生物催化2-羥基-4-甲硫基丁腈制備羥基蛋氨酸菌株的篩選及轉(zhuǎn)化過(guò)程的研究

李宗通，金利群

（浙江工業(yè)大學(xué)生物工程研究所，浙江杭州 310014）

生物催化2-羥基-4-甲硫基丁腈制備羥基蛋氨酸菌株的篩選及轉(zhuǎn)化過(guò)程的研究

李宗通，金利群

（浙江工業(yè)大學(xué)生物工程研究所，浙江杭州 310014）

篩選得到一株產(chǎn)腈水解酶的基因工程菌株（ZJB12048），在優(yōu)化的轉(zhuǎn)化條件下（反應(yīng)溫度50°C，反應(yīng)體系pH值7.0（100 mmol/L檸檬酸/檸檬酸鈉緩沖溶液），濕菌體濃度為0.02 g/ mL，底物濃度為150 mmol/L），其靜息細(xì)胞對(duì)2-羥基-4-甲硫基丁腈具有較高的催化活力。高效液相色譜（HPLC）、液相-質(zhì)譜（LC-MS）和核磁共振（NMR）分析結(jié)果表明，反應(yīng)液中的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為羥基蛋氨酸（2-羥基-4-甲硫基丁酸）。

篩選；2-羥基-4-甲硫基丁腈；腈水解酶；2-羥基-4-甲硫基丁酸；鑒定

羥基蛋氨酸化學(xué)名為2-羥基-4-甲硫基丁酸（2-hydroxy-4-（methylthiol）butanoic acid，HMB），又稱(chēng)為蛋氨酸羥基類(lèi)似物，是一種蛋氨酸的類(lèi)似物替代品。蛋氨酸羥基類(lèi)似物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式和蛋氨酸除了第二個(gè)碳原子上的基團(tuán)不同外，其他部分完全相同，即HMB上是一個(gè)羥基代替了蛋氨酸上的氨基。研究表明，在動(dòng)物體內(nèi)等量蛋氨酸與羥基蛋氨酸具有相同的生物效價(jià)，此外羥基蛋氨酸還表現(xiàn)出一些特有的性質(zhì)，如良好的抑菌效果，增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體免疫及抗氧化能力，有效減緩熱應(yīng)激反應(yīng)的損害及良好的過(guò)瘤胃效果等[1-5]。因此，HMB作為一種性能優(yōu)越的蛋氨酸源被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物飼料營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)業(yè)。

20世紀(jì)80年代，美國(guó)孟山都公司以化學(xué)合成蛋氨酸的過(guò)程中產(chǎn)生的中間體2-羥基-4-甲硫基丁腈為原料經(jīng)過(guò)兩步水解得到HMB[6-7]。在此之后，許多學(xué)者研究不同方法水解2-羥基-4-甲硫基丁腈制備HMB[8-9]?；瘜W(xué)合成HMB反應(yīng)條件比較嚴(yán)苛，對(duì)設(shè)備要求較高，使用大量有機(jī)溶劑且產(chǎn)生副產(chǎn)物，對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重。相對(duì)而言，利用微生物產(chǎn)生的腈水解酶催化2-羥基-4-甲硫基丁腈水解制備HMB的工藝過(guò)程簡(jiǎn)單、副產(chǎn)物少、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境污染小，具有很廣闊的發(fā)展空間[10-12]。羅納-普朗克動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)素公司報(bào)道使用固定化腈水解酶作為生物催化劑催化2-羥基-4-甲硫基丁腈制備2-羥基-4-甲硫基丁酸或其銨鹽，收率高，不使用有機(jī)溶劑且不產(chǎn)生無(wú)機(jī)鹽，可實(shí)現(xiàn)工業(yè)規(guī)?；a(chǎn)[13]。

本研究以實(shí)驗(yàn)室保藏的產(chǎn)腈水解酶菌株為基礎(chǔ)，篩選出具有較高催化活力的腈水解酶產(chǎn)生菌，用于催化水解2-羥基-4-甲硫基丁腈制備HMB，并對(duì)其轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了研究，為生物催化制備羥基蛋氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 試劑

羥基蛋氨酸標(biāo)樣購(gòu)自百靈威科技；2-羥基-4-甲硫基丁腈由實(shí)驗(yàn)室合成；其他試劑均為市售分析純。

1.1.2 菌種

腈水解酶產(chǎn)生菌從實(shí)驗(yàn)室保藏的野生型菌株及構(gòu)建的一系列重組菌中篩選。

1.1.3 培養(yǎng)基

野生型菌株：

1）種子/發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖10.0，谷氨酸鈉10.0，酵母粉3.0，己內(nèi)酰胺1.0，KH2PO40.75，K2HPO4·3H2O 0.75，MgSO4·7H2O 0.5，pH 7.0，115°C下滅菌30 min。

2）斜面/平板培養(yǎng)基（g/L）：牛肉膏5.0，蛋白胨10.0，NaCl 5.0，pH 7.0，115°C下滅菌30 min。

基因工程菌株：

1）Luria-Bertani培養(yǎng)基（g/L）：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl，pH 7.0，121°C下滅菌20 min。

2）斜面/平板培養(yǎng)基是在液體Luria-Bertani培養(yǎng)基中加入1.5%～2.0%的瓊脂。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種的培養(yǎng)

野生菌的培養(yǎng)：從斜面培養(yǎng)基上挑取一環(huán)菌體接入50 mL的LB液體培養(yǎng)基中，置于30°C、150 r/min條件下培養(yǎng)20 h作為種子液，按2%接種量接種至新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C、150 r/ min條件下培養(yǎng)48 h，9000 r/min下離心10 min收集菌體，用生理鹽水清洗兩次，冷凍保藏備用。

工程菌的培養(yǎng)：將工程菌接種至50 mL含50 μg/mL卡那霉素（Kan）的LB液體培養(yǎng)基中，37°C、150 r/min條件下培養(yǎng)10～12 h，2%接種量轉(zhuǎn)接至新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37°C、150 r/min條件下培養(yǎng)至菌體濃度OD600約為0.6～0.8，加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG，28°C、150 r/min條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)10 h。誘導(dǎo)結(jié)束后9000 r/min下離心10 min收集菌體，用生理鹽水清洗兩次，冷凍保藏備用。

1.2.2 菌株轉(zhuǎn)化活力的測(cè)定

靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化：取濕重為0.1 g野生菌或工程菌的菌體，用10 mL純水重懸菌體，置于轉(zhuǎn)化瓶中，加入終濃度為10 mmol/L的2-羥基-4-甲硫基丁腈，40°C、180 r/min條件下反應(yīng)，定時(shí)取樣，加HCl終止反應(yīng)，離心去除沉淀，檢測(cè)上清中產(chǎn)物濃度。

1.2.3 羥基蛋氨酸的定量分析方法

羥基蛋氨酸的定量分析采用HPLC檢測(cè)法。HPLC分析檢測(cè)條件：C18高效液相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，J&K Scientific Ltd.），流動(dòng)相采用20∶80∶0.05的乙腈∶水∶三氟乙酸（TFA），流速為1.0 mL/min，柱溫設(shè)置為40°C，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，進(jìn)樣量為20 μL。進(jìn)樣前使用0.22 μm微孔濾膜對(duì)樣品溶液進(jìn)行除雜處理。

1.2.4 轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化

在菌株篩選過(guò)程中，轉(zhuǎn)化條件為：反應(yīng)溫度40°C，純水反應(yīng)體系，0.01 g/mL的菌體添加量，底物濃度為10 mmol/L。在原有轉(zhuǎn)化條件的基礎(chǔ)上，采用單因素試驗(yàn)分別對(duì)反應(yīng)溫度、pH值、反應(yīng)體系溶劑、菌體添加量及底物濃度等條件進(jìn)行優(yōu)化。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)腈水解酶菌株篩選

從實(shí)驗(yàn)室保藏的可以產(chǎn)腈水解酶的119株野生型菌株及30株基因工程菌株中，篩選能將2-羥基-4-甲硫基丁腈轉(zhuǎn)化為2-羥基-4-甲硫基丁酸的菌株。根據(jù)活力測(cè)定的結(jié)果，共有21株野生型菌株和10株工程菌能夠?qū)?-羥基-4-甲硫基丁腈轉(zhuǎn)化為2-羥基-4-甲硫基丁酸（部分結(jié)果見(jiàn)表1）。其中野生型菌株與基因工程菌的催化能力差別很大，前者的催化能力基本都偏低（表1）。編號(hào)為ZJB12048的基因工程菌對(duì)2-羥基-4-甲硫基丁腈的活力最高，在40°C條件下反應(yīng)25 min轉(zhuǎn)化率可達(dá)100%。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇編號(hào)為ZJB12048的基因工程菌作為2-羥基-4-甲硫基丁腈轉(zhuǎn)化為2-羥基-4-甲硫基丁酸的生物催化劑。

表1 產(chǎn)腈水解酶菌株的篩選

2.2 靜息細(xì)胞催化條件的優(yōu)化

2.2.1 反應(yīng)溫度對(duì)催化反應(yīng)的影響

考察了反應(yīng)溫度對(duì)水解反應(yīng)的影響，將反應(yīng)體系置于不同溫度（35～80°C）中保溫10 min后，加入20 mmol/L底物（2-羥基-4-甲硫基丁腈）進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)3 min取樣終止反應(yīng)，測(cè)定反應(yīng)初速率，結(jié)果見(jiàn)圖1（a）。在溫度范圍為35～65°C時(shí)，隨著溫度的升高，反應(yīng)的初始速率也逐漸升高；當(dāng)溫度高于65°C時(shí)，反應(yīng)初始速率隨著溫度的升高急劇下降，酶活力出現(xiàn)明顯的損失，酶分子開(kāi)始明顯的變性。

同時(shí)實(shí)驗(yàn)考察了該腈水解酶的熱穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)圖1（b）。根據(jù)熱穩(wěn)定性計(jì)算出在50、55、60、65和70°C條件下的失活常數(shù)分別為-0.01544、-0.03696、-0.04456、-0.12070和-0.31616，并計(jì)算出各溫度下相對(duì)應(yīng)的半衰期分別為44.9、18.8、15.2、5.7和2.2 h。綜合考慮溫度對(duì)催化反應(yīng)的影響和腈水解酶熱穩(wěn)定性的結(jié)果，選擇50°C作為后續(xù)試驗(yàn)的反應(yīng)溫度。

圖1 溫度對(duì)催化反應(yīng)的影響（a）與腈水解酶的熱穩(wěn)定性（b）

2.2.2 反應(yīng)體系pH值對(duì)催化反應(yīng)的影響

50°C條件下，在三種不同緩沖溶液中考察了不同pH值對(duì)反應(yīng)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。在近中性反應(yīng)條件下，催化反應(yīng)具有較好的反應(yīng)速率；在偏酸性（＜6）或偏堿性（＞8）環(huán)境中，催化活力迅速下降。在檸檬酸/檸檬酸鈉緩沖溶液pH 7.0時(shí)，該菌株具有最好的催化效果。

圖2 反應(yīng)pH值對(duì)催化反應(yīng)的影響

2.2.3 靜息細(xì)胞添加量對(duì)催化反應(yīng)的影響

微生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中，反應(yīng)體系中靜息細(xì)胞的添加量會(huì)影響催化反應(yīng)的速率。由圖3結(jié)果可見(jiàn)，隨著反應(yīng)體系中靜息細(xì)胞濃度的持續(xù)增加，細(xì)胞的催化反應(yīng)速率不斷增加，而相對(duì)酶活隨著靜息細(xì)胞濃度的增加而呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，說(shuō)明靜息細(xì)胞不斷增加會(huì)出現(xiàn)催化劑飽和現(xiàn)象而無(wú)法參與催化反應(yīng)。綜合考慮催化效率及催化劑的有效利用，選擇20 g/L的靜息細(xì)胞濃度為最適濃度。

圖3 靜息細(xì)胞添加量對(duì)催化反應(yīng)的影響

2.2.4 底物濃度對(duì)催化反應(yīng)的影響

酶的活性中心會(huì)在底物達(dá)到一定濃度時(shí)趨于飽和，此時(shí)酶的催化效率最高；隨著底物濃度的不斷增加，底物會(huì)對(duì)酶產(chǎn)生一定的抑制作用。此外，腈類(lèi)化合物有一定的毒性，高濃度對(duì)菌體的催化能力有一定的影響，因此對(duì)底物的添加量進(jìn)行了考察，測(cè)定反應(yīng)速率及最終反應(yīng)的產(chǎn)率，結(jié)果如圖4。當(dāng)濃度在0～150 mmol/L范圍內(nèi)時(shí)，隨著底物濃度增加，催化活力不斷增強(qiáng)，反應(yīng)初速率不斷增大，反應(yīng)最終的產(chǎn)率可以達(dá)到100%；而當(dāng)?shù)孜餄舛瘸^(guò)150 mmol/L時(shí)，催化反應(yīng)速率開(kāi)始下降，反應(yīng)的最終產(chǎn)率逐漸下降，底物不能夠完全被轉(zhuǎn)化，說(shuō)明底物對(duì)酶產(chǎn)生了抑制。

圖4 底物濃度對(duì)反應(yīng)的影響

2.3 反應(yīng)產(chǎn)物的鑒定

采用高效液相色譜（HPLC）分析產(chǎn)物標(biāo)樣及催化反應(yīng)產(chǎn)物，結(jié)果見(jiàn)圖5。其中，1號(hào)譜線是2-羥基-4-甲硫基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液的分析結(jié)果，2號(hào)譜線為催化反應(yīng)液的色譜分析結(jié)果。1號(hào)譜線中保留時(shí)間5.233 min處的色譜峰為2-羥基-4-甲硫基丁酸色譜峰，在2號(hào)譜線的5.235 min保留時(shí)間處有較大峰面積的色譜峰。對(duì)比產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品與催化反應(yīng)液的色譜圖，可初步確定5.235 min的色譜峰是產(chǎn)物2-羥基-4-甲硫基丁酸的色譜峰。

圖5 高效液相色譜分析圖

利用液相-質(zhì)譜（LC-MS）分析方法對(duì)圖5中初步確定的目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行分子量的測(cè)定（圖6）。m/z=149.0是M-H峰，與羥基蛋氨酸的分子離子峰匹配。

圖6 目標(biāo)產(chǎn)物的LC-MS分析結(jié)果

利用核磁共振氫譜分析了目標(biāo)產(chǎn)物，結(jié)果如圖7。該產(chǎn)物的1H NMR的數(shù)據(jù)為：1H NMR（500 MHz,D2O）：δ4.29（dd，J=8.1，4.1 Hz，1H），2.58-2.54（m，2H），2.06-1.98（m，4H），1.90（ddd，J= 16.7，11.1，7.0 Hz，1H）。

綜合液相色譜、質(zhì)譜和核磁共振氫譜的分析結(jié)果，可以確定反應(yīng)液中的產(chǎn)物及萃取液中的物質(zhì)確為2-羥基-4-甲硫基丁酸。

圖7 目標(biāo)產(chǎn)物核磁共振（1H NMR）分析譜圖

3 結(jié)語(yǔ)

本文篩選得到21野生型菌株和10株工程菌株能以2-羥基-4-甲硫基丁腈為底物轉(zhuǎn)化為2-羥基-4-甲硫基丁酸。其中，編號(hào)為ZJB12048的工程菌的活力最高。對(duì)反應(yīng)溫度，熱穩(wěn)定性，體系pH值，催化劑濃度等轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了優(yōu)化。優(yōu)化后的反應(yīng)條件為：反應(yīng)溫度50°C，pH值7.0，催化劑濃度0.02 g/mL，底物濃度150 mmol/L。優(yōu)化后反應(yīng)速率由534.11 μmol·min-1·g-1DCW提高為1346.06 μmol·min-1·g-1DCW，共提高2.52倍。該菌株對(duì)2-羥基-4-甲硫基丁腈具有良好的催化效果。

利用HPLC、LC-MS和1H NMR對(duì)反應(yīng)液中的產(chǎn)物進(jìn)行分析鑒定，結(jié)果顯示反應(yīng)液中的產(chǎn)物確實(shí)是2-羥基-4-甲硫基丁酸。該菌株對(duì)2-羥基-4-甲硫基丁腈具有良好的催化效果。微生物催化劑不能連續(xù)重復(fù)使用，不能滿(mǎn)足實(shí)際中的應(yīng)用，但可以通過(guò)固定化和設(shè)計(jì)連續(xù)催化工藝來(lái)解決，相關(guān)工作正在進(jìn)行中。

[1]張萍.“最廉價(jià)”的過(guò)瘤胃蛋氨酸——蛋氨酸羥基類(lèi)似物（MHA）[J].乳業(yè)科學(xué)與技術(shù)，2001（2）：35-36.

[2]MURPHY K G,BLOOM S R.Gut hormones and the regulation of energy homeostasis[J].Nature,2006,444（7121）:854-859.

[3]王之盛，崔芹，劉永剛，等.蛋氨酸羥基類(lèi)似物的抑菌和酸化劑效果研究[J].中國(guó)畜牧雜志，2006，42（13）：20-22.

[4]TANG Xue,YANG Yonglan,SHI Yonghui,et al.Comparative in vivo antioxidant capacity of DL-2-hydroxy-4-methylthiobutanoic acid（HMTBA）and DL-methionine in male mice fed a high-fat diet[J].Journal of the Science of Food and Agriculture, 2011,91（12）:2166-2172.

[5]聶偉，咼于明，楊鷹.蛋氨酸與蛋氨酸羥基類(lèi)似物在蛋雞日糧中應(yīng)用效果研究[J].中國(guó)畜牧雜志，2007，43（9）：22-24.

[6]RUEST,DENNIS A,TAKANO,et al.Liquid 2-hydroxy-4-methlythiobutyric acid and process for the preparation thereof: USP,4524077[P].1985.

[7]GRENDEL,ROBERT W,KLOPFENSTEIN,et al.Regeneration of sulfuric acid from sulfate by-products of 2-hydroxy-4-（methylthio）butyric acid manufacture:USP,5498790A[P].1993.

[8]WEIGEL,RODENBACH H,WECKBECKER,et al.Process for producing of 2-hydroxy-4-mehtylthiobutyric acid ammonium salt:USP,2006/0178529A1[P].2006.

[9]MATSUOKA,KAZUYUKI.Process for producing 2-hydroxy-4-methylthiobutyric acid:USP,5386056[P].1985.

[10]婁文勇，宗敏華，劉森林.微生物酶催化腈水解反應(yīng)的研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報(bào)，2001，28（6）：76-81.

[11]徐建妙，鄭裕國(guó)，沈寅初.腈水解酶的來(lái)源、結(jié)構(gòu)、作用機(jī)制及其應(yīng)用[J].微生物學(xué)通報(bào)，2005，32（5）：141-146.

[12]鄭裕國(guó)，薛亞平，柳志強(qiáng)，等.腈轉(zhuǎn)化酶在精細(xì)化學(xué)品生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].生物工程學(xué)報(bào)，2009（12）：1795-1807.

[13]BULLE,OLIVIER F,PIERRARD,et al.Industrial scale process for the preparation of 2-hydroxy-4-methylbutyric acid using a nitrilase:USP:6180359B1[P].2001.

（責(zé)任編輯：朱小惠）

Screening and biotransformation optimization of a strain catalyzing 2-hydroxy-4-(methylthio) butyronitrile to methionine hydroxy analogue

LI Zongtong,JIN Liqun
（Institute of Bioengineering,Zhejiang University of Technology,Hangzhou 310014,China）

ZJB12048,a nitrilase-producing genetic engineering strain,was isolated.Under the optimized transformation conditions as followed,reaction temperature 50°C,initial pH value 7.0 （100 mmol/L citric acid/sodium citrate buffer solution）,concentration of wet cells 0.02 g/mL and the concentration of substrates 150 mmol/L,2-hydroxy-4-（methylthio）butyronitrile were transferred into methionine hydroxy analogue by the rested cells.And the obtained product was identified as 2-hydroxy-4-（methylthio）butyric acid using HPLC,LC-MS and1H NMR.

screening;2-hydroxy-4-（methylthio）butyronitrile;2-hydroxy-4-（methylthio）butyric acid;nitrilase;identification

TQ925

A

1674-2214（2015）02-0007-05

2014-05-06

浙江省自然科學(xué)基金基礎(chǔ)青年項(xiàng)目（20110208）

李宗通（1987—），男，河南焦作人，碩士，研究方向?yàn)樯锎呋c生物轉(zhuǎn)化，E-mail：lizongtong_1987@126.com.