫(yī)院特別是基層的醫(yī)院沒(méi)有對(duì)需要應(yīng)用免疫抑制劑的患者并發(fā)潛伏結(jié)核感染引起足夠的重視，有的醫(yī)院僅做TST篩查，有的根本就沒(méi)篩查，從而導(dǎo)致應(yīng)用免疫抑制劑誘發(fā)結(jié)核病［6－7］。

TST是診斷LTBI的傳統(tǒng)方法，但影響因素很多，導(dǎo)致陽(yáng)性率并不高，張然等回顧性分析了2 682例SLE應(yīng)用免疫抑制劑患者中93例患結(jié)核，93例TST試驗(yàn)強(qiáng)陽(yáng)性僅13例（13.98%），陰性高達(dá)80例（86.02%）［8］。Xie等［9］采用 Meta分析法對(duì)國(guó)內(nèi)常見(jiàn)3種生物制劑治療RA過(guò)程中發(fā)生感染、重癥感染以及結(jié)核感染等的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)。發(fā)現(xiàn)涉及的14例結(jié)核患者在使用生物制劑前的結(jié)核篩查項(xiàng)目為T(mén)ST皮試、胸部平片等傳統(tǒng)手段，篩查結(jié)果均為陰性，說(shuō)明了傳統(tǒng)結(jié)核檢測(cè)手段并不能有效發(fā)現(xiàn)潛伏性結(jié)核患者，達(dá)不到早期診斷的目的。

T－SPOT.TB檢測(cè)原理是利用結(jié)核分枝桿菌RD1區(qū)域編碼的6×103早期分泌抗原靶分子蛋白和10×103培養(yǎng)濾液蛋白的肽段作為特異性抗原，刺激T細(xì)胞釋放γ－干擾素，再分別通過(guò)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)和全血酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)γ－干擾素水平來(lái)判斷是否存在結(jié)核分枝桿菌感染。T－SPOT.TB技術(shù)是目前檢測(cè)抗原特異性T細(xì)胞最敏感的方法，可檢測(cè)出1/100 000～1/50 000外周血單個(gè)核細(xì)胞中經(jīng)某種抗原刺激后釋放某種細(xì)胞因子的細(xì)胞，在2008年，美國(guó)FDA已將TSPOT作為第4種IGRAs批準(zhǔn)使用。Mandalakas等［10］比較T－SPOT.TB與TST對(duì)診斷的準(zhǔn)確性，得出IGRAs在診斷潛伏性結(jié)核感染時(shí)比TST有更大的優(yōu)勢(shì)，而且在排除結(jié)核感染中可信度更大。本研究也說(shuō)明T－SPOT.TB在潛伏性結(jié)核感染診斷的準(zhǔn)確性上要優(yōu)于TST。

日本Takeuchi等［11］報(bào)道5 000例使用英夫利西單抗治療的RA患者中，前2 000例RA患者中結(jié)核發(fā)病數(shù)為11例，由于加強(qiáng)對(duì)后3 000例患者的結(jié)核篩查和預(yù)防性治療，結(jié)核發(fā)病例數(shù)由11/2 000例減少至3/3 000例。因此，本研究中遵循了專家組建議，對(duì)潛伏結(jié)核感染的患者，在使用免疫抑制劑前，先行預(yù)防性抗結(jié)核治療至少4個(gè)月［12］。通過(guò)對(duì)28例高?；颊撸═－SPOT.TB篩查陽(yáng)性），給予預(yù)防性治療的患者1年的隨訪，無(wú)一例結(jié)核病發(fā)生，這與國(guó)外相關(guān)研究結(jié)果是一致的［9，11－12］。所以對(duì) T－SPOT.TB陽(yáng)性的患者給以抗結(jié)核藥物的預(yù)防性治療非常必要的。

由于目前LTBI的診斷缺乏金標(biāo)準(zhǔn)，惟一能證實(shí)的較好方法就是對(duì)未經(jīng)治療的陽(yáng)性個(gè)體進(jìn)行隨訪，這在臨床研究中是難以實(shí)現(xiàn)的。在應(yīng)用免疫抑制劑前對(duì)潛伏結(jié)核感染的篩查就具有重要的臨床價(jià)值。T－SPOT試驗(yàn)具有較高的特異性和敏感性，是目前快速篩查L(zhǎng)TBI感染最有潛力的新方法。本研究認(rèn)為對(duì)于T－SPOT.TB陽(yáng)性的患者給以預(yù)防性的抗結(jié)核治療，加強(qiáng)免疫抑制劑（尤其生物制劑）使用前對(duì)潛伏性結(jié)核感染的檢測(cè)和預(yù)防性治療，可有效且最大程度減低免疫制劑致結(jié)核感染風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)T－SPOT.TB確診的陽(yáng)性LTBI患者給予預(yù)防性抗結(jié)核藥物治療也是非常必要的。

［1］National Technic Steering Group of The Epidemiological Sampling Survey For Tuberculosis，Duanmu H.Report on fourth national epidemiological sampling survey of tuberculosis［J］.Zhonghua Jie He He Hu Xi Za Zhi，2002，25（1）：3－7.

［2］CDC.Latent Tuberculosis Infection：A Guide for Primary Health Care Providers［EB/OL］［2012－01－15］http：//www.cdc.gov/tb/publications/LTB.

［3］American Thoracic Society.Diagnostic standards and classification of tuberculosis in adults and children［J］.Am J Respir Crit Care Med，2000，161：1376－1395.

［4］屠德華.結(jié)核菌素試驗(yàn)的應(yīng)用［J］.中國(guó)防癆雜志，2001，23（2）：123－125.

［5］全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查技術(shù)指導(dǎo)組，全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查辦公室.2000年全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告［J］.中國(guó)防癆雜志，2002，24：98－102.

［6］王宏智，楊艷英，張斌，等.78例風(fēng)濕科患者 T－SPOT.TB檢查結(jié)果分析及應(yīng)用評(píng)價(jià)［J］.浙江醫(yī)學(xué)，2013（18）：1682－1683.

［7］李愛(ài)民，王豫皖.應(yīng)用免疫抑制劑過(guò)程中并發(fā)肺結(jié)核35例臨床分析［J］.中國(guó)防癆雜志，2000，22（1）：36－38.

［8］張然，劉鋼，孫燕玲.系統(tǒng)性紅斑狼瘡合并結(jié)核93例臨床分析［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，27（5）：615－617.

［9］Xie X，Chen J，Peng Y，et al.Meta analysis of infection risks of anti－TNF－αtreatment in rheumatoid arthritis［J］.Zhong Nan Da Xue Xue Bao Yi Yue，2013，38（7）：722－736.

［10］Mandalakas AM，Detjen AK，Hesseling AC，et al.Interferon－gamma release assays and childhood tuberculosis：systematic review and meta－analysis［J］.Int J Tuberc Lung Dis，2011，15（8）：1018－1032.

［11］Takeuchi T，Tatsuki Y，Nogami Y，et al.Postmarketing surveillance of the safety profile of infliximab in 5 000 Japanese patients with rheumatoid arthritis［J］.Ann Rheum Dis，2008，67（2）：189－194.

［12］英夫利西單抗治療前結(jié)核預(yù)防與管理專家建議組.英夫利西單抗治療前結(jié)核預(yù)防與管理專家建議［J］.中華內(nèi)科雜志，2009，48（11）：980－982.