何釘玲，胡芳芳，蘇永康，邱先帥，肖熹玉，潘家強(qiáng)

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642)

金錢(qián)草組方對(duì)犬草酸鈣尿結(jié)石形成的影響

何釘玲，胡芳芳，蘇永康，邱先帥，肖熹玉，潘家強(qiáng)*

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642)

研究金錢(qián)草組方湯劑對(duì)試驗(yàn)性犬草酸鈣尿結(jié)石形成的影響，初步探討其作用機(jī)制。12只雄性中華田園犬隨機(jī)分為3組，分別為對(duì)照組、模型組和治療組。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧，模型組和治療組在飼喂基礎(chǔ)日糧的基礎(chǔ)上，飲食中添加乙二醇、氯化銨、碳酸鈣和維生素D。待試驗(yàn)犬尿液沉渣在顯微鏡檢視野下出現(xiàn)80%的草酸鈣結(jié)晶后，給治療組犬灌服金錢(qián)草組方湯劑。試驗(yàn)過(guò)程中檢測(cè)試驗(yàn)犬尿液中微量白蛋白(mAlb)含量、N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶(NAG酶)活力、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(γ-GT酶)活力；檢測(cè)血清中肌酐(Crea)、尿素氮(BUN)、尿酸(UA)、丙二醛(MDA)含量和乳酸脫氫酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)活力。結(jié)果顯示：與模型組相比，金錢(qián)草組方湯劑能顯著降低治療組犬尿液中NAG酶和γ-GT酶活力；降低治療組犬血清中UA、MDA含量和LDH酶活力，提高SOD酶活力。金錢(qián)草組方湯劑能有效降低草酸鈣結(jié)石形成過(guò)程對(duì)腎功能的損傷，提高血液的抗氧化酶活性，即能有效修復(fù)腎細(xì)胞損傷，保證腎的作用，防止犬草酸鈣尿結(jié)石的形成。

犬；金錢(qián)草組方；腎功能；草酸鈣尿結(jié)石；抗氧化

犬尿石癥是指犬尿路中無(wú)機(jī)鹽或有機(jī)鹽類(lèi)結(jié)晶的凝集物，如結(jié)石、積石或多量結(jié)晶，刺激尿路黏膜而引起泌尿道炎癥、阻塞和出血的一種泌尿系統(tǒng)疾病[1～2]。該病是臨床高發(fā)疾病之一，且復(fù)發(fā)率較高。近年來(lái)，據(jù)美國(guó)明尼蘇達(dá)州尿結(jié)石中心統(tǒng)計(jì)，犬的草酸鈣尿結(jié)石在所有結(jié)石種類(lèi)中的比例從1981年的5%逐漸上升到2005年的41%，與磷酸銨鎂結(jié)石(2005年占比為38%)并列成為犬最常見(jiàn)的結(jié)石種類(lèi)[3]。草酸鈣腎結(jié)石的形成機(jī)制復(fù)雜，目前認(rèn)為，結(jié)石的形成是尿液不斷飽和，由此形成的結(jié)晶再經(jīng)成核、生長(zhǎng)、聚集、黏附上皮表面、滯留腎內(nèi)、晶體—細(xì)胞間反應(yīng)等一系列復(fù)雜的步驟。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，草酸、草酸鈣晶體可導(dǎo)致腎上皮和腎間質(zhì)損傷，而腎上皮損傷在腎結(jié)石的形成過(guò)程中起著十分重要的作用[4-5]，而間質(zhì)損傷則是慢性腎病發(fā)展和最終腎功能衰竭最重要的危險(xiǎn)因素之一。

中藥治療以其無(wú)創(chuàng)傷、毒副作用低的特點(diǎn)，在人醫(yī)臨床上被人們廣泛接受，臨床資料證明以金錢(qián)草為主的中藥制劑在治療尿結(jié)石疾病方面取得了良好的成效。現(xiàn)代藥理研究表明，金錢(qián)草化學(xué)成分主要有黃酮類(lèi)化合物、三萜醇配糖體、生物堿、多糖、鞣質(zhì)、氨基酸及氯化鉀等[6]，其中黃酮類(lèi)化合物為主要成分。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，黃酮類(lèi)化合物具有優(yōu)良的抗氧化性和清除自由基的能力[7]。目前動(dòng)物試驗(yàn)及體外試驗(yàn)證明氧自由基破壞腎小管及影響腎小管功能是草酸鈣結(jié)石形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[8]，這也是尋找抗氧自由基藥物用于防治草酸鈣結(jié)石的理論依據(jù)。本試驗(yàn)研究以金錢(qián)草為主的中藥復(fù)方湯劑對(duì)草酸鈣尿結(jié)石形成的影響，并從減輕腎損傷和抗氧自由基的作用方面初步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 中藥

金錢(qián)草、海金沙、雞內(nèi)金、石韋、郁金、金銀花、冬葵子、滑石、瞿麥、車(chē)前子、徐長(zhǎng)卿、烏藥、牛膝、益母草、甘草15種中藥(購(gòu)于廣州同仁堂藥房)。其中按金錢(qián)草∶海金沙∶雞內(nèi)金∶石韋∶郁金∶金銀花∶冬葵子∶滑石∶瞿麥∶車(chē)前子∶徐長(zhǎng)卿∶烏藥∶牛膝∶益母草∶甘草=9∶9∶9∶6∶5∶5∶2∶2∶2∶2∶2∶2∶2∶1∶2的比例配方。

1.2 試劑

乙二醇、氯化銨和碳酸鈣(國(guó)產(chǎn)分析純)，維生素D為飼料級(jí)(500萬(wàn)IU·g-1)，均由Kermel公司生產(chǎn)；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、乳酸脫氫酶(LDH)、γ-谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶(γ-GT)、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)、肌酐(Crea)、尿素氮(BUN)、尿酸(UA)測(cè)定試劑盒，購(gòu)自南京建成生物工程研究所；微量白蛋白(mAlb)測(cè)定試劑盒，購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

中華田園犬，購(gòu)于廣州市某犬場(chǎng)。

1.4 金錢(qián)草組方湯劑質(zhì)量濃度和劑量的確定

通過(guò)小白鼠急性毒性試驗(yàn)，摸索出小白鼠死亡率最低的最大適宜給藥質(zhì)量濃度為2.96 g·mL-1。根據(jù)動(dòng)物之間體表面積換算公式[3]，計(jì)算出犬的最佳給藥劑量，即對(duì)于10 kg的犬，藥物質(zhì)量濃度為2 g·mL-1，應(yīng)灌胃16 mL·d-1。

1.5 試驗(yàn)犬的分組與飼喂管理

12只1歲左右的雄性中華田園犬(體重約10 kg)，經(jīng)驅(qū)蟲(chóng)、三聯(lián)疫苗和狂犬疫苗免疫，隨機(jī)分成3組，分別為模型組、治療組和對(duì)照組，單籠飼養(yǎng)。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧，基礎(chǔ)日糧為依據(jù)NRC-1994標(biāo)準(zhǔn)自制的含水量為75%的濕糧，主要成分有新鮮雞肝、粳米、玉米淀粉、預(yù)混料等，主要營(yíng)養(yǎng)水平如下：粗蛋白質(zhì)21.5%，代謝能18.34 kJ·g-1，實(shí)測(cè)含鈣1.1%，磷0.5%，鎂0.06%，鉀0.3%。 模型組和治療組在基礎(chǔ)日糧的基礎(chǔ)上，飲食中添加乙二醇0.2 mL·kg-1·d-1、氯化銨0.25 g·kg-1·d-1、維生素D 1 300 U·kg-1·d-1、碳酸鈣0.45 g·kg-1·d-1。所有試驗(yàn)犬均按60 g·kg-1·d-1的量分2次飼喂相應(yīng)的日糧，按15 mL·kg-1·d-1的量分2次飲用清潔水(犬每天的正常需水量為20～70 mL·kg-1[4]，每天從飼料中攝入的水量約為50 mL)，每天均在上午10點(diǎn)和下午5點(diǎn)飼喂犬糧及清潔水。待試驗(yàn)犬尿液沉渣在顯微鏡檢下，視野的80%都出現(xiàn)結(jié)晶時(shí)，給治療組犬灌服金錢(qián)草組方湯劑(16 mL·d-1，2 g·mL-1)，連續(xù)6周。

1.6 樣品采集及處理

每天記錄犬進(jìn)食、飲水及排尿情況，觀察試驗(yàn)犬的排尿表現(xiàn)及臨床癥狀，每隔7 d分別采集血液和尿液樣品。血液置于非抗凝離心管中，3 000 r·min-1離心10 min，分離血清，-20 ℃保存?zhèn)溆谩２捎米灾平幽蚱魇占蛞海? 000 r·min-1離心10 min，吸取上清，立即測(cè)定各項(xiàng)生化指標(biāo)。

1.7 樣品的測(cè)定方法

尿液上清mAlb含量、γ-GT酶活力、NAG酶活力和血清SOD酶活性、MDA含量、LDH酶活性、BUN含量、 Crea 含量、UA含量均采用相應(yīng)的試劑盒進(jìn)行測(cè)定，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.8 X射線、B超檢查

在試驗(yàn)進(jìn)行的第49天開(kāi)始，每隔兩周進(jìn)行一次X射線、B超檢查(采用華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院X射線、B超檢測(cè)儀)。

1.9 尿結(jié)石成分分析

將手術(shù)取出的結(jié)石，用蒸餾水沖洗后晾干，將結(jié)石樣本噴鉑金后，在中山大學(xué)測(cè)試中心用Quanta 400F 熱場(chǎng)環(huán)境SCM FEI(美國(guó))進(jìn)行電鏡掃描。

1.10 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié) 果

2.1 金錢(qián)草組方湯劑對(duì)試驗(yàn)犬尿液上清中mAlb含量、NAG酶和γ-GT酶活力的影響

由表1可以看出，試驗(yàn)開(kāi)始的第0天，各組間尿液上清中mAlb含量、NAG酶和γ-GT酶活力差異均不顯著。第21天后，與對(duì)照組比較，模型組尿上清mAlb含量、NAG酶和γ-GT酶活力顯著增加(P<0.05)，提示模型組犬的腎出現(xiàn)了早期損傷；治療組尿上清mAlb含量從第28天起、NAG酶和γ-GT酶活力從第35天起，顯著低于模型組(P<0.05)，提示該金錢(qián)草組方湯劑對(duì)腎損傷有一定程度的修復(fù)效果。

2.2 金錢(qián)草組方湯劑對(duì)試驗(yàn)犬血清中LDH酶活力的影響

由表2可以看出，試驗(yàn)開(kāi)始第0天，各組間血清中LDH酶活力差異不顯著。第21天后，與對(duì)照組比較，模型組血清中LDH酶活力顯著增加，提示模型組引起了腎的早期損傷；治療組血清中LDH酶活力在第28天及之后均顯著低于模型組，且到第56天時(shí)，與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異，提示該金錢(qián)草組方湯劑對(duì)腎損傷有一定程度的修復(fù)效果。

2.3 金錢(qián)草組方湯劑對(duì)試驗(yàn)犬血清中Crea、BUN與UA含量的影響

由表3可知，試驗(yàn)開(kāi)始第0—21天，各組間血清中UA含量差異不顯著。與對(duì)照組相比，模型組血清中UA含量在試驗(yàn)第28天及之后顯著增加，但維持在正常范圍內(nèi)；治療組血清中UA含量在試驗(yàn)第35天及之后顯著低于模型組，提示金錢(qián)草組方湯劑能維持血清中UA含量在正常參考范圍內(nèi)。模型組和治療組血清中Crea、BUN含量均在正常范圍內(nèi)(44.2～132.6umol·L-1、3.567～9.996mmol·L-1)波動(dòng)，與對(duì)照組相比差異不顯著(數(shù)據(jù)略)。

2.4 金錢(qián)草組方湯劑對(duì)試驗(yàn)犬血清中SOD活力和MDA含量的影響

由表4可知，試驗(yàn)開(kāi)始第0天，各組之間血清中SOD活力和MDA含量差異均不顯著。第21天后，與對(duì)照組比較，模型組血清中SOD活性顯著降低，MDA含量顯著增加，提示模型組抗氧化能力降低；金錢(qián)草復(fù)方有效提高了血清中SOD活性，降低了血清中MDA含量，治療組SOD活性在第28天及之后比模型組顯著升高，MDA含量第28天及之后比模型組顯著降低，提示該金錢(qián)草組方湯劑能提高血清中抗氧化酶活性，保護(hù)腎免受損傷。

2.5 各組草酸鈣尿結(jié)石的發(fā)病情況

試驗(yàn)第84天時(shí)，模型組犬只經(jīng)B超檢查，有2只試驗(yàn)犬的腎中發(fā)現(xiàn)有直徑約為3.5mm的結(jié)石影像，其中1只犬膀胱中還發(fā)現(xiàn)有直徑約為1.7mm的結(jié)石影像，而對(duì)照組和中藥治療組未見(jiàn)結(jié)石影像(圖1、2)。

2.6 結(jié)石掃描電鏡

從掃描電鏡結(jié)果可以看出，結(jié)石表面呈典型的錐狀突起，與草酸鈣結(jié)石形貌相符(圖3)。

圖1 試驗(yàn)第84天模型組犬腎B超圖，可見(jiàn)在腎盂有直徑約3.5 mm的結(jié)石影像Fig.1 The model group picture of canine kidney by B ultrasonic in the day of 84.It has a diameter of 3.5 mm stone in the renal pelvis

圖2 試驗(yàn)第84天模型組犬膀胱B超圖，可見(jiàn)膀胱內(nèi)有直徑約1.7 mm的結(jié)石影像Fig.2 The model group picture of canine bladder by B ultrasonic in the day of 84.It has a diameter of 1.7 mm stone in the bladder

圖3 結(jié)石掃描電鏡觀察 800×Fig.3 The picture of stones scanning electron microscopy 800×

3 討 論

本研究證實(shí)，飲食中添加乙二醇、氯化銨、碳酸鈣和維生素D能夠誘發(fā)草酸鈣尿結(jié)石。試驗(yàn)結(jié)果顯示，模型動(dòng)物發(fā)生腎損傷，反映腎早期損傷的指標(biāo)(尿液上清中mAlb含量、NAG酶活性、γ-GT酶活性和血清中LDH酶活性)自第21天后呈逐漸上升趨勢(shì)，并顯著高于對(duì)照組；反映腎機(jī)能障礙的指標(biāo)(血清Crea、BUN、UA含量)隨著試驗(yàn)的進(jìn)行，UA含量自第28天后呈逐漸上升趨勢(shì)，并顯著高于對(duì)照組，但Crea、BUN、UA含量均基本維持在正常范圍內(nèi)，說(shuō)明由于試驗(yàn)時(shí)間的限制，試驗(yàn)犬并沒(méi)有出現(xiàn)明顯的機(jī)能障礙；反映機(jī)體抗氧化能力的指標(biāo)MDA含量和SOD活力，自第21天開(kāi)始分別高于和低于對(duì)照組。給予中藥復(fù)方湯劑的治療組，隨著試驗(yàn)進(jìn)行，反映腎早期損傷和腎機(jī)能障礙的相關(guān)指標(biāo)逐漸降低，顯著低于模型組，說(shuō)明該中藥復(fù)方湯劑能降低腎損傷水平，對(duì)腎功能損傷具有一定的修復(fù)作用，并進(jìn)而阻止了草酸鈣尿結(jié)石的形成。中藥復(fù)方亦有效提高血清中SOD活性，降低血清中MDA含量。說(shuō)明該金錢(qián)草組方湯劑能提高機(jī)體的抗氧化酶活性和抗氧化能力，可能對(duì)腎的損傷有一定的保護(hù)作用。

腎是重要的排泄臟器，一般情況下，當(dāng)血漿蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量<4萬(wàn)時(shí)可透過(guò)腎小球?yàn)V過(guò)膜，因此腎小球的濾液中往往含有微量尿蛋白。而在早期腎損傷中，雖然尿常規(guī)檢測(cè)呈陰性，而實(shí)際上尿液中的蛋白質(zhì)含量已經(jīng)開(kāi)始升高[9]，臧芝棟等[10]研究證實(shí)，腎早期損傷最顯著臨床指標(biāo)為尿蛋白含量升高。NAG酶是一種高分子糖蛋白，在腎單位近曲小管細(xì)胞內(nèi)含量最豐富。大量研究已證實(shí)[11-12]，NAG酶對(duì)腎小管損傷診斷的敏感性和特異性較高。γ-GT是主要存在于動(dòng)物組織內(nèi)的一種糖蛋白，在腎中的含量最高，且由于相對(duì)分子質(zhì)量較大，難以濾過(guò)腎小球；主要分布于近曲腎小管邊緣，因此尿液中的γ-GT主要是由腎小球上皮細(xì)胞分泌產(chǎn)生的。周永忠等[13]報(bào)道顯示，腎病綜合征、腎小球腎炎患者尿液γ-GT含量顯著高于健康人群。LDH酶廣泛存在于各種生物體中，在臨床上，患急性腎小管壞死、慢性腎盂腎炎、慢性腎小球腎炎等時(shí)，血清中LDH酶均可增高。

血清中Crea的含量反映腎小球的過(guò)濾速率，也就是腎的機(jī)能，當(dāng)腎發(fā)生嚴(yán)重病變時(shí)，Crea排泄受阻，血液中Crea含量升高，其含量越高，腎的功能障礙越大，但只有在腎有嚴(yán)重障礙時(shí)才會(huì)大幅提高，故不能作為早期腎病的指標(biāo)。BUN是腎功能主要指標(biāo)之一，通常腎為排泄尿素的主要器官，尿素從腎小球?yàn)V過(guò)后在各段小管均可重吸收，和血Crea一樣，在腎功能損害早期，血BUN可在正常范圍，而發(fā)生各種腎實(shí)質(zhì)性病變時(shí)，血BUN增高。同時(shí)，在腎功能減退時(shí)，常伴有血清尿酸的增高。

SOD是機(jī)體內(nèi)唯一能特異性清除超氧陰離子自由基的酶類(lèi)，因此測(cè)定SOD的活性可間接反映機(jī)體清除自由基的能力，SOD對(duì)機(jī)體的氧化和抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，此酶能清除超氧陰離子(O2-·)保護(hù)細(xì)胞免受損傷[14]。MDA是生物膜發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化的重要產(chǎn)物之一，反映了體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的氧化程度及細(xì)胞受自由基攻擊的程度，MDA含量越低，表明機(jī)體抗氧化能力越強(qiáng)。

有研究表明，金錢(qián)草黃酮提取物能抑制試驗(yàn)性高草酸尿癥大鼠腎草酸鈣尿晶體的形成[16]，但要進(jìn)一步闡明金錢(qián)草組方對(duì)草酸鈣尿結(jié)石的防治機(jī)制，還需更深入、廣泛的研究。

4 結(jié) 論

灌服該金錢(qián)草組方湯劑，能明顯減輕草酸鈣尿結(jié)石模型試驗(yàn)犬的腎功能損傷指標(biāo)，對(duì)腎損傷有較好的修復(fù)功能；能提高機(jī)體的抗氧化酶活性，減輕機(jī)體的氧化損傷；同時(shí)，該中藥復(fù)方有利尿作用，通過(guò)增加尿量，達(dá)到利尿排石的效果，防止草酸鈣結(jié)石的聚集，從而達(dá)到預(yù)防結(jié)石形成的效果。

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(編輯 白永平)

Effect of Jinqiancao Compound Potion on the Formation of Calcium Oxalate Stones in the Urine of Canine

HE Ding-ling，HU Fang-fang，SU Yong-kang，QIU Xian-shuai，XIAO Xi-yu，PAN Jia-qiang*

(CollegeofVeterinaryMedicine，SouthChinaAgriculturalUniversity，Guangzhou510642，China)

The experiment was designed to preliminary study on the effect of Jinqiancao compound potion to the formation of calcium oxalate stones in the urine of canine.Twelve healthy maleCanisLupusfamiliariswere randomly divided into 3 groups，which were the control group，the model group and the treatment group.The dogs in control group were fed with basal diet.The dogs in model group and treatment group were fed with basal diet plus glycol，ammonium chloride，calcium carbonate and vitamin D.Once 80% of the microscope view appeared calcium oxalate crystals in the urine of the experimental dogs，the Jinqiancao compound potion was orally administrated to the dogs of treatment group.During the experiment，the urine index(including the content of microalbumin，the enzymatic activity of N-acetyl-β-D-Glucosaminidase and γ-glutamyltransferase) and the serum index(including the content of creatinine，blood urea nitrogen，uric acid and malondialdehyde，the enzymatic activity of lactate dehydrogenase and superoxide dismutase) were detected.Results were as follows：compared with model group，by treating Jinqiancao compound potion，the treatment group appeared lower activity of N-acetyl-β-D-Glucosaminidase，lower activity of γ-glutamyltransferase，lower concent of serum uric acid，lower malondialdehyde，lower activity of lactate dehydrogenase and higher activity of serum superoxide dismutase than that of modle group.Our study demonstrates that Jinqiancao compound can effectively reduce the damage to renal during the formation of calcium oxalate calculus，improve the enzyme activity of blood antioxidant.In other words，kidney cells were effectively repaired to ensure the function of kidney by the Jinqiancao compound，which to prevent the formation of calcium oxalate calculus in the urine of canine.

canine；the Jinqiancao compound；function of renal；calcium oxalate calculus；antioxidant effect

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.10.021

2015-01-21

廣東省獸醫(yī)臨床重大疾病綜合防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題(2013A061401013)

何釘玲(1989-)，女，湖南邵陽(yáng)人，碩士生，主要從事臨床內(nèi)科學(xué)方面的研究，E-mail：756424826@qq.com

*通信作者：潘家強(qiáng)，E-mail：panjq@scau.edu.cn

S856.59

A

0366-6964(2015)10-1867-08