路 勇， 朱思維， 宋晶晶， 黃勤安， 尉 艷

(皖南醫(yī)學院 基礎醫(yī)學院，安徽 蕪湖 241000)

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生物大分子電化學傳感器的研究進展

路 勇， 朱思維， 宋晶晶， 黃勤安， 尉 艷

(皖南醫(yī)學院 基礎醫(yī)學院，安徽 蕪湖 241000)

生物大分子電化學傳感器是圍繞生物大分子的檢測分析研究而開發(fā)出來的一系列電化學傳感器，在這些傳感器中尤其是以納米間隙電化學傳感器性能最為優(yōu)異，在實際的檢測研究中表現(xiàn)出超高靈敏度、微型化、較好的選擇性、所需檢測樣品少、檢測速度快、非常便捷等明顯優(yōu)勢，因而受到了研究人員的極大關(guān)注.本文簡單介紹了生物大分子電化學傳感器的原理、分類、加工技術(shù)及特點，著重分析了間隙電化學傳感器較比常規(guī)電化學傳感器所具備的優(yōu)越特點.綜述了近十年來生物大分子的檢測研究進展，特別是納米間隙電化學傳感器在生物大分子檢測研究中的應用，并對生物大分子電化學傳感器的研究和開發(fā)進行展望.

生物大分子;電化學傳感器;生命分析;納米間隙電極;生物芯片

生物大分子是生物體內(nèi)具有生物活性和復雜空間結(jié)構(gòu)的各種分子量在一萬或數(shù)萬左右的生物有機分子，包括蛋白質(zhì)、核酸、多糖等.生物大分子具有特定的生化結(jié)構(gòu)(組成、序列和構(gòu)象)、分子量大、結(jié)構(gòu)復雜等特點，這些特點也決定了他們具有特定的生物活性以及在生物體中發(fā)揮著重要的生命功能，如維持生物的新陳代謝、遺傳信息的傳遞、生長發(fā)育的調(diào)節(jié)、提供重要的免疫功能，同時也是一些疾病和生命特征的信號標志.由于生物大分子所體現(xiàn)出來的重要生命功能，因此人們對生物大分子的研究也一直在延續(xù)和發(fā)展，其中一項研究就是生物大分子的檢測，特別是在臨床免疫、血液細胞，和分子生物學方面的檢測研究.通常的檢測方法有電分析化學檢測方法、分子生物學檢測方法(如實時熒光定量RT-PCR、流式細胞術(shù)等)、免疫學檢測方法(如酶聯(lián)免疫吸附劑測定法-ELISA等)、光譜法、熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)等，其中電分析化學檢測方法由于近年來新型電分析化學技術(shù)的出現(xiàn)以及各種性能優(yōu)越的生物大分子電化學傳感器的研發(fā)和應用，使得它成為生物分子檢測研究的熱點.

在生物大分子電化學傳感器的研發(fā)過程中，各種納米材料的注入和納米加工技術(shù)的發(fā)展為生物傳感器的發(fā)展提供了新的動力，很大程度上推動了生物大分子電化學傳感器技術(shù)的飛速發(fā)展，也使得它在靈敏度的提高和集成化、微型化發(fā)展方面取得了長足的進步[1-2].其中通過納米材料加工技術(shù)制備出來的多種納米間隙電化學傳感器則表現(xiàn)出更為優(yōu)越的性能，呈現(xiàn)出檢測限更低、靈敏度更高、體積更小、易于開發(fā)成生物芯片等優(yōu)異性能，為生物大分子的痕量檢測提供了一條新的思路.

本文對生物大分子電化學傳感器及其在生物大分子檢測方面的具體應用研究進行了綜述.

1 生物大分子電化學傳感器

生物大分子電化學傳感器是以生物分子作為敏感元件，以各類電極作為信號轉(zhuǎn)換元件，來測量電極在電解質(zhì)溶液中電化學特征檢測信號(電流、阻抗等)變化的傳感器.根據(jù)電化學傳感器的結(jié)構(gòu)類型可分為常規(guī)電化學傳感器和間隙電化學傳感器，其中間隙電化學傳感器又可分為微米間隙電化學傳感器和納米間隙電化學傳感器.

1.1 常規(guī)電化學傳感器

常規(guī)電化學傳感器就是已經(jīng)被廣泛使用的、具有常規(guī)形態(tài)的電化學傳感器，如玻碳電極傳感器、金電極傳感器、銀電極傳感器等.常規(guī)電化學傳感器具有工作面積大、導電性能強、化學及電化學穩(wěn)定性較高、經(jīng)拋光清洗后可反復使用、可適用于較寬的電勢窗等優(yōu)點.因此，裸常規(guī)電化學傳感器和經(jīng)過改造之后的常規(guī)電化學傳感器在傳感器研究領域被非常廣泛的使用.

圖1 IgG生物親和性電化學傳感器的裝配過程示意圖

裸常規(guī)電化學傳感器通常會經(jīng)一些高分子聚合物膜(如聚-甲苯胺藍O、聚2,6-吡啶二胺)、具有特殊結(jié)構(gòu)的大分子化合物(如環(huán)糊精、冠醚、樸啉)和具有優(yōu)越性能的納米材料(如碳納米管、納米金、納米銀、納米金屬氧化物)等修飾，來提高它的檢測靈敏度、改善它的選擇性和擴大它的適用性.例如，Ya-li Yuan等研究人員以金電極傳感器為基礎電極，結(jié)合氨基功能化納米二氧化鈦(Nano-TiO2)的覆蓋，通過戊二醛將IgG抗體與電極連接，利用生物素-鏈霉親和素的結(jié)合以及雙酶底物循環(huán)制備出一種用于IgG檢測分析的生物親和性電化學傳感器(如圖 1所示)[3].

Jin-fen Wang等針對人絨毛膜促性腺激素(HCG)的免疫檢測，成功研制出一種新穎的基于金納米顆粒和聚2,6-吡啶二胺(PPA)/多壁碳納米管復合物的電化學生物傳感器[4].由于PPA和多壁碳納米管的協(xié)同效應，以及GNP的獨特性質(zhì)，該傳感器顯示出相對較低的檢測限0.3mIUmL-1，以及良好的穩(wěn)定性和可重復性.

然而常規(guī)電化學傳感器所具有的體積較大、工作面積大的特點，也成為了它在電極微型化發(fā)展過程中的一個缺點，雖然經(jīng)一些性能優(yōu)越的活性材料修飾改造后，一定程度上提高了它的檢測性能，但在傳感器芯片的研制方面，特別是在生物傳感器芯片的研制方面，并不能發(fā)揮它的作用.

1.2 間隙電化學傳感器

間隙電化學傳感器不同于常規(guī)的電化學傳感器，它是由一個或者多個電極對/電極陣列構(gòu)成，電極對/電極陣列之間具有一定尺寸的電極間隙，電極間隙尺寸一般較小(常為微米級和納米級).根據(jù)間隙尺寸的大小，通常將間隙電化學傳感器分為微米間隙電化學傳感器和納米間隙電化學傳感器.

1.2.1 間隙電化學傳感器的加工 微米間隙電化學傳感器是電極間隙尺寸大小為微米級的間隙電化學傳感器，在各種微米間隙電化學傳感器中，較為常見的是微陣列電極中的微型叉指陣列電極(Interdigitated array microelectrodes)[5].此類電極常用的加工技術(shù)為光刻技術(shù)，它是制作微納米結(jié)構(gòu)材料的核心加工技術(shù)，并且是一種可以進行大規(guī)模生產(chǎn)的微結(jié)構(gòu)加工技術(shù).但是此種技術(shù)由于掩膜版的制作間隙尺寸很難達到納米級，最小只能做到亞微米量級，因此無法用于納米間隙電極的普遍加工.

納米間隙電化學傳感器是指電極間隙尺寸大小達到納米級(100nm以內(nèi))的間隙電化學傳感器.由于普通的加工技術(shù)無法做到納米級別，因此納米間隙電極的制作對電極加工技術(shù)有較高的要求，但隨著近些年材料加工技術(shù)的發(fā)展，為納米間隙電化學傳感器的制作提供了一些有效的構(gòu)建手段.如電子束刻蝕法、原子力顯微鏡納米刻蝕法、接點斷裂法、電子遷移法、碳納米管掩模法、選擇性化學沉積與光刻工藝相結(jié)合的方法、及納米材料在電極間隙中自組裝的方法等.

1.2.2 間隙電化學傳感器的特點 與常規(guī)電化學傳感器相比，間隙電化學傳感器用于生物大分子的檢測研究具有以下優(yōu)勢：(1)電極對/電極陣列的尺寸及其間隙尺寸通常為微米級或納米級，使其檢測靈敏度明顯提高，并且尺寸較小的納米間隙電化學傳感器，則具有更高的檢測靈敏度和更加優(yōu)越的檢測性能；(2)間隙電化學傳感器的工作面積較小，這既易于實現(xiàn)傳感器的微型化，也可以減少檢測樣品的使用量；(3)間隙電化學傳感器有利于構(gòu)建無標記型電化學傳感器，可以免去酶、熒光、放射性物質(zhì)等的標記，從而簡化檢測步驟，縮短檢測耗時，降低檢測成本.

1.3 生物大分子電化學傳感器的應用

近年來，針對不同生物大分子的電化學檢測一直都是生命分析領域的研究熱點，通常生物大分子可分為核酸、蛋白質(zhì)、糖、脂以及它們的復合物，如DNA、酶、激素、生長因子、免疫球蛋白、腫瘤標志物及一些其它的糖蛋白、脂蛋白等.將電化學傳感器用于生物大分子的檢測表現(xiàn)出靈敏度高、選擇性好、檢測速度快、便捷等優(yōu)點.

1.3.1 常規(guī)電化學傳感器對生物大分子的檢測研究 常規(guī)電化學傳感器對生物大分子的檢測研究相對較多，通常是以玻碳電極、金電極等其它一些常規(guī)電極為基電極，將具有優(yōu)越性能的納米材料、高分子膜聚合物及一些生物放大信號酶結(jié)合到電極表面構(gòu)筑而成.

圖2 腫瘤標志物前列腺癌蛋白抗原電化學傳感器的制備過程

Lu-dan Wu等用三維石墨烯綴合金納米顆粒(3D-GR@AuNPs)來修飾玻碳電極(GCE)，從而提供了一種有效基質(zhì)用于抗體的固定，再利用納米多孔銀@碳量子點作為信號放大標簽，制作而成的一種超靈敏電化學發(fā)光免疫傳感器用于腫瘤標志物前列腺癌蛋白抗原(PSA)的檢測(如圖2)[6].

Hong-chuan Yang等以玻碳電極作為基電極，將辣根過氧化物酶(HRP)-功能化的普魯士藍-碳納米管/金納米粒子復合材料作為信號放大的標簽所構(gòu)建的電化學傳感器，用于人絨毛膜促性腺激素(HCG)的靈敏檢測[7].該方法所制備的電化學生物傳感器具有較高的靈敏度(檢測限可低至0.023mIU/mL)、較好的穩(wěn)定性和可重復性，并且可以擴展應用到其他靶蛋白的檢測中.Ru Li等基于納米多孔金和石墨烯制備出無免疫標記的安培傳感器，用于人絨毛膜促性腺激素的檢測.結(jié)果表明，此種傳感器具有較高的準確性，并且固定基質(zhì)納米多孔金也表現(xiàn)出較好的增敏作用與穩(wěn)定性[8].Gen-xi Li研究小組提出了一種新的電化學適體傳感器用于血清中凝血酶的高靈敏、寬濃度范圍和高特異性痕量檢測[9].

圖3 微米間隙電化學傳感器用于人白細胞介素5檢測的示意圖

1.3.2 間隙電化學傳感器對生物大分子的檢測研究 間隙電化學傳感器較比常規(guī)電化學傳感器出現(xiàn)的要晚，由于其所具有的獨特性能，在生物大分子的檢測方面表現(xiàn)出靈敏度更高、操作步驟簡單、試劑消耗少、可接受的穩(wěn)定性和選擇性等優(yōu)點.

1.3.2.1 微米間隙電化學傳感器對生物大分子的檢測研究 常見的微米間隙電化學傳感器是從八十年代初開始被研究者們所認識的各種微陣列電極不斷發(fā)展而來.它既保留了微電極的優(yōu)點，又在一定程度上改善了其檢測性能，使其在電化學傳感方面的發(fā)展較為迅速.

Junhyoung Ahn等將金納米粒子的信號放大作用和亞微米間隙叉指電極相結(jié)合，研發(fā)出一種比酶聯(lián)免疫測定法(ELISA)靈敏度更高的人白細胞介素5(IL5)的檢測方法，如圖3所示[10].其測定過程包括三個主要步驟：白細胞介素5形成抗原-抗體復合物，通過夾心式免疫測定法將金納米粒子綴合在IL5上，金對電信號的增強作用.經(jīng)條件優(yōu)化后，人白細胞介素5的檢測限可以低至1pg/mL.

Ryuzo Ohno等基于微米間隙電極成功構(gòu)建了一種無免疫標記的電化學阻抗人免疫球蛋白A (IgA)電化學傳感器[11].通過人免疫球蛋白A抗體(anti-IgA)在電極表面固定，使人免疫球蛋白A結(jié)合被到電極表面，從而達到檢測的目的.通過這種很簡單的方法，就可以實現(xiàn)IgA的靈敏檢測(0.01-100ng/mL)，說明微米間隙電化學傳感器具有檢測靈敏度高、操作簡單的優(yōu)越性能.

1.3.2.2 納米間隙電化學傳感器對生物大分子的檢測研究 針對尺寸較小的生物分子的檢測，該設備最好具有非常小的尺寸特征，緊湊，并提供足夠水平的靈敏度，如今納米間隙電化學傳感器作為痕量生物分子檢測的強有力手段正在逐漸擴大研究.

圖4 (A)所述的納米-金屬/絕緣體/金屬多層傳感器裝置示意圖.一個5-20納米厚的絕緣層被夾在一對金微電極之間，所述納米間隙的寬度可以很容易地通過改變絕緣層的厚度來調(diào)節(jié). (B)檢測程序：(I)兩個不同的捕獲探針橫跨納米間隙的固定;(II)與靶DNA雜交(綠色);(Ⅲ)沿著橋連分子骨架形成一個可以在電極對間構(gòu)成導電通路的銀導線.

如Zhi-qiang Gao等通過使用標準的硅微加工技術(shù)(考慮到大規(guī)模生產(chǎn)的成本效益和可行性)，根據(jù)電子傳導機制，研制出一種新的用于DNA量化的納米間隙傳感陣列電極(如圖 4所示)[12].其機制是基于通過目標DNA的兩個末端與電極對上兩個不同的表面結(jié)合捕獲探針之間的雜交，從而橋接納米間隙，再通過進一步簡單的金屬化過程，就可以導通納米間隙.在一個表面很干凈(<1.0PS)的傳感器上，僅有1.0fM靶DNA的存在下就可以獲得大約2個數(shù)量級的電導增強.就電導和DNA濃度之間的線性關(guān)系可看到，從1.0fM到1.0pM一個異常信號強度(每單位濃度2.1×104%)的變化.變化如此之大的電導率，使得它能夠明確地檢測定量DNA濃度，并且可以避免當前DNA試驗中所需要使用的靶DNA擴增.此外，由于該傳感器陣列獨特的垂直排列納米結(jié)構(gòu)和雙探針配置，使得它還具有優(yōu)異的單堿基錯配鑒別能力.

圖5 測量納米間隙電容的實驗裝置.(a)所述納米間隙電極兩線阻抗測量設置；(b)一納米間隙的SEM圖;(c)充滿電解質(zhì)的納米間隙.

Luke P. Lee等提出了納米間隙電容作為潛在的無標記生物傳感器的理論和實驗研究(如圖 5所示)[13].研究者們通過使用20納米間隙的多晶硅間隙電極，在僅需1.2pL溶液中，成功測定了100nM的擁有20對(20-mer)堿基的單鏈DNA(ssDNA).由于納米間隙的大小(5-100nm)減小了電極極化效應(無論頻率大小)，因此納米間隙電極具有成為生物分子紐帶的潛力.當間隙尺寸比雙電層厚度小時，納隙電容對離子強度的依賴性不大.這是把電容變化作為目標分子存在指示器的關(guān)鍵.

在此，特別提出一種綜合納米材料和微型叉指陣列電極研制出來的一種納米間隙電化學生物傳感器，在生物大分子的檢測研究中表現(xiàn)出制備簡單、間隙可控、較高的檢測靈敏度和選擇性等優(yōu)勢，正在逐漸被人們開發(fā)和改進，從而更好的應用于目標分子的痕量檢測.

如Jinming Kong等開發(fā)了一種納米間隙生物傳感器，用于核酸的超靈敏電檢測，如圖6所示[14].在這項研究中，肽核酸探針被固定在叉指微電極對的間隙中，然后用它們與互補靶DNA雜交.在此之后，果膠分子通過磷酸鋯和鋯-碳酸酯化學反應引入DNA鏈，并且在高碘乙酸鹽緩沖液(acetate buffer，pH3.98)中進行氧化.新產(chǎn)生的醛基作為反應物，以分解氨銀離子，從而產(chǎn)生銀納米粒子(SNPs)用于橋連微型叉指陣列電極的間隙.金屬納米粒子的導電性將直接與雜交的DNA的量相關(guān).在最佳條件下，此傳感器表現(xiàn)出非常高的3fM檢測靈敏度(S/N>3)，并且本生物傳感器也可適用于RNA的直接檢測.此外，Cheng Fang小組研制出一種以生物傳感器芯片為基礎，通過金納米粒子聚集體(AGNPs，)作為導電標簽的生物傳感器，實現(xiàn)了從50fM-10pM低濃度條件下，22-對(22-mer)寡核苷酸DNA的直接電檢測[15].

圖6 果膠(Pectin)模板化銀納米線形成的示意圖

2 結(jié)語與展望

生物大分子電化學傳感器作為電化學生物傳感器中一種專門針對生物大分子快速、靈敏檢測和分析的研究技術(shù)，為生命科學的研究提供了一種新的手段，在疾病的臨床診斷、疾病治療過程中的實時監(jiān)測、體內(nèi)藥物活性的分析、基因組學、蛋白質(zhì)組學等生命分析領域得到了廣泛的應用.特別是小尺寸的納米間隙電極可以進行電極的微型化、集成化和高通量研究，為生物芯片的開發(fā)提供一種新的方向和支持.但目前有關(guān)此類傳感器的加工技術(shù)以及在生命分析方面的研究依然處于基礎階段且缺乏研究，電極的穩(wěn)定性以及對復雜檢測環(huán)境的適用性不足，并且已有的研究多是使用電學的檢測手段，而在使用電化學發(fā)法對目標分子進行檢測方面的研究則基本沒有，因此圍繞該傳感器更為優(yōu)良的加工技術(shù)的研發(fā)、檢測穩(wěn)定性和適用性方面的研究將依然會是一個相當熱門的研究領域并且這也是開發(fā)微型化、集成化、高通量和低成本生物芯片的研究重點.

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Advances in Biological Macromolecules Electrochemical Sensor

LU Yong, ZHU Si-wei, SONG Jing-jing, HUANG Qin-an, WEI Yan

(Basic Medicine College, Wannan Medical College， Wuhu 241000, China)

Biological macromolecules electrochemical sensors are a series of electrochemical sensors which are developed to detect the biological macromolecules. The nano-gapped electrochemical sensor is most outstanding of them. Due to the high sensitivity, miniaturization, better selectivity, small test sample, test speed, very convenient and other obvious advantages, it has caused the extensive concern and researth. This review briefly introduced the principle, classification, processing techniques and features of biological macromolecules electrochemical sensors and mainly analyzed the superior features of the gap electrochemical sensors in comparison with the conventional electrochemical sensor. The detection of biological macromolecules in recent ten years was summarized and the applications of the nano-gap electrochemical sensors at the biological macromolecules detection were focused. The development of the biological macromolecules electrochemical sensors was also discussed.

biological macromolecule; electrochemical sensor; life analysis; nano-gapped electrodes; biochip

10.14182/J.cnki.1001-2443.2015.03.009

2015-03-25

2014高校優(yōu)秀青年人才支持計劃.

路勇(1989-)，男，漢，安徽宿州人，碩士研究生，研究方向為生物分析化學.通訊作者：尉艷(1977-)，女，教授，安徽蕪湖人，研究方向為生物傳感.

路勇，朱思維，宋晶晶，等.生物大分子電化學傳感器的研究進展[J].安徽師范大學學報：自然科學版，2015，38(3)：254-259.

12.3 O657.1

A

1001-2443(2015)03-0254-06