高產安絲菌素的珍貴束絲放線菌菌種選育

張金龍，李芳

（天津永安職業(yè)健康檢測評價有限公司，天津，300457）

高產安絲菌素的珍貴束絲放線菌菌種選育

張金龍，李芳

（天津永安職業(yè)健康檢測評價有限公司，天津，300457）

以珍貴束絲放線菌FRCS-025為出發(fā)菌株，采用常壓室溫等離子體（ARTP）誘變技術對其孢子進行處理，篩選得到了一株安絲菌素AP-3高產菌株ARTP-054，其產量可達235.16 mg/L，較原始菌株FRCS-025的產量164.12mg/L，提高了43.3%。以篩選出的ARTP-054高產菌為出發(fā)菌株，進行化學誘變，選取濃度為0.4 g/L的亞硝基胍對其孢子懸液進行處理，且使用安絲菌素AP-3支鏈前體異丁醇進行底物限制性篩選，結合發(fā)酵復篩，最終篩得一株安絲菌素AP-3高產菌株HF-064，產量達287.64mg/L，較原始菌株產量提高了75.3%。經(jīng)50 L發(fā)酵罐驗證試驗，發(fā)現(xiàn)誘變后菌株遺傳穩(wěn)定性良好，168 h產量高達292.36mg/L。

安絲菌素；等離子體誘變；化學誘變；亞硝基胍

安絲菌素屬于聚酮類抗生素，是一類以珍貴束絲放線菌為生產菌，通過微生物發(fā)酵獲得的美登醇類衍生物，與美登醇相似，具有抗腫瘤活性。安絲菌素主要由AP-1，AP-2，AP-3，AP-3＇和AP-4共五個組分組成，研究表明AP-3的藥理活性最強［1-2］。

常壓室溫等離子體（ARTP）技術，近些年來在微生物誘變育種領域越來越受關注。該技術本身的溫度低，活性粒子濃度高，且種類多樣，設備簡單，易操作，成本低廉，更重要的是處理微生物菌種時，作用效果明顯，微生物基因組的突變速度快，產生突變的多樣性大［3］。

化學誘變是利用化學試劑來處理微生物細胞群，使染色體斷裂、基因重組或堿基置換，從而使后代發(fā)生變異?；瘜W誘變操作簡單，不易發(fā)生回復突變，是生產實踐或科研常用的篩菌技術［4］。

安絲菌素獨特的抗癌特性，使其具備較高的社會和經(jīng)濟效益，國內各大醫(yī)藥及科研機構都在競先搶占市場。目前關于安絲菌素的研究報道比較多，包括培養(yǎng)基優(yōu)化、發(fā)酵連續(xù)培養(yǎng)、補料培養(yǎng)等［5-6］。本研究以珍貴束絲放線菌FRCS-25為出發(fā)菌株，將常壓室溫等離子體誘變和化學試劑亞硝基胍應用于安絲菌素菌株的選育中，從而獲得高產菌株，并進行了50 L發(fā)酵實驗驗證。

1 材料和方法

1.1 菌株

珍貴束絲放線菌FRCS-25，由天津永安職業(yè)健康檢測評價有限公司保存。

1.2 培養(yǎng)基

斜面及平板培養(yǎng)基（g/L）：瓊脂20，酵母浸提物10，牛肉浸膏10，葡萄糖5，甘油10，氯化鈉3，pH 7.4，121℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基（g/L）：酵母浸提物10，葡萄糖5，甘油10，pH 7.4，121℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：酵母浸提物10，牛肉浸膏10，葡萄糖10，甘油15，MgSO4·7H2O 0.5，F(xiàn)eSO4· 7H2O 0.01，pH 7.4，121℃滅菌20 min。

1.3 主要試劑

實驗所用異丁醇購自國藥（上海）有限公司。

1.4 分析方法

1.4.1 高效液相色譜法檢測安絲菌素（AP-3）含量［7］

HPLC條件如下，HPLC（島津LC-20AD）；檢測器：紫外檢測器；檢測波長：252 nm；色譜柱SinoChrom ODS-BP（250 mm×4.6 mm，5μm）；柱溫：40℃；V（流動相乙腈）∶V（水）=60∶40；流速：0.8 mL/min；進樣量：40μL。

1.4.2 pH檢測

使用梅特勒pH計進行檢測。

1.5 菌株等離子體誘變處理

1.5.1 誘變處理流程

原始菌株孢子懸液制備→誘變（ARTP）→觀察菌落形態(tài)進行初篩→復篩（根據(jù)發(fā)酵AP-3產量）→斜面保藏，穩(wěn)定性考察→ARTP誘變高產菌株孢子懸液制備→異丁醇底物耐受菌株初篩→發(fā)酵復篩→斜面保藏，穩(wěn)定性考察。

1.5.2 出發(fā)菌株的ARTP誘變

1）單孢子懸液的制備：用接種鏟從菌種斜面表面刮取適量菌種，然后再用帶有紗布和棉花的無菌漏斗過濾，從而獲得單孢子懸浮液，使用無菌鹽水將孢子數(shù)量調整至107～108個/mL。

2）ARTP誘變致死率曲線的制作：采用清華大學研制的常壓室溫等離子體誘變系統(tǒng)（型號：ARTP-IIS），對原始菌株FRCS-25的孢子進行處理。具體操作如下：

首先在圓形鐵片（直徑10 mm）上，加10μL上述單孢子懸液，然后將其置于以氦氣作為工作氣體的誘變系統(tǒng)中。電源功率：110W；工作氣流量：10 L/min；處理距離：2mm；處理時間：0、30、45、60、75、90、105、120、150、180 s。

將上述10個照射時間的孢子懸液使用0.85%的無菌生理鹽水進行梯度稀釋，然后取各照射時間的10-2、10-3、10-4三個稀釋度的孢子懸液0.1mL涂平板，最后將平板置于培養(yǎng)箱中，28℃倒置培養(yǎng)5～7 d。與0 s處理的孢子懸液涂布的平板做對比，以ARTP處理時間為橫坐標，制作致死率曲線。

3）菌株ARTP誘變初篩：選擇致死率大于95%的照射時間，對原始菌株FRCS-25的孢子懸浮液進行處理，然后進行梯度稀釋，取10-2、10-3、10-4三個梯度的孢子懸液進行涂布。在培養(yǎng)箱28℃培養(yǎng)5～7 d，挑選具有特殊形態(tài)的單菌落，轉接斜面保藏，用于復篩。

4）菌株的復篩：取斜面菌株，加入10 mL 0.85%的無菌生理鹽水，將孢子洗下；然后取3 mL孢子液于種子培養(yǎng)基中，28℃、220 r/min培養(yǎng)48～54 h；最后取5mL種子液于發(fā)酵培養(yǎng)基，28℃、220 r/min發(fā)酵7 d。結束后，取新鮮的安絲菌素發(fā)酵液，加入等體積丙酮，振蕩浸提2 h，12 000 r/ min離心10 min，上清液過0.45μm針孔過濾器，用HPLC測定安絲菌素AP-3的含量。將獲得的高產菌株進行斜面保藏。

5）高產菌株的遺傳穩(wěn)定性實驗：將篩選得到的高產菌株連續(xù)轉接6代，每代均進行發(fā)酵，檢測安絲菌素AP-3的產量，進行分析比較，從而檢驗菌株的遺傳性狀是否穩(wěn)定。

1.6 菌株化學誘變處理

對ARTP誘變獲得的高產菌株再進行化學誘變處理，從而達到使用復合誘變手段獲得高產安絲菌素AP-3的菌株。

1.6.1 化學誘變致死率曲線繪制

1）按照1.5.2制作孢子懸液，然后取20mL分裝于小口試管瓶中；2）配制亞硝基胍母液：按照W（亞硝基胍）∶V（丙酮）=10∶1配制；3）在小口試管中加入不同體積的亞硝基胍母液，使最終亞硝基胍濃度在0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L；4）將上述小口試管置于搖床振蕩40 min，搖床溫度30℃，轉速200 r/min；5）結束后12 000 r/min離心10min獲得孢子，然后使用無菌生理鹽水配制成105～106個/ mL的孢子懸液，取0.1mL進行涂布。在培養(yǎng)箱28℃倒置培養(yǎng)5～7 d，以未經(jīng)亞硝基胍處理的孢子懸浮液涂布的平板作對比繪制致死率曲線。

1.6.2 異丁醇耐受強菌株的篩選

異丁醇是合成安絲菌素AP-3側鏈的前體［8-9］，本實驗在平板培養(yǎng)基上添加不同濃度的異丁醇（30、40、50、60、70、80 mmol/L）進行復合誘變高產安絲菌素AP-3菌株初篩。

1.6.3 化學誘變和復篩

選擇致死率大于95%照射時間，對高產菌株孢子懸浮液進行處理，取10-2、10-3、10-4三個梯度的孢子懸液進行涂布。在培養(yǎng)箱28℃培養(yǎng)10～14 d，挑選單菌落，轉接斜面保藏，用于復篩。

對初篩菌株斜面按照1.5.2部分4）中的方法進行菌株的復篩，并對篩選得到的高產菌株按照1.5.2部分5）中的方法檢驗其遺傳穩(wěn)定性。

1.7 50 L發(fā)酵罐驗證試驗

一級種子培養(yǎng)是在搖床進行：取斜面菌株，加入10mL 0.85%的無菌生理鹽水，將孢子洗下，然后取3 mL孢子液于種子培養(yǎng)基中，28℃、220 r/ min培養(yǎng)48～54 h，鏡檢無染菌則轉接二級。二級種子培養(yǎng)在5 L發(fā)酵罐中進行，接種量10%，溫度28℃，通風比1∶1，溶氧與攪拌聯(lián)動保持DO≥30%，培養(yǎng)30～36 h，鏡檢無染菌則轉接50 L發(fā)酵罐發(fā)酵。50 L發(fā)酵罐裝液量30 L，接種量10%，通風比1∶1，溶氧與攪拌聯(lián)動保持DO≥30%，初始pH 7.4，發(fā)酵過程中不進行調控。

1.8 數(shù)據(jù)處理

每組實驗均作3個平行，并使用spss 16.0和origin 8.5進行分析。

2 結果與討論

2.1 等離子體誘變結果

2.1.1 等離子體誘變的致死率曲線及誘變劑量的選擇

本實驗按照1.5.2中的方法測定了照射0、30、45、60、75、90、105、120、150、180 s的致死率，獲得的致死率曲線如下圖1所示。

圖1 ARTP誘變的致死率曲線

從上圖可以清晰地看出，照射時間為75 s時，致死率就達到90%。一般致死率在90%以上，也是其發(fā)生突變概率最大的時候，所以本實驗選取ARTP誘變時間為75 s，處理后經(jīng)過稀釋涂布，挑選單菌落用于初篩。

2.1.2 菌株的篩選結果

對挑選出來的菌株進行發(fā)酵復篩，以篩選得到安絲菌素AP-3的高產菌，經(jīng)復篩最終獲得一株產量比較高的菌株ARTP-054，其安絲菌素AP-3的產量可達到235.16 mg/L，較出發(fā)菌株FRCS-025的產量164.12mg/L提高了43.3%。

2.1.3 菌株ARTP-054遺傳穩(wěn)定性實驗

珍貴束絲放線菌是典型的束絲放線菌科菌株，可形成帶游動孢子的菌絲體，直徑在0.5～1μm之間。Hasegawa等在1978年就鑒定其為革蘭氏陽性菌，屬于好氧菌，能在15～37℃條件下生長，眾多研究表明其最適溫度是28℃［10-11］。

將篩選出的高產菌株ARTP-054在斜面培養(yǎng)基上連續(xù)轉接6代，其產量均穩(wěn)定在234.12～235.16mg/L，結果見表2，表明該菌株的遺傳性能穩(wěn)定。

表2 ARTP-054遺傳穩(wěn)定性

2.2 化學誘變結果

2.2.1 化學誘變的致死率曲線及誘變劑量的選擇

本研究測定了濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/ L的亞硝基胍對菌株ARTP-039的致死率，致死率曲線如圖2所示

圖2 化學誘變的致死率曲線

從圖2看出，亞硝基胍濃度在0.4 g/L時，致死率就達到了95%，本實驗選取亞硝基胍濃度為0.4 g/L作為化學誘變劑量，處理后稀釋至涂布，挑選單菌落用于初篩。

2.2.2 異丁醇耐受菌株的初篩及化學誘變復篩結果

表3 異丁醇耐受菌株篩選

通過底物異丁醇耐受菌株篩選結果（表3）發(fā)現(xiàn)，異丁醇濃度大于80 mmol/L時，無菌落存在，隨后本實驗對異丁醇濃度在50、60、70 mmol/L時共36株菌進行了發(fā)酵復篩，最終獲得了一株安絲菌素AP-3產量達287.64 mg/L的菌株FH-064，較原始菌株FRCS-025產量提高了75.3%。

2.2.3 遺傳穩(wěn)定性實驗

將篩選出的高產菌株FH-064在斜面培養(yǎng)基上連續(xù)轉接6代，其產量穩(wěn)定在285.23～287.64 mg/L，其結果如表4所示，表明該菌株的遺傳性能穩(wěn)定。

表4 FH-064遺傳穩(wěn)定性

2.3 50 L發(fā)酵罐驗證試驗

取原始菌株和經(jīng)復合誘變后的菌株進行50 L發(fā)酵罐驗證對比實驗，結果如圖3。原始菌株對惡劣環(huán)境耐受能力較差，導致安絲菌素AP-3產量增長緩慢，而經(jīng)過復合誘變后的菌株，則保持較快的產素速度，168 h下罐時產量達（292.36±6.8）mg/L。

圖3 安絲菌素AP-3產量隨時間變化曲線

3 結論

通過ARTP誘變，篩選獲得了一株安絲菌素AP-3高產菌株ARTP-054，其產量可達到235.16 mg/L，較原始菌株FRCS-025的產量164.12 mg/L提高了43.3%。以ARTP誘變獲得高產菌株ARTP-054為出發(fā)菌株，進行化學誘變，并且使用安絲菌素AP-3支鏈前體異丁醇進行底物限制性篩選，并結合發(fā)酵復篩，最終篩得了一株安絲菌素AP-3高產菌株HF-064，產量達287.64 mg/L，較原始菌株FRCS-025產量提高了75.3%，遺傳穩(wěn)定性較好。本研究中提出的對菌株的復合誘變菌種選育思路（即先進行ARTP誘變，然后以篩選出的高產菌進行化學誘變），取得了很好的結果，經(jīng)50 L發(fā)酵罐驗證，其產量穩(wěn)定，且在已報道文獻中安絲菌素AP-3產量較高，這不僅為以后菌株的選育提供了一個思路，也為安絲菌素后續(xù)研究打下夯實的基礎。

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（責任編輯：朱小惠）

表2 廢水副產元明粉過程板式蒸發(fā)結晶裝置與單效管式蒸發(fā)結晶裝置消耗比較結果

3 結語

在我國能源結構調整的背景下，MVR板式蒸發(fā)、結晶裝置將得到長足發(fā)展。發(fā)酵行業(yè)物料多為有機物及有機酸鹽，沸點升高相對較低，熱敏性物質較多，非常適合于MVR板式蒸發(fā)、結晶裝置。然而，發(fā)酵行業(yè)涉及物料成分較為復雜，設備供應商對基礎物性掌握不充分，導致不能夠完全發(fā)揮MVR板式蒸發(fā)裝置的優(yōu)良特性。需要設計單位、系統(tǒng)裝置供應商、用戶共同努力，緊密合作，在基礎物性研究和系統(tǒng)配套上多下功夫，才能將MVR板式蒸發(fā)結晶裝置在發(fā)酵行業(yè)推廣普及。

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（責任編輯：朱小惠）

Breeding of enhanced ansam itocin producing strains of Actinosynnema pretiosum

ZHANG Jinlong，LIFang
(Tianjin Yongan Occupational Health Inspection Co.，Ltd.，Tianjin 300457，China)

The atmospheric pressure plasma at room temperature(ARTP)technology was applied to treat spores of Actinosynnema pretiosum FRCE-025.A high ansamitocin AP-3 producing strain ARTP-054wasobtained and theansamitocin concentration reached 235.16mg/L，whichwasincreased by 43.3%compared with the original strain(164.12 mg/L).Chemical mutagenesis was further carried out on strain ARTP-054.The spores suspension was treated by 0.4 g/L nitrosoguanidine，and isobutanol，the branched chain precursor of ansamitocin AP-3，was used for substrate restrictive screening.Combined with the second-round screening，another highly producing strain HF-064 was finally screened and the yield of ansamitocin reached 287.64 mg/L，which was increased by 75.3%compared with the original strain.The 50 L fermentor test showed that the genetic stability of the mutant strain is good，and the yield of ansamitocin reached 292.36 mg/L after 168 h of fermentation.

ansamitocin；atmospheric pressure plasma；chemicalmutagenesis；nitrosoguanidine

Q819

A

1674-2214(2015)04-0043-05

2015-09-30

張金龍（1989—），男，吉林吉林人，助理工程師，主要從事微生物發(fā)酵相關工作，E-mail：2969752161@qq.com.