基于DNA條形碼—產(chǎn)地—形態(tài)分析聯(lián)用的巴西草藥BARDANA(牛蒡)的品種鑒定及高效液相色譜研究

余春霞 顧選 李妍芃 肖瑤 趙百孝 劉春生 馬長華 韓麗

·巴西草藥研究專題·

基于DNA條形碼—產(chǎn)地—形態(tài)分析聯(lián)用的巴西草藥BARDANA(牛蒡)的品種鑒定及高效液相色譜研究

余春霞 顧選 李妍芃 肖瑤 趙百孝 劉春生 馬長華 韓麗

目的 對巴西草藥牛蒡的品種進(jìn)行鑒定,同時研究其中的牛蒡苷含量,為其品種整理和藥理研究提供依據(jù)。方法 利用DNA條形碼—產(chǎn)地—形態(tài)分析聯(lián)用技術(shù)鑒定巴西草藥牛蒡的基原,高效液相色譜法測定其牛蒡苷含量。結(jié)果 DNA條形碼初步鑒定巴西草藥牛蒡為菊科牛蒡?qū)僦参?且與牛蒡達(dá)到最高相似度99%,產(chǎn)地及形態(tài)分析進(jìn)一步確證其為牛蒡的地上部分;巴西牛蒡草中牛蒡苷平均含量為0.281%,明顯低于中國牛蒡草牛蒡苷平均含量3.72%。結(jié)論 巴西草藥牛蒡來源于牛蒡Arctium lappa L.的干燥地上部分,其牛蒡苷含量極低。

巴西草藥; 牛蒡; 品種鑒定; 牛蒡苷

由于中醫(yī)藥事業(yè)的蓬勃發(fā)展和全球化趨勢,世界各民族醫(yī)藥理論和應(yīng)用對中醫(yī)藥都存在著一定的影響,尤其在所用藥物方面存在很多交集。因此,國內(nèi)外各民族藥的研究有利于豐富中藥資源品種和促進(jìn)中藥的安全、有效使用,對實現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。目前在巴西已開發(fā)和有待開發(fā)的藥用植物很多,并且國家也逐漸重視對植物藥的研究和開發(fā)工作。有文獻(xiàn)記載,巴西使用的藥用植物中約有三分之一的種類與中國相同或為近緣種,但其中某些種類的使用方法、部位或主治證有所差異[1]。藥用植物多在巴西偏僻鄉(xiāng)村和印第安部落,一些仍處于原始狀態(tài)。因為諸多因素,過去的幾個世紀(jì)里巴西沒有植物藥藥典,相關(guān)知識和使用主要是口授家傳;沒有權(quán)威配伍藥方,大多是單方茶劑。20世紀(jì)后半葉,由于科學(xué)的發(fā)展、中醫(yī)中藥的推廣和人們對自然養(yǎng)生及自然療法的追求,巴西政府開始在植物藥研究和開發(fā)上進(jìn)行投資[2]。之后巴西出版了許多刊物對已知和常見的藥用植物進(jìn)行介紹,同時及時報道本國或其他國家新開發(fā)的藥用植物,這些都對巴西草藥的開發(fā)應(yīng)用研究具有重要意義。然而,由于地區(qū)間的發(fā)展不平衡,巴西民族藥的研究開發(fā)存在一定的滯后現(xiàn)象,往往存在口耳相傳、缺少文獻(xiàn)記載、使用特殊的語言符號收載、品種混亂、基原和資源量不清、入藥部位混亂、品質(zhì)不詳?shù)痊F(xiàn)象。

巴西草藥基原品種和質(zhì)量尚不明確,導(dǎo)致藥材的使用和開發(fā)受到一定的限制,因此有必要對其進(jìn)行品種整理和品質(zhì)評價。近年來DNA條形碼鑒定已成為生物分類學(xué)和物種鑒定的熱點之一[3],在藥用植物種質(zhì)資源研究中的應(yīng)用與成果已經(jīng)被國內(nèi)外學(xué)者所肯定[4]。本文報道運用課題組建立的DNA條形碼—產(chǎn)地—形態(tài)聯(lián)用分析方法和高效液相色譜技術(shù)(high performance liquid chromatography, HPLC)對巴西草藥牛蒡進(jìn)行品種鑒定和質(zhì)量研究,以期為巴西草藥的品種整理和合理應(yīng)用,亦為進(jìn)一步開發(fā)和擴(kuò)大藥用植物資源和促進(jìn)中醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展提供支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

巴西草藥牛蒡(巴西名BARDANA)3份,每份約200 g,2012年4月購自巴西隆城藥材集散地,樣品的憑證標(biāo)本保存于北京中醫(yī)藥大學(xué)標(biāo)本室。中國牛蒡草(購于北京同仁堂藥店)經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生教授鑒定為菊科植物牛蒡Arctium lappa L.的地上部分。

安捷倫LC 1100液相色譜儀(美國安捷倫科技公司),FW-100粉碎機(jī)(北京中興偉業(yè)儀器有限公司),電子天平sartorius AG BS110S(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司),KQ-300DB型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

牛蒡苷(規(guī)格20 mg,批號為110819-201108,中國藥品生物制品檢定所),甲醇(色譜純,美國Fisher公司),娃哈哈純凈水。

1.2 方法

巴西草藥牛蒡品種鑒定采用DNA條形碼—產(chǎn)地—形態(tài)聯(lián)用鑒定方法[5]。按照2010版《中華人民共和國藥典》(一部)規(guī)定的牛蒡子含量測定項下牛蒡苷的測定方法進(jìn)行含量測定[6],每批樣品平行測定3次,取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 品種鑒定

2.1.1 基于DNA條形碼的鑒定 3份樣品的測序峰圖良好,測序結(jié)果一致,故選取一條序列用于后續(xù)分析。截取ITS片段后,經(jīng)美國國立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫檢索,樣品與菊科牛蒡?qū)貯rctium L.植物相似度最高,相似度范圍為97%～99%,與其他屬相似度均低于97%。因此,該樣品來自菊科牛蒡?qū)僦参?。種的鑒定根據(jù)分子鑒定指標(biāo)(相同物種相似度達(dá)到 97% 以上),牛蒡 Arctium lappa (GU724290.1,99%)、毛頭牛蒡Arctium tomentosum (GQ281034.1,98%)及小牛蒡 Arctium minus (KC603906.1,98%)植物可能為巴西草藥牛蒡的基原,其中最佳鑒定結(jié)果為牛蒡A.lappa。

2.1.2 基于產(chǎn)地分析的鑒定 根據(jù)DNA條形碼鑒定結(jié)果進(jìn)行產(chǎn)地驗證,《Uso Tradicional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos》(《傳統(tǒng)藥用植物和草藥的使用》)中記載A.lappa,并且為藥用植物,進(jìn)一步驗證巴西草藥牛蒡的基原為牛蒡A.lappa。

2.1.3 基于形態(tài)分析的鑒定 本品經(jīng)過加工,葉片完全破碎,握之成團(tuán),可見白色蛛絲狀柔毛黏連。由葉片及少量葉柄組成。上表面多綠色無毛,下表面密被灰白色蛛絲狀絨毛,葉柄空心,較粗壯,具縱溝,微帶紫色,生有微毛。體輕質(zhì)脆,氣微特異,味苦,苦味較重且持久,嚼之有膠狀感,且有細(xì)渣殘留感。不易吸水,浮于水面。見圖1。

制作葉片的顯微橫切片,上表皮細(xì)胞呈長方形,下表皮細(xì)胞較小,呈略扁圓形,大小不一,有較多氣孔與非腺毛。葉組織結(jié)構(gòu)為葉內(nèi)柵欄組織1～2層,海綿組織4～6層,排列疏松。葉內(nèi)可見小型導(dǎo)管。上面主脈不明顯,下面主脈顯著突出,主脈維管束外韌型,韌皮部與木質(zhì)部均近半圓形,維管束類圓形。見圖2～圖3。

粉末深綠色。非腺毛多為多細(xì)胞,基部多個細(xì)胞呈圓柱形漸小,頂端銳尖或多數(shù)一條或分叉形成幾條細(xì)長單細(xì)胞,單細(xì)胞易錯結(jié)成團(tuán);少數(shù)單細(xì)胞,內(nèi)陷,呈倒圓錐形。氣孔不等式,副衛(wèi)細(xì)胞4個,呈花瓣狀圍繞氣孔,表皮細(xì)胞多角形,細(xì)胞壁微呈波狀。葉柄表皮細(xì)胞略顯紫紅色,近長方形。葉主脈處表皮細(xì)胞近長方形或多角形,沿一定方向排列,較整齊。螺紋導(dǎo)管或網(wǎng)紋導(dǎo)管較易見。見圖4。

形態(tài)分析結(jié)果表明,本品與菊科植物牛蒡A. lappa的干燥地上部分的特征相符合。

2.2 質(zhì)量研究

將配制好的牛蒡苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液、中國牛蒡草和巴西牛蒡草樣品溶液在規(guī)定的色譜條件下進(jìn)樣,結(jié)果如圖5。牛蒡苷對照品、中國牛蒡和巴西牛蒡樣品的保留時間分別為5.691分鐘、5.679分鐘和5.841分鐘,均呈現(xiàn)尖峰且基線分離,雜峰少,表明該色譜條件可用于牛蒡苷的定量檢測。

6批中國和巴西牛蒡中牛蒡苷的含量見表1,中國牛蒡草中牛蒡苷的平均含量為3.72%,巴西牛蒡草中牛蒡苷的平均含量為0.28%,可以看出中國牛蒡草中牛蒡苷含量遠(yuǎn)高于巴西。

3 討論

牛蒡是藥食同源的藥用植物之一,具有產(chǎn)量大和產(chǎn)地眾多的特點。除了藥用外,也常作為蔬菜供日常食用,享有“蔬菜之王”的美譽(yù),營養(yǎng)價值極高,在日本可與人參媲美[7]。牛蒡是中國和巴西同時分布的物種,但2010版《中華人民共和國藥典》(一部)規(guī)定菊科植物牛蒡A.lappa的干燥成熟果實作為牛蒡子入藥;巴西則以牛蒡地上部分入藥,與《中華本草》記載牛蒡莖葉入藥相符,能夠清熱除煩、消腫止痛。

藥典中牛蒡子指標(biāo)性成分為牛蒡苷且含量不得少于5%[6]。而牛蒡地上部分則缺少質(zhì)量研究指標(biāo)。本實驗針對巴西牛蒡,購買了中國牛蒡草與其對比,初步研究表明巴西牛蒡草中的牛蒡苷含量遠(yuǎn)低于中國牛蒡草的牛蒡苷含量,且二者均低于藥典牛蒡子標(biāo)準(zhǔn)。有報道牛蒡苷主要存在果實中,綠原酸主要存在于莖葉中[8],因此有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量,挖掘巴西及中國牛蒡草中有效成分及藥理作用等,從而對巴西草藥牛蒡的質(zhì)量研究及臨床使用、擴(kuò)大中藥資源和安全有效用藥提供重要依據(jù)。

[1] 余國莫.巴西的一些民間藥用植物[J].現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué),1991, 8(3):42-43,41.

[2] 許利嘉,肖偉,馬培,等.具開發(fā)前景的南美洲常用草藥簡介[J].現(xiàn)代藥物與臨床,2011,26(2):84-90.

[3] 李美妮,韓蕊蓮,韓建萍,等.大黃與易混偽品土大黃、虎杖原植物的ITS2序列鑒定[J].環(huán)球中醫(yī)藥,2012,5(3):185-189.

[4] Baraket G,Saddoud O,Chatti K,et al.Sequence analysis of the internal transcribed spacers(ITSs)region of the nuclear ribosomal DNA(nrDNA)in fig cultivars(Ficus carica L.)[J].Sci Horticul,2009,120(1):34-40.

[5] 顧選,張曉芹,宋曉娜,等.基于DNA條形碼—產(chǎn)地—形態(tài)聯(lián)用的藥材溯源新方法研究——以黑果枸杞1種偽品為例[J].中國中藥雜志,2014,39(24):4759-4762.

[6] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:66.

[7] 馬耀萍.牛蒡莖葉對豬機(jī)體免疫功能及增重效果的試驗[J].中獸醫(yī)學(xué)雜志,2015,(3):69-70.

[8] 李艷麗,許亮,楊燕云,等.不同采收期及部位牛蒡草中3種有效成分的測定[J].中成藥,2013,35(6):1266-1269.

Research on the source of varieties and high perform ance liquid chromatography of Brazilian herb BARDANA based on a com bined analysis of DNA barcoding-origin-morphology

YU Chun-xia,GUXuan,LI Yan-peng,et al.Henan Province for Drug Evaluation Certification Center,Zhengzhou 450004,China

LIU Chun-sheng,E-mail:max_liucs@263.net

Ob jective To trace the source and study on the content of arctiin of Brazilian herb BARDANA for varieties systematics and pharmacological analysis.M ethods The source of varieties of Brazilian herb BARDANA was identified by a technology combined DNA barcoding,plant geographical origin and morphological features,and the content of arctiin was analyzed by HPLC.Results DNA barcoding preliminarily identified BARDANA belongs to the stretch of Arctium of Compositae with a similarity level of 99%.Geographical and morphological verification further confirmed the aforementioned finding.The content of arctiin in the Brazilian was0.281%,which was significantly lower than the Chinese arctiin(3.72%).Conclusion Brazilian herb BARDANA derives from Arctium lappa L.,and the content of arctiin was very low.

Brazilian herb; BARDANA; Source of varieties; Arctiin

R284

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2015.11.006

2015-08-18)

(本文編輯:蒲曉田)

國家國際科技合作專項(2011DFA31370)

450004 鄭州,河南省藥品審評認(rèn)證中心(余春霞);北京華邈中藥工程技術(shù)開發(fā)中心(顧選);北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院[李妍芃(碩士研究生)、肖瑤、劉春生、馬長華],針灸推拿學(xué)院(趙百孝),養(yǎng)生學(xué)研究所(韓麗)

余春霞(1972-),女,本科,工程師。研究方向:中藥制劑與分析。E-mail:ycxzzh@126.com

劉春生(1964-),博士,教授,博士生導(dǎo)師。研究方向:藥用植物與分子生藥。E-mail:max_liucs@263.net