張紅飛，林進南，連子龍，翁楊微，楊斌

（1.福建和泉生物科技有限公司，福建 建陽 354200；2.福建省建陽武夷味精有限公司，福建 建陽 354200）

HPLC法測定霉酚酸有關(guān)物質(zhì)及流動相pH值的確定

張紅飛1，林進南1，連子龍1，翁楊微1，楊斌2

（1.福建和泉生物科技有限公司，福建 建陽 354200；2.福建省建陽武夷味精有限公司，福建 建陽 354200）

為確定HPLC法測定霉酚酸有關(guān)物質(zhì)所用流動相的合理pH值，配制pH值為4.5和5.5的流動相，采用Kromasil C18色譜柱（4.6 mm×200 mm，5μm×100A）對霉酚酸進行有關(guān)物質(zhì)的測定，對于同一個樣品連續(xù)進樣6次，按照面積歸一化法進行計算，以霉酚酸百分含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD%）來確定流動相的合理pH值。結(jié)果顯示采用pH值為4.5的流動相進行霉酚酸有關(guān)物質(zhì)的HPLC測定，其測定結(jié)果穩(wěn)定性好、靈敏度高、重現(xiàn)性好，可用于霉酚酸有關(guān)物質(zhì)的測定。

HPLC；霉酚酸；有關(guān)物質(zhì)；流動相pH值

霉酚酸（mycophenolic acid，MPA）是次黃嘌呤單核苷酸脫氫酶（IMPDH）的抑制劑，能夠抑制鳥嘌呤核苷酸的合成途徑［1］。其酯類衍生物霉酚酸酯（mycophenolatemofetil，MMF）被人體服用后會被血漿酯酶水解為具有活性的霉酚酸［2］，大大提高了霉酚酸的利用程度。

國內(nèi)已有較多采用HPLC對血漿中霉酚酸濃度和相關(guān)代謝產(chǎn)物的檢測方法［2-4］，關(guān)于霉酚酸原料有關(guān)物質(zhì)的檢測，也有文獻進行了專門報道［1，5-6］。關(guān)于霉酚酸原料有關(guān)物質(zhì)的檢測，文獻中使用的色譜柱大部分為C8色譜柱，且流動相的pH值調(diào)節(jié)均為混合前，而對于混合后的流動相最終pH值未見報道。本文在建立原料藥霉酚酸有關(guān)物質(zhì)的檢測方法時，使用的是C18色譜柱，最初也采取流動相混合前調(diào)節(jié)pH值的方法，但在穩(wěn)定性考察中發(fā)現(xiàn)霉酚酸有關(guān)物質(zhì)中的最大單一雜質(zhì)峰極不穩(wěn)定。我們之后采取流動相先混合再調(diào)節(jié)pH值的方法，使用同樣的色譜條件，連續(xù)進樣6次，霉酚酸有關(guān)物質(zhì)中的最大單一雜質(zhì)峰穩(wěn)定。本文采用流動相混合后再調(diào)節(jié)pH值的方法對霉酚酸進行有關(guān)物質(zhì)的檢測，建立了霉酚酸有關(guān)物質(zhì)的HPLC測定方法，可同時測定總雜質(zhì)和最大單雜，為霉酚酸原料的質(zhì)量控制建立標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

高效液相色譜儀：Agilent 1260，包括四元梯度泵、自動進樣器、原裝柱溫箱、紫外檢測器、Agilent Chem Station化學(xué)工作站；XS105DU梅特勒分析天平（感量0.01mg）。

1.1.2 樣品與試劑

霉酚酸樣品由本公司提供（批號：1405003、1405004、1405005）；乙腈為色譜純（默克公司）；乙酸銨、冰乙酸均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

流動相：0.01 mol/L乙酸銨溶液-乙腈（V（乙酸銨溶液）∶V（乙腈）=45∶55），混合后使用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值為4.5；進樣量：20μL；檢測波長：249 nm；柱溫：25°C；流速：1.0mL/min。色譜柱采用瑞典EKA Chemicals公司原裝Kromasil高效液相色譜柱（4.6 mm×200 mm，5μm×100A，C18)。

1.2.2 供試品溶液的制備

稱取供試品約20mg，精密稱定，置于50mL容量瓶中，用流動相溶解后定容至刻度，制成每1 mL中約含0.4mg供試品的溶液。

1.3 流動相pH值對供試品穩(wěn)定性影響實驗

為了分析流動相的pH值對供試品穩(wěn)定性的影響，在試驗的過程中，我們按照上述色譜條件及配制的供試品溶液進行測定，僅改變?nèi)芙夤┰嚻酚昧鲃酉嗪头治鲞^程使用流動相的pH值，每一種方案平行進樣6次。

2 結(jié)果與討論

2.1 霉酚酸的色譜圖

用本色譜系統(tǒng)檢測霉酚酸有關(guān)物質(zhì)，色譜圖如圖1所示。各雜質(zhì)峰均能與霉酚酸主峰達到良好的分離。試驗表明配制后的供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定，可用于霉酚酸有關(guān)物質(zhì)的檢測。

圖1 試驗色譜圖

2.2 流動相pH值對供試品穩(wěn)定性影響

根據(jù)1.3中的實驗設(shè)計方案，每一種方案平行進樣6次，測得的具體結(jié)果見表2。

表2 流動相pH值對供試品穩(wěn)定性影響實驗結(jié)果

通過表2數(shù)據(jù)可以得出如下結(jié)論：流動相的pH值僅對其雜質(zhì)峰的穩(wěn)定性有影響，對于霉酚酸主峰的穩(wěn)定性沒有影響。所以我們最終確定所用流動相的pH值為4.5。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性試驗

稱取霉酚酸適量，用流動相制成濃度為1 620 μg/mL的溶液，分別精密量取溶液5.0、4.0、3.0、2.0、1.0mL置于10mL的容量瓶內(nèi)，用流動相稀釋定容至刻度，搖勻，得到濃度分別為810、648、486、324、162μg/mL的溶液。分別進樣20μL，記錄色譜圖。由溶液濃度對霉酚酸色譜峰的峰面積進行線性回歸，實驗表明，其線性關(guān)系良好（R2= 0.9998）。霉酚酸在濃度162～810μg/mL范圍內(nèi)，其線性關(guān)系良好。

圖2 線性回歸圖

2.3.2 精密度

取配制好的霉酚酸供試品溶液。按上述色譜條件連續(xù)進樣6次，以霉酚酸峰面積計算，RSD為0.17%；以有關(guān)物質(zhì)中的最大雜質(zhì)峰面積計算，RSD為0.68%。

2.3.3 重復(fù)性試驗

取同一批號的霉酚酸樣品適量，平行稱取6份，用流動相分別配制成濃度為0.4mg/mL的供試品溶液，搖勻。按上述色譜條件測定，按面積歸一化法計算，霉酚酸含量的RSD為0.20%；最大單雜含量分別為0.30%、0.30%、0.29%、0.29%、0.29%、0.29%，RSD%為1.76%。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗

取上述2.3.2項下的供試品溶液1份，分別在0、3、6、9、12 h按上述色譜條件進行測定，以霉酚酸峰面積計算，RSD為0.52%；以有關(guān)物質(zhì)中的最大雜質(zhì)峰面積計算，RSD為0.72%。結(jié)果表明，供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

3 結(jié)論

HPLC法測定霉酚酸有關(guān)物質(zhì)的過程中，供試品溶液的穩(wěn)定性至關(guān)重要，不僅要求霉酚酸主峰的峰面積穩(wěn)定，各雜質(zhì)峰的峰面積也要穩(wěn)定，方能確保使用面積歸一化法計算其有關(guān)物質(zhì)含量的準(zhǔn)確性。筆者在建立本方法時發(fā)現(xiàn)，采用傳統(tǒng)的混合前調(diào)節(jié)流動相pH值的方法，測定過程中最大單雜及總雜極不穩(wěn)定。關(guān)于霉酚酸供試品溶液的穩(wěn)定性問題，相關(guān)文獻中也有描述，認(rèn)為其在氧化、高溫及光破壞均不穩(wěn)定［5］。

本研究在建立霉酚酸有關(guān)物質(zhì)的HPLC測定方法時，通過對比分析溶解供試品用流動相的pH值和分析過程使用流動相的pH值，發(fā)現(xiàn)在使用該方法進行霉酚酸有關(guān)物質(zhì)的測定時，流動相的pH值是影響其穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素。通過研究發(fā)現(xiàn)，使用混合后pH值為4.5的流動相進行供試品溶液的配制及過程分析，供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定，可用于霉酚酸有關(guān)物質(zhì)的測定。

經(jīng)過方法學(xué)驗證該方法穩(wěn)定性強、靈敏度高、重現(xiàn)性好、用于測定的供試品溶液的濃度范圍廣，適合于霉酚酸原料的有關(guān)物質(zhì)的測定。

［1］劉勝興，林芹.高效液相色譜法測定霉酚酸含量及有關(guān)物質(zhì)［J］.中外醫(yī)療，2010，29(27)：61.

［2］宋洪杰，張黎明，胡晉紅，等.高效液相色譜法同時測定人血漿中霉酚酸及其葡糖苷酸［J］.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2002，23(4)：400-402.

［3］師少軍，李忠芳，萬元勝，等.HPLC法測定人血漿中霉酚酸的濃度及藥動學(xué)研究［J］.中國藥房，2007，18(20)：1558-1560.

［4］宋青，張華峰，戴博，等.高效液相色譜法測定人血漿中霉酚酸的濃度［J］.解放軍藥學(xué)學(xué)報.2011，27(3)：241-243.

［5］蔣順進，黃煒乾，凌波.高效液相色譜法測定MPA含量及有關(guān)物質(zhì)［J］.醫(yī)學(xué)信息（中旬刊），2010，05(7)：1948-1949.

［6］韓四忠.HPLC法同時測定霉酚酸及其代謝產(chǎn)物的方法學(xué)研究［J］.安徽醫(yī)藥，2013，17(12)：2033-2036.

（責(zé)任編輯：朱小惠）

Determ ination ofm ycophenolic acid related substances by HPLC and optim ization of pH ofmobile phrase

ZHANG Hongfei1，LIN Jinnan1，LIAN Zilong1，WENG Yangwei1，YANG Bin2
(1.Fujian Hequan Biotechnology Co.，Ltd.，Jianyang 354200，China；2.Fujian Province JianyangWuyiMSG Co.，Ltd.，Jianyang 354200，China)

Mycophenolic acid related substance was analyzed by HPLC equipped with Kromasil C18chromatogram column(4.6mm×200mm，5μm×100A)and the reasonable pH ofmobile phase was determined.The same sample was analyzed for 6 times and determined according to area normalization method.The optimal pH ofmobile phrase was determined on the basis of relative standard deviation(RSD%)ofmycophenolic acid percentage.Themethod showed good stability，high sensitivity and good reproducibility when the pH value of themobile phrase was 4.5.

HPLC；mycophenolic acid；related substances；pH ofmobile phase

TQ46

A

1674-2214(2015)04-0048-03

2015-06-04

張紅飛（1983—），男，河南湯陰人，執(zhí)業(yè)藥師，主要從事質(zhì)量管理工作，E-mail：zhf108@163.com.