韓 長(zhǎng) 志

(西南林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院， 云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 昆明 650224)

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希金斯炭疽菌GPCR蛋白生物信息學(xué)分析

韓 長(zhǎng) 志*

(西南林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院， 云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 昆明 650224)

希金斯炭疽菌可以侵染諸多十字花科植物引起炭疽病，給各國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失.GPCR作為生物體內(nèi)G蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的重要感知蛋白，在信號(hào)傳遞過(guò)程中發(fā)揮著重要作用.本研究基于釀酒酵母中已經(jīng)報(bào)道的3個(gè)典型GPCR序列，利用Blastp以及關(guān)鍵詞對(duì)炭疽菌蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)、搜索，以及通過(guò)TMHMM、HMMTOP跨膜結(jié)構(gòu)域分析，明確該菌存在4個(gè)典型的GPCR；同時(shí)，通過(guò)對(duì)上述氨基酸序列進(jìn)行細(xì)胞信號(hào)肽、亞細(xì)胞定位以及二級(jí)結(jié)構(gòu)等生物信息學(xué)分析，明確上述GPCR均具有較高比例的α螺旋結(jié)構(gòu)以及均不含有明顯的信號(hào)肽序列；在定位方面，4個(gè)GPCR均定位在質(zhì)膜上.此外，通過(guò)對(duì)希金斯炭疽菌中的4個(gè)GPCR與其他物種中的23個(gè)同源序列進(jìn)行遺傳關(guān)系比較分析，發(fā)現(xiàn)該菌中的GPCR與C.graminicola、C.fioriniae等炭疽菌屬中的病菌具有較高的同源序列以及較近的親緣關(guān)系.該研究為深入開(kāi)展希金斯炭疽菌GPCR功能研究打下堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，同時(shí)，也為進(jìn)一步開(kāi)展其他炭疽菌的研究提供重要的理論指導(dǎo).

希金斯炭疽菌； G蛋白偶聯(lián)受體； 信號(hào)肽； 二級(jí)結(jié)構(gòu)； 炭疽菌屬

希金斯炭疽菌(ColletotrichumhigginsanumSacc.)可以侵染諸如小油菜、菜心、羽衣甘藍(lán)、結(jié)球甘藍(lán)、大白菜、蘿卜等多種十字花科蔬菜植物而引起炭疽病[1-2]，是一類重要的世界性植物真菌病害.該菌又稱為希金斯刺盤孢，其主要分布于美國(guó)以及中國(guó)、日本、印度等東南亞國(guó)家[3].在我國(guó)，由該菌侵染菜心引起的炭疽病是菜心上最常見(jiàn)和發(fā)生最嚴(yán)重的病害之一[4].國(guó)內(nèi)外對(duì)該病菌的研究主要集中在病菌的生物學(xué)特性、生防菌篩選以及遺傳轉(zhuǎn)化[5-6]、防治方法[7-8]等方面，隨著該基因組序列的釋放[9]，目前，關(guān)于該菌MAPK途徑蛋白預(yù)測(cè)[10]、致病基因鑒定[11-12]、基因功能[13-14]、分泌蛋白預(yù)測(cè)以及RGS[15]、14-3-3蛋白[16]、磷酸二酯酶[16]、septin[17]等蛋白生物信息學(xué)分析等已見(jiàn)報(bào)道，而關(guān)于G蛋白信號(hào)通路效應(yīng)酶的報(bào)道尚不多見(jiàn).GPCR作為G蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑上接收外源信號(hào)、傳遞信號(hào)重要的表面受體，在植物與病原菌互作過(guò)程中發(fā)揮著諸多重要的作用[18-19].

本研究利用模式生物釀酒酵母SaccharomycescerevisiaeS288c中已經(jīng)報(bào)道的3個(gè)典型GPCR氨基酸序列[20]，通過(guò)在炭疽菌屬蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blastp比對(duì)分析、關(guān)鍵詞搜索，獲得與釀酒酵母GPCR同源的C.higginsianum序列，選擇TMHMM和HMMTOP對(duì)GPCR進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，并通過(guò)理化性質(zhì)、疏水性分析、二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)以及信號(hào)肽、亞細(xì)胞定位等生物信息學(xué)分析，以期明確該菌中所存在的GPCR數(shù)量、理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特征以及定位情況，同時(shí)，基于上述發(fā)現(xiàn)的GPCR氨基酸序列，在美國(guó)國(guó)家生物信息中心(NCBI)在線進(jìn)行同源序列搜索，通過(guò)遺傳關(guān)系分析，以期為進(jìn)一步開(kāi)展同屬于炭疽菌屬但其基因組序列尚未公布的其他炭疽菌的研究提供重要的理論指導(dǎo).

1 材料與方法

1.1 材料

利用關(guān)鍵詞“G-protein coupled receptor”以及“GPCR”等對(duì)炭疽菌屬蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)在線進(jìn)行搜索，同時(shí)，以S.cerevisiaeS288c中3個(gè)GPCR(GCR1、STE2、STE3)蛋白序列為基礎(chǔ)，進(jìn)行Blastp進(jìn)行比對(duì)分析(參數(shù)選擇默認(rèn)).另外，利用NCBI明確該菌中GPCR蛋白質(zhì)登錄號(hào)信息.

1.2 方法

1.2.1 保守結(jié)構(gòu)域及跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 利用SMART網(wǎng)站[21]在線分析GPCR所具有的保守結(jié)構(gòu)域特征.利用TMHMM Server v. 2.0[22]和HMMTOP version 2.0[23]等跨膜網(wǎng)站對(duì)GPCR的跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè).

1.2.2 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析 利用Protscale程序[24]對(duì)GPCR進(jìn)行理化性質(zhì)測(cè)定.

1.2.3 蛋白質(zhì)信號(hào)肽預(yù)測(cè) 利用SignalP 3.0 Server[22]在線分析實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)信號(hào)肽的預(yù)測(cè).

1.2.4 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 采用PHD[25]在線分析實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè).

1.2.5 亞細(xì)胞定位分析 對(duì)GPCR進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，利用ProtComp v9.0實(shí)現(xiàn)(http://linux1.softberry.com/berry.phtml？topic=protcompan&group=programs&subgroup=proloc)，以期獲得蛋白質(zhì)的定位情況.

1.2.6 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建 在NCBI中，以C.higginsianum中GPCR氨基酸序列為基礎(chǔ)，在線進(jìn)行Blastp同源搜索，獲得來(lái)自于不同物種的同源蛋白質(zhì)序列.對(duì)所獲得的同源序列，利用ClustalX[26]進(jìn)行多重比對(duì)分析，隨后利用MEGA 5.2.2軟件[27]構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)：采用鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，各分支之間的距離計(jì)算采用p-distance模型，系統(tǒng)可信度檢測(cè)采用自舉法重復(fù)1 000次進(jìn)行.

2 結(jié)果與分析

2.1 希金斯炭疽菌4個(gè)GPCR均具有典型的七次跨膜結(jié)構(gòu)域

通過(guò)同源比對(duì)搜索，結(jié)果顯示，與S.cerevisiaeS288c中STE3、GPR1同源的C.higginsianumGPCR蛋白ID分別為CH063_13574.1、CH063_13120.1，并未發(fā)現(xiàn)與STE2同源的C.higginsianumGPCR蛋白；另外，通過(guò)關(guān)鍵詞搜索，結(jié)果顯示，共獲得C.higginsianum中兩個(gè)GPCR，其ID分別為CH063_00913.1、CH063_10797.1(表1).根據(jù)序列彼此之間的同源結(jié)果，將上述所獲得的的GPCR蛋白分別命名為ChGPR1、ChGPR2、ChSTE3、ChGPR4.

表1 希金斯炭疽菌GPCR基本情況及獲取方法

基于TMHMM跨膜結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果顯示，除ChSTE3外，其他GPCR均具有七次跨膜結(jié)構(gòu)域(圖1).同時(shí)，利用HMMTOP進(jìn)行預(yù)測(cè)，與上述結(jié)果相同，而對(duì)于具體的跨膜起始位置、終止位置預(yù)測(cè)并不相同(表2).

圖1 希金斯炭疽菌GPCR的保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.1 The conserved domain of GPCRs in C. higginsianum

2.2 GPCR蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及疏水性預(yù)測(cè)

C.higginsianum中所含GPCR彼此之間在酸性氨基酸、堿性氨基酸以及非極性R基氨基酸、不帶電荷的極性R基氨基酸方面組成及所占比例方面均存在不同(表3)，同時(shí)，在相對(duì)分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)、負(fù)電荷氨基酸殘基數(shù)、正電荷氨基酸殘基數(shù)、分子式、原子質(zhì)量以及不穩(wěn)定性系數(shù)、脂肪族氨基酸指數(shù)、總平均親水性等方面均存在著一定差異(表4).此外，除ChGPR4不穩(wěn)定性系數(shù)小于40外，其他均大于40，屬于不穩(wěn)定蛋白；ChGPR1、ChGPR2、ChGPR4總平均親水性(GRAVY)小于0，為親水性蛋白，而CgSTE3為疏水性蛋白(表4).C.higginsianum中4個(gè)GPCR在親(疏)水性最強(qiáng)氨基酸殘基及位置方面也存在著較大的差異(數(shù)據(jù)未顯示).

表2 希金斯炭疽菌GPCR跨膜情況預(yù)測(cè)

表3 希金斯炭疽菌GPCR氨基酸組成情況

表4 希金斯炭疽菌GPCR蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)

2.3 信號(hào)肽特征

經(jīng)過(guò)SingnalP 3.0分析，無(wú)論是經(jīng)NN計(jì)算還是經(jīng)HMM分析，4個(gè)GPCR均未發(fā)現(xiàn)有明顯的信號(hào)肽序列(數(shù)據(jù)未顯示).

2.4 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

希金斯炭疽菌C.higginsianum中所含的4個(gè)GPCR均含有較高比例的α螺旋，除ChSTE3外，其他GPCR所含有的α螺旋、β卷曲以及無(wú)規(guī)卷曲所占比例較為相近(圖2).

圖2 希金斯炭疽菌GPCR的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析Fig.2 The secondary structure character of GPCRs in C. higginsianum

2.5 亞細(xì)胞定位分析

C.higginsianum中所含的4個(gè)GPCR亞細(xì)胞定位情況均為質(zhì)膜(表5)，該結(jié)果與通過(guò)SMART分析以及跨膜結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果一致，同時(shí)，也符合GPCR所具有的功能特征.

2.6 遺傳關(guān)系

通過(guò)對(duì)C.higginsianum中的4個(gè)GPCR序列及其同源序列進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示，分別以ChGPR1、ChGPR2、ChSTE3以及ChGPR4為核心，分為明顯的4大類，就上述四個(gè)GPCR親緣關(guān)系而言，ChGPR1、ChGPR2和ChGPR4彼此之間親緣關(guān)系較近，而ChGPR2和ChGPR4彼此之間親緣關(guān)系更近.同時(shí)，發(fā)現(xiàn)該菌中的GPCR與C.graminicola、C.fioriniae等炭疽菌屬中的病菌具有較高的同源序列以及較近的親緣關(guān)系(圖3).

表5 希金斯炭疽菌GPCR亞細(xì)胞定位情況

Cg、CgN、Cg14、Co、Cf、Cs分別為Colletotrichum graminicola、Colletotrichum gloeosporioides Nara gc5、Colletotrichum gloeosporioides Cg-14、Colletotrichum orbiculare MAFF 240422、Colletotrichum fioriniae PJ7、Colletotrichum sublineola等物種的縮寫.

3 結(jié)論與討論

前人研究發(fā)現(xiàn)，基于HMM算法的TMHMM和HMMTOP對(duì)GPCR預(yù)測(cè)具有非常好的評(píng)價(jià)準(zhǔn)確性，正確率在85%[28].本研究通過(guò)對(duì)炭疽菌屬蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blastp比對(duì)分析以及關(guān)鍵詞搜索，并利用TMHMM、HMMTOP程序?qū)λ@得的候選GPCR進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，明確C.higginsianum中存在4個(gè)GPCR，同時(shí)，利用SMART、SignalP、PHD、Protscale、TargetP等生物信息學(xué)分析網(wǎng)站，明確其保守結(jié)構(gòu)域、信號(hào)肽、理化性質(zhì)、疏水性、亞細(xì)胞定位等情況；此外，通過(guò)對(duì)上述GPCR及其同源序列進(jìn)行遺傳關(guān)系分析，明確彼此之間存在的親緣關(guān)系.

通過(guò)對(duì)S.cerevisiaeS288c中GPR1、STE2、STE3保守結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果顯示GPR1僅具有六次跨膜結(jié)構(gòu)域，其他STE2、STE3均具有典型的七次跨膜結(jié)構(gòu)域，而本研究中所獲得的4個(gè)GPCR中，除ChSTE3外，均具有典型的七次跨膜結(jié)構(gòu)域，因此，七跨膜結(jié)構(gòu)域是否是GPCR所具有的唯一典型特征有待于進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證.

[1] 梁惠凌， 唐 輝. 廣西常見(jiàn)花卉真菌性病害的防治[J]. 廣西園藝， 2002(2): 18-19．

[2] 沈瑞清， 張 萍， 郭成瑾， 等. 寧夏炭疽菌屬真菌資源研究[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2012(5): 100-102， 149．

[3] Hyde K， Cai L， Cannon P， et al. Colletotrichum-names in current use[J]. Fungal Diversity， 2009， (39): 147-182．

[4] 盧博彬， 楊 暹. 菜心炭疽病研究進(jìn)展[J]. 長(zhǎng)江蔬菜， 2009(24): 1-5．

[5] 周而勛， 楊 媚， 張 華， 等. 菜心炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)的影響因素[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2002(2): 47-51．

[6] 況福元， 吳小麗， 呂風(fēng)青， 等. 菜心炭疽病菌拮抗細(xì)菌的篩選及鑒定[J]. 微生物學(xué)通報(bào)， 2009(9): 1350-1355．

[7] 郭巨先， 劉玉濤， 楊 暹. 鉀營(yíng)養(yǎng)對(duì)菜薹(菜心)炭疽病發(fā)生和植株防御酶活性的影響[J]. 中國(guó)蔬菜， 2012(14): 86-89．

[8] 康云艷， 周小萌， 楊 暹， 等. pHBA對(duì)菜心炭疽病的誘導(dǎo)抗性及植株生理特性的影響[J]. 植物病理學(xué)報(bào)， 2014， 44(4): 393-404．

[9] O’Connell R J， Thon M R， Hacquard S， et al. Lifestyle transitions in plant pathogenicColletotrichumfungi deciphered by genome and transcriptome analyses[J]. Nat Genet， 2012， 44(9): 1060-1065．

[10] 林春花， 蔡志英， 黃貴修. 全基因組法繪制禾谷炭疽菌和希金斯炭疽菌中MAPK級(jí)聯(lián)信號(hào)途徑簡(jiǎn)圖[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2012(4): 674-680．

[11] Huser A， Takahara H， Schmalenbach W， O’Connell R. Discovery of pathogenicity genes in the crucifer anthracnose fungusColletotrichumhigginsianum， using random insertional mutagenesis[J]. Molecular plant-microbe interactions， 2009， 22(2): 143-156．

[12] Ushimaru T， Terada H， Tsuboi K， et al. Development of an efficient gene targeting system inColletotrichumhigginsianumusing a non-homologous end-joining mutant andAgrobacteriumtumefaciens-mediatedgene transfer[J]. Molecular Genetics and Genomics， 2010， 284(5): 357-371．

[13] 周 鵬. 希金斯刺盤孢T-DNA插入體庫(kù)的構(gòu)建、篩選及相關(guān)突變體基因的克隆[D]. 武漢: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2011．

[14] 趙 典. 希金斯刺盤孢T-DNA插入體庫(kù)的篩選及相關(guān)突變體基因的克隆[D]. 武漢: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2012．

[15] 韓長(zhǎng)志. 希金斯炭疽菌RGS蛋白生物信息學(xué)分析[J]. 生物技術(shù)， 2014(1): 36-41．

[16] 韓長(zhǎng)志. 希金斯炭疽菌14-3-3蛋白生物信息學(xué)分析[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2014， 3(15): 3669-3672．

[17] 韓長(zhǎng)志. 希金斯炭疽菌中五個(gè)典型septin生物信息學(xué)分析[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2014， 43(8): 91-96．

[18] Li L， Wright S J， Krystofova S， et al. Heterotrimeric G protein signaling in filamentous fungi[J]. Annu Rev Microbiol， 2007， 61:423-452．

[19] 韓長(zhǎng)志． 植物病原絲狀真菌G蛋白偶聯(lián)受體的研究進(jìn)展[J]．微生物學(xué)通報(bào)， 2015， 42(2)：374-383．

[20] Versele M， Lemaire K， Thevelein J M. Sex and sugar in yeast: two distinct GPCR systems[J]. EMBO reports， 2001， 2(7): 574-579．

[21] Letunic I， Doerks T， Bork P. SMART 7: recent updates to the protein domain annotation resource[J]. Nucleic acids research， 2012， 40(D1): D302-D305．

[22] Bendtsen J D， Nielsen H， von Heijne G， et al. Improved prediction of signal peptides: SignalP 3.0[J]. Journal of Molecular Biology， 2004， 340(4): 783-795．

[23] Tusnady G E， Simon I. The HMMTOP transmembrane topology prediction server[J]. Bioinformatics， 2001， 17(9): 849-850．

[24] Gasteiger E， Hoogland C， Gattiker A， et al. Protein identification and analysis tools on the ExPASy server[M]. The proteomics protocols handbook: Springer, 2005:571-607．

[25] Kelley L A， Sternberg M J. Protein structure prediction on the Web: a case study using the Phyre server[J]. Nat Protoc， 2009， 4(3): 363-371．

[26] Thompson J D， Gibson T J， Higgins D G. Multiple sequence alignment using ClustalW and ClustalX[J]. Current Protocols in Bioinformatics， 2002， Chapter 2(Unit 2.3)．

[27] Tamura K， Peterson D， Peterson N， et al. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood， evolutionary distance， and maximum parsimony methods[J]. Mol Biol Evol， 2011， 28(10): 2731-2739．

[28] M?ller S， Croning M D， Apweiler R. Evaluation of methods for the prediction of membrane spanning regions[J]. Bioinformatics， 2001， 17(7): 646-653．

Bioinformatics analysis on G protein-coupled receptors inColletotrichumhigginsanum

HAN Changzhi

(College of Forestry， Southwest Forestry University， The Key Laboratory of Forest Disaster Warning and Control of Yunnan Province， Kunming 650224)

Colletotrichumhigginsanumcan infect cruciferous vegetables plants， causing tremendous economic losses in agricultural production in many countries. GPCR as a perception protein of G protein signal transduction in vivo plays an important role in the signal transduction process. Based on the three typical GPCR sequences had been reported inSaccharomycescerevisiae， to search GPCR-like protein sequence from the protein databases ofColletotrichumspp. with the Blastp as well as the use of keywords， and the seven trans-membrane domain of four typical GPCRs were analyzed by using the TMHMM. Meanwhile， through bioinformatics analysis including the signal peptide， subcellular location and the secondary structure， there is high proportion of helical structure and not contains significant signal peptide sequence in every GPCR protein， and which positioned in the plasma membrane. In addition， analysis of genetic relationships through comparative four GPCRs in C. graminicola with 23 homologous sequences in other species， bothC.graminicolaandC.fioriniaehave a high sequence homology and close genetic relationship withC.higginsanum. This study could provide strong theoretical foundation to the function of GPCR， and provided an important theoretical guidance to clarify the other pathogen inColletotrichumspp.

Colletotrichumhigginsanum; GPCR; signal peptide; secondary structure;Colletotrichumspp

2014-12-29.

云南省優(yōu)勢(shì)特色重點(diǎn)學(xué)科生物學(xué)一級(jí)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(50097505);云南省高校林下生物資源保護(hù)及利用科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(2014015);云南省教育廳科學(xué)研究基金項(xiàng)目(2014Y330);國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(31200488).

1000-1190(2015)02-0246-06

S435.1

A

*E-mail: hanchangzhi2010@163.com.