周彥君，劉麗冰，張 巖

（1.濰坊醫(yī)學院麻醉學系，山東濰坊261053；2.濰坊醫(yī)學院附屬醫(yī)院麻醉科，山東濰坊261031）

CARTp 對腦缺血再灌注小鼠神經功能的影響

周彥君1，劉麗冰1，張 巖2

（1.濰坊醫(yī)學院麻醉學系，山東濰坊261053；2.濰坊醫(yī)學院附屬醫(yī)院麻醉科，山東濰坊261031）

目的探討可卡因-苯丙胺調節(jié)轉錄肽（CARTp）對不同時間段腦缺血再灌注小鼠神經功能的影響。方法將成年美國癌癥研究所雄性小鼠隨機分為三組：假手術組（Sham組）、大腦中動脈阻塞組（MCAO組）和CARTp處理組，每組15只。采用線栓法復制MCAO模型。CARTp處理組小鼠于缺血再灌注第2天經尾靜脈注射CARTp（2.5μg/kg），以后每天注射2.5μg/kg至第10天；Sham組、MCAO組注射生理鹽水。通過神經功能評分判斷神經功能障礙程度。觀察并比較三組小鼠腦缺血再灌注損傷后的神經功能評分，判斷不同處理組小鼠的神經功能障礙情況。結果MCAO組和CARTp處理組神經功能評分均顯著高于Sham組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；CARTp處理組的神經功能評分從第1天至第8天均低于MCAO組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論CARTp能減輕小鼠腦缺血再灌注損傷引起的神經功能障礙，并可能在腦神經功能恢復中發(fā)揮重要作用，但隨著時間延長，CARTp減輕神經功能障礙的作用明顯減弱。

腦缺血； 再灌注損傷； 苯丙胺； 可卡因； 神經肽類

腦是人體對缺血最為敏感的器官，腦組織缺血將會導致局部腦組織及其功能的損害，其損害程度與缺血時間長短及殘存血流量的多少有關。缺血性腦卒中是指由于腦的供血動脈（頸動脈和椎動脈）狹窄或閉塞、腦供血不足導致的腦組織壞死的總稱。而腦最明顯的組織學變化是腦水腫及腦細胞壞死，并伴有相應部位的臨床癥狀和體征，如偏癱、失語等可降低患者的生活質量。缺血性腦卒中因其高發(fā)病率、高病死率、高致殘率而極具危害性，其中缺血性腦血管病是現(xiàn)代社會致死致殘的主要原因之一，其治療原則是及時恢復缺血區(qū)的血液再灌注，而隨之而來的一大難題又是缺血再灌注損傷。腦缺血再灌注損傷是缺血性腦卒中的一種常見病理生理過程，而腦缺血再灌注損傷是指腦缺血一定時間再恢復血液供應后，大腦功能不僅沒有得到及時恢復，反而出現(xiàn)更加嚴重的功能活動障礙[1]。由于腦缺血再灌注后有大量Ca2+內流，并生成大量氧自由基，是引起廣泛組織細胞損傷的主要發(fā)病機制。目前臨床上公認的腦缺血有效治療方法是抗凝、溶栓[2]，但受溶栓時間窗所限，需要力爭在3～6 h治療時間窗內給予溶栓治療，而在有效時間窗之外給予溶栓治療其效果并不理想，因此，受溶栓時間窗所限，缺乏有效的補救時間是治療腦缺血再灌注損傷的問題所在。減輕時間窗之外的腦缺血再灌注損傷后的神經功能障礙，促進神經功能恢復，對提高患者的生活質量具有重要臨床意義。

1 材料與方法

1.1 一般材料 采用成年美國癌癥研究所（ICR）雄性小鼠（北京大學醫(yī)學部動物提供），體質量22～25 g，單籠飼養(yǎng)，自由進食及飲水，室溫維持在20～25℃。將45只ICR雄性小鼠隨機分為假手術組（Sham組）、大腦中動脈阻塞組（MCAO組）和可卡因-苯丙胺調節(jié)轉錄肽（CARTp）處理組，每組15只。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制作及觀察指標 采用線栓法復制MCAO模型[3]。MCAO組與CARTp處理組小鼠腦缺血2 h后，撤除栓線于不同時間段進行再灌注。Sham組的手術過程與MCAO組和CARTp處理組相同，但栓線不插入大腦中動脈區(qū)域。CARTp處理組于再灌注開始后第2天經尾靜脈注射CARTp 2.5μg/kg，以后每天注射CARTp 2.5μg/kg至第10天，Sham組和MCAO組于相同時間注射等量生理鹽水。給藥后2 h對其進行神經功能評分，觀察并記錄各組小鼠每天的神經功能評分。

1.2.2 神經功能評分 參照Bederson′sscore評分標準[4]對小鼠進行神經功能評分。兩前肢伸直，無神經病學征象為0分；一前肢屈曲，另一前肢伸直為1分；運動不協(xié)調，身體偏向一側，旋轉運動為2分；偏癱，不能站立行走為3分。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用GraphPad Prism軟件處理數(shù)據(jù)和制作圖表，計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

MCAO組和CARTp處理組神經功能評分均顯著高于Sham組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；CARTp處理組的神經功能評分從第1天至第8天均低于MCAO組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），從第9天起兩組神經功能評分大致相同，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 各組小鼠神經功能評分比較（±s，分）

表1 各組小鼠神經功能評分比較（±s，分）

注：與Sham組比較，aP＜0.05；與MCAO組比較，bP＜0.05。

時間第1天第2天第3天第4天第5天第6天第7天第8天第9天第10天Sham組 MCAO組 CARTp處理組0.33±0.11 0.22±0.10 0.22±0.10 0.17±0.09 0.09±0.09 0.09±0.09 0.18±0.12 0.25±0.25 0.25±0.25 0.00±0.00 2.69±0.12a2.44±0.13a2.25±0.14a1.75±0.14a1.63±0.18a1.63±0.18a1.38±0.18a1.25±0.25a1.00±0.00a1.00±0.00a1.33±0.11ab1.24±0.10ab1.05±0.05ab1.05±0.05ab1.07±0.07ab1.07±0.07ab1.00±0.00ab1.00±0.00ab1.00±0.00a1.00±0.00a

3 討 論

腦缺血可引起一系列復雜的病理生理變化并最終導致腦損傷[5]。腦缺血再灌注可導致大量自由基的存在，造成腦組織損傷和功能障礙；引起鈣通道開放，細胞膜通透性增大，Na+-Ca2+交換異常等導致細胞內鈣超載，引起腦細胞結構和功能的破壞、細胞死亡；腦缺血時興奮性氨基酸對缺血腦細胞具有興奮毒性，是缺血再灌注損傷的重要環(huán)節(jié)；其中缺血半影區(qū)（IP）是介于梗死灶和正常組織之間的移行區(qū)域，是指因缺血致使組織電活動停止，但能保持跨膜離子平衡和結構完整的腦區(qū)。而腦缺血再灌注可促進多種炎癥因子的釋放，進一步加重IP的炎性反應；此外，與細胞凋亡密切相關的基因是B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）家族和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）家族，腦缺血再灌注可促進Caspase的表達，抑制Bcl-2的表達引起細胞凋亡。有研究表明，在缺血再灌注之前給予CARTp預處理可減少腦梗死體積，減少炎癥因子的表達，抑制氧化應激反應，從而起到腦保護作用[6]。在腦缺血再灌注損傷后時間窗之內給予CARTp也可以通過減少腦梗死面積、腦水腫，減輕血-腦脊液屏障的通透性，增加神經營養(yǎng)因子的表達等，從而起到保護腦組織的作用[7-8]。此外，CARTp還可通過減輕腦缺血再灌注引起的炎性反應起到腦保護作用[9]，從而減輕神經功能障礙。因此，腦缺血再灌注損傷后時間窗之外的處理對神經功能的恢復具有重要意義。

CARTp是一種在體內分布廣泛的神經肽類物質[10]。其中CART55-102作為CARTp中主要的活動片段，在腦中的含量豐富，但不存在于外周神經系統(tǒng)中[11]。CARTp具有廣泛的生理作用，在進食與肥胖、精神焦慮行為、體液平衡、免疫功能、新陳代謝、內分泌及其他的一些生理過程中均有作用[12]。近年有研究發(fā)現(xiàn)，CARTp在中樞神經系統(tǒng)廣泛分布，并且參與調節(jié)多種生理過程，具有一定的中樞保護作用，是一種很有潛力的神經保護劑[13]。

生長相關蛋白-43（GAP-43）是一種與細胞及組織整體發(fā)育有關的蛋白之一，廣泛存在于大腦、小腦、海馬及自主神經系統(tǒng)，其中神經膠質細胞、少突膠質細胞及神經元細胞均能表達GAP-43，作為快速轉運蛋白的GAP-43起初位于胞體，隨著細胞突起的延長而逐漸趨向于突起，最后集中在生長錐。因此，GAP-43與神經再生關系密切，可促進神經元的生長、發(fā)育、神經再生及突觸重建，從而促進神經功能重塑[14]。CARTp是否可以促進腦缺血再灌注損傷后小鼠大腦皮層神經元GAP-43的表達及其如何促進GAP-43的表達變化具有重要意義。本實驗研究的是腦缺血再灌注損傷后第2天給予CARTp并持續(xù)用藥至第10天的神經功能變化。MCAO組與Sham組比較，其神經功能評分高于Sham組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），說明腦缺血再灌注后會引起神經功能損傷。從第2天給予CARTp至第8天，CARTp處理組的神經功能評分低于MCAO組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而第9、10天兩組神經功能評分大致相同，說明CARTp可以顯著減輕腦缺血再灌注損傷后急性期的神經功能障礙，但隨時間延長，CARTp減輕神經功能障礙的作用明顯減弱。有研究證明，腦缺血再灌注可誘導凋亡相關蛋白Caspase-3的表達，進而導致細胞凋亡，而細胞凋亡是神經細胞死亡的重要形式[15]。CARTp可通過增加抗凋亡因子減少促凋亡因子的表達，從而減輕腦缺血再灌注鼠大腦皮層神經元的損傷，起到保護神經功能的作用。大腦皮層神經元氧糖剝奪后給予CARTp可增加GAP-43的表達，起到神經保護作用[16]。此外，星形膠質細胞作為中樞神經系統(tǒng)中含量最豐富的細胞，它可以通過釋放多種神經營養(yǎng)因子促進損傷神經組織的修復[17]。然而CARTp是否是通過增加IP星形膠質細胞的表達從而起到其神經保護作用，以及CARTp如何調節(jié)IP星形膠質細胞的表達，這些問題為下一步研究提供了新的方向。

總之，CARTp可明顯減少腦缺血再灌注損傷后的神經功能評分，減輕腦缺血再灌注后引起的神經功能損傷。表明CARTp可以有效減輕腦缺血再灌注損傷后治療時間窗之外急性期的神經功能障礙。

[1]林海平，王永，沈燕，等.大鼠腦缺血再灌注損傷中細胞凋亡相關調控因子的研究進展[J].中國老年學雜志，2014，34（9）：2589-2592.

[2]Goldstein LB.Acute ischemic stroke treatment in 2007[J].Circulation，2007，116（13）：1504-1514.

[3]Luo Y，Shen H，Liu HS，etal.CART peptide induces neuroregeneration in stroke rats[J].JCereb Blood Flow Metab，2013，33（2）：300-310.

[4]Swanson RA，Morton MT，Tsao-Wu G，etal.A semiautomatedmethod for measuring brain infarct volume[J].JCereb Blood Flow Metab，1990，10（2）：290-293.

[5]Jia J，Chen X，Zhu W，et al.CART protects brain from damage through ERK activation in ischemic stroke[J].Neuropeptides，2008，42（5/6）：653-661.

[6]沙杜鵑，韓勇，顧雙雙，等.可卡因-苯丙胺調節(jié)轉錄肽對腦缺血-再灌注損傷小鼠腦保護機制的研究[J].中國腦血管病雜志，2012，9（8）：423-427.

[7]Lo EH，Dalkara T，MoskowitzMA.Mechanisms，challenges and opportunities in stroke[J].NatRev Neurosci，2003，4（5）：399-415.

[8]Liu HS，Shen H，Harvey BK，etal.Post-treatmentwith amphetamine enhances reinnervation of the ipsilateral side cortex in stroke rats[J].Neuroimage，2011，56（1）：280-289.

[9]薛進華，王萬輝，黃靜瑤，等.腦缺血再灌注損傷時細胞因子的改變及染料木素的干預作用[J].中國實驗方劑學雜志，2013，19（22）：197-200.

[10]KuharMJ，Yoho L.CART peptide analysisbyWestern blotting[J].Synapse，1999，33（3）：163-171.

[11]Sha D，Wang Z，Qian L，et al.A cocaine-regulated and amphetamine-regulated transcript inhibits oxidative stress in neurons deprived of oxygen and glucose[J].Neuroreport，2013，24（13）：698-703.

[12]艾恒，莫書榮，路長林，等.可卡因-苯丙胺調節(jié)轉錄肽[J].中國藥物依賴性雜志，2006，15（3）：230-233.

[13]Giffard RG，Han RQ，Emery JF，etal.Regulation ofapoptotic and inflammatory cellsignaling in cerebral ischemia：the complex rolesofheatshock protein 70[J].Anesthesiology，2008，109（2）：339-348.

[14]劉健，楊小玉，楊茂光，等.中樞神經損傷后GAP-43蛋白對神經再生及軸突導向作用及其機制的研究進展[J].吉林大學學報，2013，39（1）：180-183.

[15]高維娟，張霞，劉莎莎.大鼠腦缺血再灌注后海馬CA1區(qū)Caspase-3的表達及細胞凋亡的動態(tài)變化[J].中國老年學雜志，2013，33（24）：6202-6204.

[16]Wang Y，Qiu B，Liu J，etal.Cocaine-and amphetamine-regulated transcript facilitates the neurite outgrowth in cortical neurons afteroxygen and glucose deprivation through PTN-dependent pathway[J].Neuroscience，2014，277：103-110.

[17]Doeppner TR，Kaltwasser B，F(xiàn)engyan J，etal.TAT-Hsp70 inducesneuroprotection against stroke via anti-inflammatory actions providing appropriate cellularmicroenvironment for transplantation of neural precursor cells[J].JCereb Blood Flow Metab，2013，33（11）：1778-1788.

Effectof CARTp on neuro-function after cerebral ischem ia-reperfusion

Zhou Yanjun1，Liu Libing1，Zhang Yan2
（1.Department of Anesthesiology，Weifang Medical University，Weifang，Shandong 261053，China；2.Department of Anesthesiology，the Affiliated HospitalofWeifangMedicalUniversity，Weifang，Shandong261031，China）

ObjectiveToexplore theeffectofCocaine-and amphetamine-regulated transcript（CARTp）onmice′sneurofunction after cerebral ischemia-reperfusion atdifferent time periods.MethodsAdultmale Institute of Cancer Research（ICR）ratswere randomly divided into the Sham operation group（the Sham group），themiddle cerebral artery occlusion group（MCAO group）and the CARTp group，15 of each group.The transientmiddle cerebral artery occlusion（MCAO）ratmodelwas performed by suture-occludedmethod.The 2.5μg/kg CARTp was injected to themice in the CARTp group by vena caudalis on second day after MCAO and then 2.5μg/kg daily till the tenth day while the Sham group and the MCAO group with normal saline. Neurological deficits degree were evaluated by Bederson′s score.Itwas observed and compared the neurological deficits after cerebral ischemia-reperfusion injury to judge theneurologicaldeficitsof the three ratsgroups.ResultsThe neurologicalscoreof theMCAOgroup and the CARTp group was significantly higher than thatof the Sham group，whichwas statistically significant in difference（P＜0.05）.The neurological score of the CARTp group from the first day to the eighth day was lower than thatof the MCAO group.The difference had statisticalsignificance（P＜0.05）..ConclusionCARTpmay relieve the neurological deficitsafter cerebral ischemia-reperfusion，and also playsan important role in recovery ofbrain-neural functions.

Brain ischemia； Reperfusion injury； Cocaine； Amphetamine； Neuropeptides

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.07.011

：A

：1009-5519（2015）07-0988-03

2014-10-11

2014-11-14）

周彥君（1988-），女，山東煙臺人，碩士研究生，主要從事臨床麻醉工作；E-mail：1196808868@qq.com。

張巖（E-mail：firstxvx3@qq.com）。